Presente *Indirizzo attuale: Colonia 50931, Germania, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
La neurodegenerazione delle malattie mitocondriali è considerata irreversibile perché la plasticità metabolica dei neuroni è limitata, ma l'effetto della disfunzione mitocondriale sull'autonomia cellulare del metabolismo neuronale nell'organismo è poco compreso. In questo articolo, introduciamo il proteoma cellula-specifico dei neuroni di Purkinje con deficit progressivo di OXPHOS causato da un'alterazione della dinamica di fusione mitocondriale. Abbiamo scoperto che la disfunzione mitocondriale ha innescato un profondo cambiamento nel campo della proteomica, che alla fine ha portato all'attivazione sequenziale di precisi programmi metabolici prima della morte cellulare. Inaspettatamente, abbiamo determinato l'evidente induzione della piruvato carbossilasi (PCx) e di altri enzimi anti-invecchiamento che integrano gli intermedi del ciclo del TCA. L'inibizione di PCx ha esacerbato lo stress ossidativo e la neurodegenerazione, indicando che l'aterosclerosi ha un effetto protettivo nei neuroni carenti di OXPHOS. Il ripristino della fusione mitocondriale nei neuroni degenerati in fase terminale inverte completamente queste caratteristiche metaboliche, prevenendo così la morte cellulare. I nostri risultati identificano percorsi precedentemente sconosciuti che conferiscono resilienza alla disfunzione mitocondriale e dimostrano che la neurodegenerazione può essere invertita anche nelle fasi avanzate della malattia.
Il ruolo centrale dei mitocondri nel mantenimento del metabolismo energetico neuronale è sottolineato dai numerosi sintomi neurologici associati alle malattie mitocondriali umane. La maggior parte di queste malattie è causata da mutazioni genetiche che regolano l'espressione genica mitocondriale (1, 2) o dalla distruzione genica correlata alla dinamica mitocondriale, che influenza indirettamente la stabilità del DNA mitocondriale (mtDNA) (3, 4). Studi su modelli animali hanno dimostrato che in risposta alla disfunzione mitocondriale nei tessuti circostanti, possono essere attivate vie metaboliche conservative (5-7), il che fornisce informazioni importanti per una comprensione approfondita della patogenesi di queste complesse malattie. In netto contrasto, la nostra comprensione dei cambiamenti metabolici di specifici tipi cellulari causati dal generale fallimento della produzione di adenosina trifosfato (ATP) mitocondriale cerebrale è fondamentale (8), sottolineando la necessità di identificare bersagli terapeutici che possano essere utilizzati per prevenire o prevenire la malattia. Prevenire la neurodegenerazione (9). La mancanza di informazioni è dovuta al fatto che le cellule nervose sono ampiamente considerate dotate di una flessibilità metabolica molto limitata rispetto alle tipologie cellulari dei tessuti circostanti (10). Dato che queste cellule svolgono un ruolo centrale nel coordinamento dell'apporto di metaboliti ai neuroni per promuovere la trasmissione sinaptica e rispondere a lesioni e condizioni patologiche, la capacità di adattare il metabolismo cellulare alle difficili condizioni del tessuto cerebrale è pressoché limitata alle cellule gliali (11-14). Inoltre, l'eterogeneità cellulare intrinseca del tessuto cerebrale ostacola ampiamente lo studio dei cambiamenti metabolici che si verificano in specifici sottogruppi neuronali. Di conseguenza, si sa poco sulle esatte conseguenze cellulari e metaboliche della disfunzione mitocondriale nei neuroni.
Per comprendere le conseguenze metaboliche della disfunzione mitocondriale, abbiamo isolato neuroni di Purkinje (PN) in diversi stadi di neurodegenerazione causata dalla distruzione della membrana mitocondriale esterna di fusione (Mfn2). Sebbene le mutazioni di Mfn2 negli esseri umani siano associate a una forma di neuropatia sensitivo-motoria ereditaria nota come Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A (15), la distruzione condizionale di Mfn2 nei topi è un metodo ben noto di induzione della disfunzione della fosforilazione ossidativa (OXPHOS). I vari sottotipi neuronali (16-19) e il fenotipo neurodegenerativo risultante sono accompagnati da sintomi neurologici progressivi, come disturbi del movimento (18, 19) o atassia cerebellare (16). Utilizzando una combinazione di proteomica quantitativa senza etichetta (LFQ), metabolomica, imaging e metodi virologici, dimostriamo che la neurodegenerazione progressiva induce fortemente la piruvato carbossilasi (PCx) e altri fattori coinvolti nell'arteriosclerosi dei PN in vivo. L'espressione degli enzimi. Per verificare la rilevanza di questo risultato, abbiamo specificamente down-regolato l'espressione di PCx nei PN con deficit di Mfn2 e abbiamo scoperto che questa operazione aggravava lo stress ossidativo e accelerava la neurodegenerazione, dimostrando così che l'azoospermia conferisce morte cellulare Adattabilità metabolica. Una grave espressione di MFN2 può ripristinare completamente la degenerazione terminale del PN con grave deficit di OXPHOS, massiccio consumo di DNA mitocondriale e rete mitocondriale apparentemente interrotta, il che sottolinea ulteriormente che questa forma di neurodegenerazione può persino recuperare nella fase avanzata della malattia prima della morte cellulare.
Per visualizzare i mitocondri nei neuroni neuronali knockout per Mfn2, abbiamo utilizzato un ceppo di topi che consente ai mitocondri dipendenti da Cre di influenzare l'espressione della proteina fluorescente gialla (YFP) (mtYFP) (20) Cre e abbiamo controllato la morfologia mitocondriale in vivo. Abbiamo scoperto che la distruzione del gene Mfn2 nei neuroni neuronali porterebbe alla graduale divisione della rete mitocondriale (Figura S1A) e il cambiamento più precoce è stato riscontrato a 3 settimane di età. Al contrario, la sostanziale degenerazione dello strato cellulare dei neuroni neuronali, come evidenziato dalla perdita dell'immunocolorazione per la calbindina, non è iniziata fino alle 12 settimane di età (Figura 1, A e B). La discrepanza temporale tra i primi cambiamenti nella morfologia mitocondriale e l'inizio visibile della morte neuronale ci ha spinto a studiare i cambiamenti metabolici innescati dalla disfunzione mitocondriale prima della morte cellulare. Abbiamo sviluppato una strategia basata sul sorting cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per isolare i PN esprimenti YFP (YFP+) (Figura 1C) e nei topi di controllo (Mfn2+ / loxP:: mtYFP loxP-stop-loxP:: L7-cre), di seguito denominati CTRL (Figura S1B). L'ottimizzazione della strategia di gating basata sull'intensità relativa del segnale YFP ci consente di purificare il corpo YFP+ (YFPhigh) dei PN dai non-PN (YFPneg) (Figura S1B) o da presunti frammenti assonali/dendritici fluorescenti (YFPlow; Figura S1D, a sinistra), confermati dal microscopio confocale (Figura S1D, a destra). Per verificare l'identità della popolazione classificata, abbiamo condotto una proteomica LFQ e successivamente un'analisi delle componenti principali, riscontrando una netta separazione tra le cellule YFPhigh e YFPneg (Figura S1C). Le cellule YFPhigh hanno mostrato un arricchimento netto di marcatori PN noti (ad esempio Calb1, Pcp2, Grid2 e Itpr3) (21, 22), ma nessun arricchimento di proteine ​​comunemente espresse nei neuroni o in altri tipi cellulari (Figura 1D). Un confronto tra campioni di cellule YFPhigh classificate raccolte in esperimenti indipendenti ha mostrato un coefficiente di correlazione > 0,9, dimostrando una buona riproducibilità tra repliche biologiche (Figura S1E). In sintesi, questi dati hanno convalidato il nostro piano per l'isolamento acuto e specifico di PN fattibile. Poiché il sistema driver L7-cre utilizzato induce la ricombinazione a mosaico nella prima settimana dopo il parto (23), abbiamo iniziato a selezionare i topi dai neuroni CTRL e condizionali (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). Dopo il completamento della ricombinazione, viene chiamato Mfn2cKO a 4 settimane di età. Come punto finale, abbiamo scelto 8 settimane di età, quando lo strato PN era intatto nonostante l'evidente frammentazione mitocondriale (Figura 1B e Figura S1A). In totale, abbiamo quantificato un totale di 3013 proteine, di cui circa il 22% si basava su annotazioni MitoCarta 2.0 basate sul proteoma mitocondriale come mitocondri (Figura 1E) (Figura 1E) (24). L'analisi dell'espressione genica differenziale eseguita all'ottava settimana ha mostrato che solo il 10,5% di tutte le proteine ​​presentava cambiamenti significativi (Figura 1F e Figura S1F), di cui 195 proteine ​​erano sottoregolate e 120 proteine ​​erano sovraregolate (Figura 1F). Vale la pena notare che l'"analisi del pathway innovativo" di questo set di dati mostra che i geni differenzialmente espressi appartengono principalmente a un insieme ristretto di specifici pathway metabolici (Figura 1G). È interessante notare che, sebbene la downregulation dei percorsi correlati a OXPHOS e alla segnalazione del calcio confermi l'induzione della disfunzione mitocondriale nei PN con deficit di fusione, altre categorie che coinvolgono principalmente il metabolismo degli amminoacidi sono significativamente sovraregolate, il che è in linea con il metabolismo che si verifica nei PN mitocondriali. Il ricollegamento è coerente. disfunzione.
(A) Fotografie confocali rappresentative di sezioni cerebellari di topi CTRL e Mfn2cKO che mostrano una progressiva perdita di PN (calbindina, grigio); i nuclei sono stati controcolorati con DAPI. (B) Quantificazione di (A) (analisi della varianza unidirezionale, ***P<0,001; n = da 4 a 6 cerchi da tre topi). (C) Flusso di lavoro sperimentale. (D) Distribuzione della mappa termica dei marcatori specifici di Purkinje (in alto) e di altri tipi cellulari (al centro). (E) Diagramma di Venn che mostra il numero di proteine ​​mitocondriali identificate nel PN classificato. (F) Grafico a vulcano delle proteine ​​differenzialmente espresse nei neuroni Mfn2cKO a 8 settimane (valore di cut-off di significatività di 1,3). (G) L'analisi del percorso della creatività mostra i cinque percorsi di up-regulation (rosso) e down-regulation (blu) più importanti nel PN Mfn2cKO classificato a 8 settimane. È mostrato il livello medio di espressione di ciascuna proteina rilevata. Mappa termica in scala di grigi: valore P aggiustato. ns, non importante.
I dati proteomici hanno mostrato che l'espressione proteica dei complessi I, III e IV è gradualmente diminuita. I complessi I, III e IV contenevano tutti subunità essenziali codificate dal mtDNA, mentre il complesso II, che era codificato solo a livello nucleare, è rimasto sostanzialmente inalterato (Figura 2A e Figura S2A). In linea con i risultati proteomici, l'immunoistochimica delle sezioni di tessuto cerebellare ha mostrato che il livello della subunità MTCO1 (subunità 1 della citocromo C ossidasi mitocondriale) del complesso IV nella PN è gradualmente diminuito (Figura 2B). La subunità Mtatp8 codificata dal mtDNA è risultata significativamente ridotta (Figura S2A), mentre il livello allo stato stazionario della subunità dell'ATP sintasi codificata a livello nucleare è rimasto invariato, il che è coerente con il noto complesso F1 del sottoinsieme dell'ATP sintasi stabile quando l'espressione del mtDNA è stabile. La formazione è coerente. Interrompere (7). La valutazione del livello di mtDNA nei PN Mfn2cKO selezionati mediante reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR) ha confermato la graduale diminuzione del numero di copie di mtDNA. Rispetto al gruppo di controllo, a 8 settimane di età, solo circa il 20% del livello di mtDNA è stato mantenuto (Figura 2C). In linea con questi risultati, la colorazione con microscopia confocale dei PN Mfn2cKO è stata utilizzata per rilevare il DNA, mostrando il consumo tempo-dipendente di nucleotidi mitocondriali (Figura 2D). Abbiamo scoperto che solo alcuni candidati coinvolti nella degradazione proteica mitocondriale e nella risposta allo stress erano sovraregolati, tra cui Lonp1, Afg3l2 e Clpx, e i fattori di assemblaggio del complesso OXPHOS. Non sono state rilevate variazioni significative nei livelli delle proteine ​​coinvolte nell'apoptosi (Figura S2B). Analogamente, abbiamo scoperto che i canali mitocondriali e del reticolo endoplasmatico coinvolti nel trasporto del calcio presentano solo lievi variazioni (Figura S2C). Inoltre, la valutazione delle proteine ​​correlate all'autofagia non ha rilevato cambiamenti significativi, il che è coerente con l'induzione visibile di autofagosomi osservata in vivo mediante immunoistochimica e microscopia elettronica (Figura S3). Tuttavia, la progressiva disfunzione di OXPHOS nei PN è accompagnata da evidenti cambiamenti mitocondriali ultrastrutturali. Cluster mitocondriali sono visibili nei corpi cellulari e negli alberi dendritici dei PN Mfn2cKO di età compresa tra 5 e 8 settimane, e la struttura della membrana interna ha subito profondi cambiamenti (Figura S4, A e B). Coerentemente con questi cambiamenti ultrastrutturali e una significativa diminuzione del mtDNA, l'analisi di sezioni cerebellari cerebrali acute con estere metilico di tetrametilrodamina (TMRM) ha mostrato che il potenziale di membrana mitocondriale nei PN Mfn2cKO era significativamente ridotto (Figura S4C).
(A) Analisi temporale del livello di espressione del complesso OXPHOS. Considerare solo le proteine ​​con P < 0,05 a 8 settimane (ANOVA a due vie). Linea tratteggiata: Nessun aggiustamento rispetto a CTRL. (B) Sinistra: Un esempio di una sezione cerebellare marcata con un anticorpo anti-MTCO1 (barra di scala, 20 μm). L'area occupata dai corpi delle cellule di Purkinje è coperta in giallo. Destra: Quantificazione dei livelli di MTCO1 (analisi della varianza a un fattore; n = 7 a 20 cellule analizzate da tre topi). (C) Analisi qPCR del numero di copie di mtDNA nel PN ordinato (analisi della varianza a un fattore; n = 3 a 7 topi). (D) Sinistra: Un esempio di una sezione cerebellare marcata con un anticorpo anti-DNA (barra di scala, 20 μm). L'area occupata dai corpi delle cellule di Purkinje è coperta in giallo. A destra: Quantificazione delle lesioni del mtDNA (analisi della varianza unidirezionale; n = 5-9 cellule da tre topi). (E) Un esempio di una sezione cerebellare acuta che mostra mitoYFP + cellule di Purkinje (freccia) in una registrazione con patch clamp a cellula intera. (F) Quantificazione della curva IV. (G) Registrazioni rappresentative dell'iniezione di corrente depolarizzante nelle cellule di Purkinje CTRL e Mfn2cKO. Traccia superiore: Il primo impulso che ha attivato l'AP. Traccia inferiore: Frequenza massima dell'AP. (H) Quantificazione degli input spontanei postsinaptici (sPSP). La traccia di registrazione rappresentativa e il suo rapporto di zoom sono mostrati in (I). L'analisi della varianza unidirezionale ha analizzato n = 5-20 cellule da tre topi. I dati sono espressi come media ± SEM; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Tracce rappresentative di AP spontaneo registrato utilizzando la modalità patch clamp perforata. Traccia superiore: Frequenza massima dell'AP. Traccia in basso: zoom di un singolo AP. (K) Quantificare la frequenza media e massima degli AP secondo (J). Test di Mann-Whitney; n = 5 cellule sono state analizzate da quattro topi. I dati sono espressi come media ± SEM; non importante.
Un danno evidente a OXPHOS è stato rilevato nel neurone neuronale Mfn2cKO di 8 settimane, indicando che la funzione fisiologica dei neuroni è gravemente anormale. Pertanto, abbiamo analizzato le caratteristiche elettriche passive dei neuroni con deficit di OXPHOS a 4-5 settimane e a 7-8 settimane eseguendo registrazioni di patch clamp a cellule intere in sezioni cerebellari acute (Figura 2E). Inaspettatamente, il potenziale di membrana a riposo medio e la resistenza di ingresso dei neuroni Mfn2cKO erano simili al controllo, sebbene vi fossero sottili differenze tra le cellule (Tabella 1). Analogamente, a 4-5 settimane di età, non sono state riscontrate variazioni significative nella relazione corrente-voltaggio (curva IV) (Figura 2F). Tuttavia, nessun neurone Mfn2cKO di 7-8 settimane è sopravvissuto al regime IV (fase di iperpolarizzazione), indicando che esiste una chiara sensibilità al potenziale di iperpolarizzazione in questa fase avanzata. Al contrario, nei neuroni Mfn2cKO, le correnti depolarizzanti che causano scariche di potenziale d'azione ripetitivo (AP) sono ben tollerate, indicando che i loro modelli di scarica complessivi non sono significativamente diversi da quelli dei neuroni di controllo di 8 settimane (Tabella 1 e Figura 2G). Analogamente, la frequenza e l'ampiezza delle correnti postsinaptiche spontanee (sPSC) erano paragonabili a quelle del gruppo di controllo e la frequenza degli eventi è aumentata da 4 a 5 settimane a 7 settimane a 8 settimane con un incremento simile (Figura 2, H e I). Il periodo di maturazione sinaptica nei neuroni parenchimali (25). Risultati simili sono stati ottenuti dopo patch di neuroni parenchimali perforati. Questa configurazione impedisce la possibile compensazione dei difetti cellulari di ATP, come potrebbe accadere nella registrazione di patch clamp a cellula intera. In particolare, il potenziale di membrana a riposo e la frequenza di scarica spontanea dei neuroni Mfn2cKO non sono stati influenzati (Figura 2, J e K). In sintesi, questi risultati indicano che i neurologi parossistici con evidente disfunzione OXPHOS riescono a gestire bene i modelli di scarica ad alta frequenza, il che indica che esiste un meccanismo di compensazione che consente loro di mantenere risposte elettrofisiologiche quasi normali.
I dati sono espressi come media ± SEM (analisi della varianza a un fattore, test di confronto multiplo di Holm-Sidak; *P<0,05). Il numero dell'unità è indicato tra parentesi.
Abbiamo deciso di indagare se una categoria nel set di dati proteomici (Figura 1G) includa percorsi in grado di contrastare una grave carenza di OXPHOS, spiegando così perché la PN interessata può mantenere un'elettrofisiologia quasi normale (Figura 2, da E a K). L'analisi proteomica ha mostrato che gli enzimi coinvolti nel catabolismo degli aminoacidi a catena ramificata (BCAA) erano significativamente sovraregolati (Figura 3A e Figura S5A) e il prodotto finale acetil-CoA (CoA) o succinil CoA può integrare i tricarbossilati nel ciclo dell'acido arteriosclerotico (TCA). Abbiamo scoperto che il contenuto di BCAA transaminasi 1 (BCAT1) e BCAT2 è aumentato. Catalizzano il primo passaggio del catabolismo dei BCAA generando glutammato dall'α-chetoglutarato (26). Tutte le subunità che compongono il complesso della chetoacido deidrogenasi a catena ramificata (BCKD) sono sovraregolate (il complesso catalizza la successiva e irreversibile decarbossilazione dello scheletro carbonioso dei BCAA risultante) (Figura 3A e Figura S5A). Tuttavia, non sono state riscontrate alterazioni evidenti nei BCAA stessi nei PN selezionati, il che potrebbe essere dovuto all'aumentato assorbimento cellulare di questi aminoacidi essenziali o all'uso di altre fonti (glucosio o acido lattico) per integrare il ciclo dei TCA (Figura S5B). I PN privi di OXPHOS hanno anche mostrato un aumento delle attività di decomposizione e transaminazione della glutammina a 8 settimane di età, che può essere riflesso dalla sovraregolazione degli enzimi mitocondriali glutaminasi (GLS) e glutammina piruvato transaminasi 2 (GPT2) (Figura 3, A e C). Vale la pena notare che la regolazione positiva del GLS è limitata all'isoforma glutaminasi C spliced ​​(GLS-GAC) (la variazione di Mfn2cKO/CTRL è di circa 4,5 volte, P = 0,05) e la sua regolazione positiva specifica nei tessuti cancerosi può supportare la bioenergia mitocondriale. (27).
(A) La mappa termica mostra la variazione del livello proteico per la via specificata a 8 settimane. (B) Esempio di una fetta cerebellare marcata con anticorpo anti-PCx (scala, 20 μm). La freccia gialla indica il corpo cellulare del Purkinje. (C) Analisi dell'espressione proteica nel tempo identificata come un importante candidato per l'aterosclerosi (test t multiplo, *FDR <5%; n = 3-5 topi). (D) Sopra: Un diagramma schematico che mostra i diversi modi di ingresso del carbonio marcato contenuto nel tracciante [1-13C]piruvato (ovvero, tramite PDH o via trans-arteriosa). In basso: Il grafico a violino mostra la percentuale di carbonio marcato singolarmente (M1) convertito in acido aspartico, acido citrico e acido malico dopo la marcatura di fette cerebellari acute con [1-13C]piruvato (test t appaiato; ** P <0,01). (E) Analisi completa della cronologia del percorso indicato. Considerare solo le proteine ​​con P < 0,05 a 8 settimane. Linea tratteggiata: nessun valore di aggiustamento (analisi della varianza a due vie; * P < 0,05; *** P < 0,001). I dati sono espressi come media ± SEM.
Nella nostra analisi, il catabolismo dei BCAA è diventato uno dei principali meccanismi di up-regulation. Questo fatto suggerisce fortemente che il volume di ventilazione che entra nel ciclo dei TCA possa essere modificato nella PN carente di OXPHOS. Ciò potrebbe rappresentare una forma importante di riorganizzazione metabolica neuronale, che potrebbe avere un impatto diretto sulla fisiologia neuronale e sulla sopravvivenza durante il mantenimento di una grave disfunzione di OXPHOS. In linea con questa ipotesi, abbiamo scoperto che il principale enzima antiaterosclerotico PCx è up-regolato (Mfn2cKO/CTRL varia di circa 1,5 volte; Figura 3A), che catalizza la conversione del piruvato in ossalacetato (28), che si ritiene sia presente nel tessuto cerebrale. L'espressione è limitata agli astrociti (29, 30). In linea con i risultati della proteomica, la microscopia confocale ha mostrato che l'espressione di PCx era specificamente e significativamente aumentata nei neuroni neuronali con deficit di OXPHOS, mentre la reattività di PCx era principalmente limitata alle cellule gliali di Bergmann adiacenti del controllo (Figura 3B). Per testare funzionalmente l'aumento di PCx osservato, abbiamo trattato fette cerebellari acute con il tracciante [1-13C]piruvato. Quando il piruvato veniva ossidato dalla piruvato deidrogenasi (PDH), il suo marcatore isotopico scompariva, ma viene incorporato negli intermedi del ciclo del TCA quando il piruvato viene metabolizzato dalle reazioni vascolari (Figura 3D). A supporto dei nostri dati proteomici, abbiamo osservato un gran numero di marcatori di questo tracciante nell'acido aspartico delle fette Mfn2cKO, mentre anche l'acido citrico e l'acido malico presentavano un andamento moderato, sebbene non significativo (Figura 3D).
Nei neuroni dopaminergici dei topi MitoPark con disfunzione mitocondriale causata da neuroni dopaminergici che distruggono specificamente il gene del fattore di trascrizione mitocondriale A (Tfam) (Figura S6B), l'espressione di PCx è stata anche significativamente aumentata (31), indicando che l'arteriosclerosi da acetone acido. L'insorgenza della malattia è regolata durante la disfunzione dell'OXPHOS neuronale nel corpo. Vale la pena notare che è stato scoperto che enzimi unici (32-34) che possono essere espressi nei neuroni che possono essere associati all'arteriosclerosi sono significativamente aumentati nei PN privi di OXPHOS, come la propionil-CoA carbossilasi (PCC-A), il malonil-CoA converte il propionil-CoA in succinil-CoA e l'enzima malico mitocondriale 3 (ME3), il cui ruolo principale è quello di recuperare il piruvato dal malato (Figura 3, A e C) (33, 35). Inoltre, abbiamo riscontrato un aumento significativo dell'enzima Pdk3, che fosforila e quindi inattiva la PDH (36), mentre non sono state rilevate modifiche nell'enzima Pdp1 che attiva la PDH o nel complesso enzimatico PDH stesso (Figura 3A). Coerentemente, nei PN Mern2cKO, la fosforilazione della subunità α1 (PDHE1α) della componente E1 della piruvato deidrogenasi del complesso PDH in Ser293 (nota per inibire l'attività enzimatica della PDH) è stata aumentata (Figura S6C) (Figura S6C). Il piruvato non ha accesso vascolare.
Infine, abbiamo scoperto che il super pathway della biosintesi di serina e glicina, il correlato ciclo mitocondriale del folato (1C) e la biosintesi della prolina (Figura 1G e Figura S5C) sono tutti significativamente sovraregolati, secondo i report, durante il processo di attivazione. I tessuti circostanti vengono attivati ​​con disfunzione mitocondriale (5-7). L'analisi confocale a supporto di questi dati proteomici ha mostrato che in PN con OXPHOS mancante, fette cerebellari di topi di 8 settimane di età sono state sottoposte a serina idrossimetiltransferasi 2 (SHMT2), un enzima chiave del ciclo mitocondriale del folato. Risposta immunitaria significativa (Figura S5D). In 13 fette cerebellari acute incubate con CU-glucosio, esperimenti di tracciamento metabolico hanno ulteriormente confermato la sovraregolazione della biosintesi di serina e prolina, indicando che il flusso di isoforme di carbonio in serina e prolina è aumentato (Figura S5E). Poiché le reazioni promosse da GLS e GPT2 sono responsabili della sintesi del glutammato dalla glutammina e della transaminazione tra glutammato e α-chetoglutarato, la loro sovraregolazione indica che i neuroni carenti di OXPHOS hanno una maggiore richiesta di glutammato. Questo potrebbe essere finalizzato a mantenere l'aumentata biosintesi della prolina (Figura S5C). In contrasto con questi cambiamenti, un'analisi proteomica degli astrociti cerebellari di topi Mfn2cKO specifici per PN ha mostrato che questi percorsi (incluse tutte le antiperossidasi) non hanno subito cambiamenti significativi nell'espressione, dimostrando così che questa ridirezione metabolica è selettiva per PN degradato (Fig. S6, da D a G).
In sintesi, queste analisi hanno rivelato modelli significativamente diversi di attivazione temporale di specifiche vie metaboliche nei neuroni neuronali. Sebbene una funzione mitocondriale neuronale anomala possa portare ad aterosclerosi precoce e rimodellamento del gene 1C (Figura 3E e Figura S5C), e persino a cambiamenti prevedibili nell'espressione dei complessi I e IV, i cambiamenti nella sintesi de novo della serina sono evidenti solo nelle fasi avanzate. Disfunzione di OXPHOS (Figura 3E e Figura S5C). Questi risultati definiscono un processo sequenziale in cui la risposta mitocondriale (ciclo 1C) e citoplasmatica (biosintesi della serina) indotta dallo stress risponde sinergicamente all'aumento dell'aterosclerosi nel ciclo TCA per rimodellare il metabolismo neuronale.
I neuroni neuronali con deficit di OXPHOS di 8 settimane possono mantenere l'attività di eccitazione ad alta frequenza e subire una significativa riconnessione metabolica per compensare la disfunzione mitocondriale. Questa scoperta solleva un'interessante possibilità: anche in questo momento, queste cellule potrebbero anche ricevere un intervento terapeutico per ritardare o prevenire la neurodegenerazione. In ritardo. Abbiamo risolto questa possibilità attraverso due interventi indipendenti. Nel primo metodo, abbiamo progettato un vettore virale adeno-associato (AAV) dipendente da Cre in modo che MFN2 possa essere espresso selettivamente nei neuroni neuronali con deficit di OXPHOS in vivo (Figura S7A). L'AAV che codifica per MFN2 e il gene reporter fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) sono stati verificati in colture primarie di neuroni in vitro, il che ha causato l'espressione di MFN2 in modo dipendente da Cre e ha ripristinato la morfologia mitocondriale, prevenendo così la neuromutazione nei neuroni Mfn2cKO (Figure S7, B, D ed E). Successivamente, abbiamo condotto esperimenti in vivo per somministrare stereotassicamente Mfn2-AAV di 8 settimane alla corteccia cerebellare di topi Mfn2cKO e di controllo, e abbiamo analizzato topi di 12 settimane (Figura 4A). I ​​topi Mfn2cKO trattati sono morti (Figura 1, A e B) (16). La trasduzione virale in vivo ha portato all'espressione selettiva di PN in alcuni circoli cerebellari (Figura S7, G e H). L'iniezione dell'AAV di controllo che esprimeva solo mCherry (Ctrl-AAV) non ha avuto effetti significativi sul grado di neurodegenerazione negli animali Mfn2cKO. Al contrario, l'analisi dei topi Mfn2cKO trasdotti con Mfn2-AAV ha mostrato un significativo effetto protettivo dello strato cellulare PN (Figura 4, B e C). In particolare, la densità neuronale sembra essere quasi indistinguibile da quella degli animali di controllo (Figura 4, B e C, e Figura S7, H e I). L'espressione di MFN1, ma non di MFN2, è ugualmente efficace nel prevenire la morte neuronale (Figura 4C e Figura S7, C e F), il che indica che l'espressione di MFN1 ectopica può efficacemente compensare la carenza di MFN2. Ulteriori analisi a livello del singolo neurone neuronale hanno mostrato che Mfn2-AAV ha ampiamente ripristinato l'ultrastruttura dei mitocondri, normalizzato i livelli di mtDNA e invertito l'elevata espressione del marcatore anti-angiogenesi PCx (Figura 4, da C a E). L'ispezione visiva dei topi Mfn2cKO recuperati in stato di riposo ha mostrato un miglioramento della postura e dei sintomi motori (movimento da S1 a S3). In conclusione, questi esperimenti dimostrano che la reintroduzione ritardata di MFN2 nei neuroni neuronali neuronali gravemente carenti di OXPHOS è sufficiente a invertire il consumo di mtDNA e indurre l'aterosclerosi, prevenendo così la degenerazione assonale e la morte neuronale in vivo.
(A) Uno schema che mostra il programma sperimentale per l'iniezione di AAV che codifica per MFN2 quando il percorso metabolico indicato è attivato. (B) Immagini confocali rappresentative di fette cerebellari di 12 settimane trasdotte a 8 settimane in topi Mfn2cKO e marcate con anticorpi anti-calbindina. Destra: Scala delle fibre assonali. La scala dello zoom assonale è 450 e 75 μm. (C) Sinistra: Quantificazione della densità delle cellule di Purkinje nel loop di trasduzione dell'AAV (AAV+) (analisi della varianza unidirezionale; n = 3 topi). Destra: analisi del focus del mtDNA nel PN trasdotto alla settimana 12 (t-test non appaiato; n = 6 cellule da tre topi). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Micrografie elettroniche a trasmissione rappresentative di PN di sezioni cerebellari di Mfn2cKO trasdotte con i vettori virali indicati. La maschera rosa illustra l'area occupata dai dendriti, mentre il quadrato tratteggiato giallo illustra lo zoom fornito a destra; n rappresenta il nucleo. Barra di scala, 1 μm. (E) mostra un esempio di colorazione PCx in PN trasdotta a 12 settimane. Barra di scala, 20 μm. OE, sovraespressione; FC, variazione di fold.
Infine, abbiamo studiato l'importanza della sopravvivenza cellulare indotta dalla perossidasi nei PN che hanno manifestato disfunzione OXPHOS. Abbiamo generato mCherry codificante AAV-shRNA (short hairpin RNA) specificamente mirato all'mRNA di PCx del topo (AAV-shPCx) e iniettato il virus o il suo controllo codificato (AAV-scr) nel cervelletto di topi Mfn2cKO. L'iniezione è stata eseguita alla quarta settimana di età (Figura 5A) per ottenere un efficace abbattimento di PCx durante il periodo in cui l'espressione di PCx aumentava (Figura 3C) e lo strato cellulare del PN era ancora intatto (Figura 1A). È importante notare che l'abbattimento di PCx (Figura S8A) porta a una significativa accelerazione della morte del PN, che è limitata all'anello infetto (Figura 5, B e C). Per comprendere il meccanismo degli effetti metabolici indotti dall'aumento della regolazione di PCx, abbiamo studiato lo stato redox dei PN dopo l'abbattimento di PCx e l'espressione simultanea del biosensore ottico mediato da AAV Grx1-roGFP2 (Figura S8, da B a D) per valutare il cambiamento relativo del potenziale redox del peptide (38). Quindi, abbiamo eseguito la microscopia a fluorescenza a due fotoni (FLIM) in fette di cervello acuto di Mfn2cKO di 7 settimane o di compagni di cucciolata di controllo per rilevare potenziali cambiamenti nello stato redox citoplasmatico dopo aver verificato le condizioni FLIM (Figura S8, da E a G). L'analisi ha mostrato un aumento significativo dello stato di ossidazione di un singolo PN Mfn2cKO privo di espressione di PCx, che è diverso dai neuroni di controllo o dai PN Mfn2cKO che esprimono solo shRNA scrambled (Figura 5, D ed E). Quando l'espressione di PCx è stata sottoregolata, la percentuale di PN Mfn2cKO che mostravano uno stato altamente ossidato è aumentata di oltre tre volte (Figura 5E), indicando che la sovraregolazione di PCx ha mantenuto la capacità redox dei neuroni degenerati.
(A) Uno schema che mostra il programma sperimentale per l'iniezione di AAV che codifica per shPCx quando il percorso metabolico indicato è attivato. (B) Fotografie confocali rappresentative di sezioni cerebellari di 8 settimane di età in topi Mfn2cKO trasdotte e marcate con anticorpi anti-calcineurina a 4 settimane. Barra di scala, 450 μm. (C) Quantificazione della densità delle cellule di Purkinje in loop trasdotti con AAV (analisi della varianza unidirezionale; n = 3-4 topi). I dati sono espressi come media ± SEM; ***P < 0,001. (D) L'immagine FLIM rappresentativa mostra la durata media della vita di PN di 7 settimane che esprime il sensore redox del glutatione Grx1-roGFP2 nelle condizioni sperimentali specificate. Rapporto LUT (look-up table): intervallo di tempo di sopravvivenza (in picosecondi). Barra di scala, 25 μm. (E) L'istogramma mostra la distribuzione dei valori di durata della vita di Grx1-roGFP2 da (D) (n=da 158 a 368 cellule in due topi in ciascuna condizione). Il grafico a torta sopra ogni istogramma mostra il numero di cellule con valori di durata della vita significativamente più lunghi (rosso, ossidato) o più brevi (blu, ridotto), che superano 1 deviazione standard del valore medio della durata della vita in CTRL-AAV-scr. (F) Il modello proposto mostra l'effetto protettivo della sovraregolazione del PCx neuronale.
Nel complesso, i dati che forniamo qui mostrano che la riespressione di MFN2 può ripristinare completamente la neurodegenerazione avanzata con grave deficit di OXPHOS, grave deplezione del mtDNA e morfologia ista-simile estremamente anomala, garantendo così un progresso continuo anche nelle malattie avanzate. La neurodegenerazione fornisce prove reversibili dello stadio precedente alla morte cellulare. Questo grado di flessibilità metabolica è ulteriormente enfatizzato dalla capacità dei neuroni di indurre aterosclerosi (una riorganizzazione del ciclo del TCA), che inibisce l'espressione di PCx nelle neurodegenerazioni carenti di OXPHOS e favorisce la morte cellulare, svolgendo così un ruolo protettivo (Figura 5F).
In questo studio, abbiamo dimostrato che la risposta dei neuroni neuronali alla disfunzione di OXPHOS è quella di convergere gradualmente verso l'aterosclerosi del ciclo TCA attraverso la via di attivazione differenziale attivata dai programmi metabolici. Abbiamo confermato l'analisi proteomica con molti metodi complementari e rivelato che, quando sottoposti a grave disfunzione mitocondriale, i neuroni presentano una forma di elasticità metabolica precedentemente sconosciuta. Con nostra sorpresa, l'intero processo di riorganizzazione non segna necessariamente lo stato metabolico terminale che accompagna la neurodegenerazione in modo graduale e irreversibile, ma i nostri dati suggeriscono che possa costituire un neurone di mantenimento anche nella fase precedente alla morte cellulare. Questo risultato indica che i neuroni presentano un notevole grado di plasticità metabolica nell'organismo. Questo fatto dimostra che la successiva reintroduzione di MFN2 può invertire l'espressione di marcatori metabolici chiave e prevenire la degenerazione dei neuroni neuronali. Al contrario, inibisce l'aterosclerosi e accelera la risposta dei nervi transessuali.
Una delle scoperte più affascinanti della nostra ricerca è che i neuroni neuronali privi di OXPHOS possono modificare il metabolismo del ciclo TCA regolando positivamente gli enzimi che stimolano specificamente l'arteriosclerosi. Il riarrangiamento metabolico è una caratteristica comune delle cellule tumorali, alcune delle quali si affidano alla glutammina per integrare gli intermedi del ciclo TCA per produrre equivalenti riducenti, che guidano la catena respiratoria e mantengono la produzione di precursori della biosintesi di lipidi e nucleotidi (39, 40). Uno studio recente ha dimostrato che nei tessuti periferici con disfunzione di OXPHOS, anche la riconnessione del metabolismo glutammina/glutammato è una caratteristica importante (5, 41), dove la direzione dell'ingresso della glutammina nel ciclo TCA dipende dalla gravità del danno da OXPHOS (41). Tuttavia, mancano prove chiare su una possibile somiglianza della plasticità metabolica neuronale nell'organismo e sulla sua possibile rilevanza nel contesto della malattia. In un recente studio in vitro, è stato dimostrato che i neuroni corticali primari mobilitano i pool di glutammato per la neurotrasmissione, promuovendo così il metabolismo ossidativo e l'aterosclerosi in condizioni di stress metabolico (42). Vale la pena notare che, sotto l'inibizione farmacologica dell'enzima del ciclo dei TCA, la succinato deidrogenasi, si ritiene che la carbossilazione del piruvato mantenga la sintesi di ossalacetato nei neuroni granulari cerebellari coltivati ​​(34). Tuttavia, la rilevanza fisiologica di questi meccanismi per il tessuto cerebrale (dove si ritiene che l'aterosclerosi sia principalmente confinata agli astrociti) ha ancora un importante significato fisiologico (43). In questo caso, i nostri dati mostrano che i neuroni neuronali danneggiati dall'OXPHOS nell'organismo possono essere convertiti alla degradazione dei BCAA e alla carbossilazione del piruvato, che sono le due principali fonti di integrazione degli intermedi del pool di TCA. Sebbene sia stato proposto il presunto contributo del catabolismo dei BCAA al metabolismo energetico neuronale, oltre al ruolo del glutammato e del GABA nella neurotrasmissione (44), non vi sono ancora prove di questi meccanismi in vivo. Pertanto, è facile ipotizzare che i neuroni disfunzionali possano compensare automaticamente il consumo di intermedi del TCA indotto dal processo di assimilazione aumentando l'aterosclerosi. In particolare, la sovraregolazione di PCx potrebbe essere necessaria per mantenere una maggiore richiesta di acido aspartico, come suggerito nelle cellule proliferanti con disfunzione mitocondriale (45). Tuttavia, la nostra analisi metabolomica non ha rivelato cambiamenti significativi nel livello di acido aspartico allo stato stazionario nei neuroni Mfn2cKO (Figura S6A), il che presumibilmente riflette il diverso utilizzo metabolico dell'acido aspartico tra cellule proliferanti e neuroni post-mitotici. Sebbene l'esatto meccanismo di sovraregolazione di PCx nei neuroni disfunzionali in vivo debba ancora essere caratterizzato, abbiamo dimostrato che questa risposta prematura svolge un ruolo importante nel mantenimento dello stato redox dei neuroni, come dimostrato in esperimenti FLIM su sezioni cerebellari. In particolare, impedire ai neuroni neuronali di sovraregolare PCx può portare a uno stato più ossidato e accelerare la morte cellulare. L'attivazione della degradazione dei BCAA e la carbossilazione del piruvato non sono modi per caratterizzare i tessuti periferici della disfunzione mitocondriale (7). Pertanto, sembrano essere una caratteristica prioritaria dei neuroni con deficit di OXPHOS, anche se non l'unica caratteristica, importante per la neurodegenerazione.
La malattia cerebellare è un tipo eterogeneo di malattia neurodegenerativa che si manifesta solitamente come atassia e spesso danneggia i neuroni cerebellari (PNPH) (46). Questa popolazione di neuroni è particolarmente vulnerabile alla disfunzione mitocondriale perché la loro degenerazione selettiva nei topi è sufficiente a riprodurre molti dei sintomi motori che caratterizzano l'atassia spinocerebellare umana (16, 47, 48). Secondo alcuni studi, un modello murino transgenico con un gene mutante è associato ad atassia spinocerebellare umana e presenta disfunzione mitocondriale (49, 50), sottolineando l'importanza di studiare le conseguenze della carenza di OXPHOS nella PNPH. Pertanto, è particolarmente adatto isolare e studiare efficacemente questa popolazione di neuroni unica. Tuttavia, dato che i neuroni cerebellari sono molto sensibili alla pressione e rappresentano una bassa percentuale dell'intera popolazione cellulare cerebellare, per molti studi basati su tecniche omiche, la loro separazione selettiva come cellule intere è ancora un aspetto impegnativo. Sebbene sia quasi impossibile ottenere l'assoluta assenza di contaminazione di altri tipi cellulari (in particolare tessuti adulti), abbiamo combinato un efficace passaggio di dissociazione con FACS per ottenere un numero sufficiente di neuroni vitali per l'analisi proteomica a valle e ottenere una copertura proteica piuttosto elevata (circa 3000 proteine) rispetto al set di dati esistente dell'intero cervelletto (51). Preservando la vitalità delle cellule intere, il metodo che forniamo qui ci consente non solo di verificare i cambiamenti nei percorsi metabolici nei mitocondri, ma anche di verificare i cambiamenti nelle sue controparti citoplasmatiche, che integra l'uso di tag di membrana mitocondriale per arricchire il tipo di cellula Il nuovo metodo per il numero di mitocondri nei tessuti complessi (52, 53). Il metodo che descriviamo non è solo correlato allo studio delle cellule di Purkinje, ma può essere facilmente applicato a qualsiasi tipo di cellula per affrontare i cambiamenti metabolici nei cervelli malati, inclusi altri modelli di disfunzione mitocondriale.
Infine, abbiamo identificato una finestra terapeutica durante questo processo di riarrangiamento metabolico che può invertire completamente i principali segni di stress cellulare e prevenire la degenerazione neuronale. Pertanto, comprendere le implicazioni funzionali del riarrangiamento qui descritto può fornire spunti fondamentali su possibili trattamenti per il mantenimento della vitalità neuronale durante la disfunzione mitocondriale. Sono necessarie future ricerche volte a sezionare i cambiamenti nel metabolismo energetico in altri tipi di cellule cerebrali per svelare appieno l'applicabilità di questo principio ad altre malattie neurologiche.
I topi MitoPark sono stati descritti in precedenza (31). Topi C57BL/6N con geni Mfn2 fiancheggianti loxP sono stati descritti in precedenza (18) e incrociati con topi L7-Cre (23). La progenie risultante, doppiamente eterozigote, è stata quindi incrociata con topi omozigoti Mfn2loxP/Mfn2loxP per generare knockout genici Purkinje-specifici per Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). In un sottoinsieme di accoppiamenti, l'allele Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) è stato introdotto attraverso incroci aggiuntivi (20). Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida europee, nazionali e istituzionali e approvate dal LandesamtfürNatur per l'ambiente e la protezione dell'ambiente, Renania settentrionale-Vestfalia, Germania. Il lavoro sugli animali segue anche le linee guida della Federazione europea delle associazioni di scienze degli animali da laboratorio.
Dopo l'anestesia della dislocazione cervicale della donna gravida, l'embrione di topo viene isolato (E13). La corteccia è stata dissezionata in soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) addizionata con 10 mM di Hepes e trasferita su terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle's Medium contenente papaina (20 U/ml) e cisteina (1 μg/ml). Incubare il tessuto in DMEM e dissociarlo mediante digestione enzimatica. Ml) a 37 °C per 20 minuti, quindi macinato meccanicamente in DMEM addizionato con siero bovino fetale al 10%. Le cellule sono state seminate su coprioggetto in vetro rivestiti con polilisina a una densità di 2×106 per piastra di coltura da 6 cm o a una densità di 0,5×105 cellule/cm² per l'analisi di imaging. Dopo 4 ore, il terreno è stato sostituito con terreno Neurobasal privo di siero contenente l'1% di supplemento di B27 e 0,5 mM di GlutaMax. I neuroni sono stati quindi mantenuti a 37 °C e al 5% di CO2 per tutta la durata dell'esperimento e alimentati una volta a settimana. Per indurre la ricombinazione in vitro, sono stati utilizzati 3 μl (piastra di coltura a 24 pozzetti) o 0,5 μl (piastra a 24 pozzetti) del seguente vettore virale AAV9 per trattare i neuroni il secondo giorno in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numero di catalogo 105530-AAV9) e AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numero di catalogo 105545-AAV9).
Il DNA complementare di topo Mfn1 e Mfn2 (ottenuto rispettivamente dai plasmidi Addgene n. 23212 e n. 23213) è marcato con la sequenza V5 (GKPIPNPLLGLDST) al C-terminale e si fonde con mCherry in frame attraverso la sequenza T2A. Grx1-roGFP2 è un dono di Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Sostituendo la cassetta tdTomato con metodi di clonazione convenzionali, la cassetta è stata subclonata nello scheletro pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numero di riferimento Addgene 28306) per generare i vettori pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 e pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Una strategia simile è stata utilizzata per generare il vettore di controllo pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Per generare il costrutto AAV-shPCx, è necessario un vettore plasmidico AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), che contiene la sequenza di DNA che codifica per lo shRNA che ha come bersaglio la PCx murina (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Sotto il controllo del promotore U6, mCherry viene utilizzato sotto il controllo del promotore CMV. La produzione di vettori AAV ausiliari è stata effettuata secondo le istruzioni del produttore (Cell Biolabs). In breve, utilizzare un plasmide di trasferimento che trasporta il gene codificante mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) in modo transitorio. Trasfezione di cellule 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), nonché la proteina del capside AAV1 codificante e la proteina accessoria. Plasmide di confezionamento, utilizzando il metodo del fosfato di calcio. Il supernatante virale grezzo è stato ottenuto mediante cicli di congelamento-scongelamento in un bagno di ghiaccio secco/etanolo e cellule lisate in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Il vettore AAV è stato purificato mediante ultracentrifugazione a gradiente di iodixanolo discontinuo (24 ore a 32.000 rpm e 4°C) e concentrato utilizzando un filtro centrifugo Amicon ultra-15. Il titolo genomico di AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 copie del genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX è stato come precedentemente descritto (54), misurato mediante PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) e AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
I neuroni primari sono stati raschiati in PBS 1x ghiacciato, pellettati e quindi omogeneizzati in tampone di lisi Triton X-100 allo 0,5% / sodio desossicolato/PBS allo 0,5% contenente inibitore della fosfatasi e della proteasi (Roche). La quantificazione proteica è stata eseguita utilizzando il test dell'acido bicinconinico (Thermo Fisher Scientific). Le proteine ​​sono state quindi separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS e quindi trasferite su una membrana di polivinilidenfluoruro (GE Healthcare). Bloccare i siti non specifici e incubare con l'anticorpo primario (vedere la Tabella S1 per i dettagli) in latte al 5% in TBST (soluzione salina tamponata con Tris e Tween), fasi di lavaggio e anticorpo secondario in TBST. Incubare. Incubare con l'anticorpo primario per una notte a +4 °C. Dopo il lavaggio, applicare l'anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente. Successivamente, incubando lo stesso blot con un anticorpo anti-β-actina, è stato confermato lo stesso caricamento. Rilevamento mediante conversione in chemiluminescenza e potenziamento della chemiluminescenza (GE Healthcare).
I neuroni precedentemente seminati su coprioggetto in vetro sono stati fissati con paraformaldeide (PFA) al 4%/PBS al momento specificato a temperatura ambiente per 10 minuti. I coprioggetto sono stati prima permeati con Triton X-100 allo 0,1%/PBS per 5 minuti a temperatura ambiente, e poi in tampone bloccante [albumina sierica bovina (BSA) al 3%/PBS]. Il secondo giorno, i coprioggetto sono stati lavati con tampone bloccante e incubati con l'anticorpo secondario coniugato al fluoroforo appropriato per 2 ore a temperatura ambiente; infine, i campioni sono stati lavati accuratamente in PBS con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) controcolorato e quindi fissati sul vetrino da microscopio con Aqua-Poly/Mount.
I topi (maschi e femmine) sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (130 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e somministrati per via sottocutanea con analgesico carprofen (5 mg/kg). Sono stati quindi posizionati in uno strumento stereotassico (Kopf) dotato di un cuscinetto riscaldante. È stato esposto il cranio e, con un trapano odontoiatrico, è stata assottigliata la parte della corteccia cerebellare corrispondente all'osso mis (da lambda: coda 1.8, laterale 1, corrispondente ai lobuli IV e V). Con un ago da siringa curvo, è stato creato con cautela un piccolo foro nel cranio per evitare di interrompere la vascolarizzazione sottostante. Quindi, il sottile capillare di vetro trafilato viene inserito lentamente nel microforo (da -1,3 a -1 sul lato ventrale della dura madre) e 200-300 nl di AAV vengono iniettati nel microiniettore (Narishige) con siringhe manuali (Narishige) più volte a bassa pressione in un intervallo di tempo compreso tra 10 e 20 minuti. Dopo l'infusione, il capillare viene mantenuto in posizione per altri 10 minuti per consentire al virus di diffondersi completamente. Dopo la rimozione dei capillari, la pelle viene suturata con cura per ridurre al minimo l'infiammazione della ferita e consentire all'animale di riprendersi. Gli animali sono stati trattati con analgesici (caspofen) per diversi giorni dopo l'operazione, durante i quali le loro condizioni fisiche sono state attentamente monitorate e sono stati quindi soppressi al momento stabilito. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida europee, nazionali e istituzionali e sono state approvate dal LandesamtfürNatur per l'Ambiente e la Protezione dell'Ambiente, Renania Settentrionale-Vestfalia, Germania.
Gli animali sono stati anestetizzati con ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e il cuore è stato perfuso prima con PBS 0,1 M e poi con PFA al 4% in PBS. Il tessuto è stato dissezionato e fissato in PFA/PBS al 4% per una notte a 4 °C. Un coltello vibrante (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) è stato utilizzato per preparare sezioni sagittali (50 μm di spessore) dal cervello fissato in PBS. Salvo diversa indicazione, la colorazione delle sezioni libere è stata eseguita come descritto sopra (13) a temperatura ambiente e sotto agitazione. In breve, prima, le fette ottenute sono state permeabilizzate con Triton X-100/PBS allo 0,5% per 15 minuti a temperatura ambiente; per alcuni epitopi (Pcx e Shmt2), riscaldando le fette in tampone tris-EDTA a 80 °C (PH 9) per 25 minuti invece di questo passaggio. Successivamente, le sezioni sono state incubate con l'anticorpo primario (vedere Tabella S1) in tampone bloccante (BSA/PBS al 3%) a 4°C per una notte sotto agitazione. Il giorno successivo, le sezioni sono state lavate con tampone bloccante e incubate con l'anticorpo secondario coniugato al fluoroforo appropriato per 2 ore a temperatura ambiente; infine, le sezioni sono state lavate accuratamente in PBS, controcolorate con DAPI e quindi fissate con AquaPolymount su un vetrino da microscopio.
Per visualizzare il campione è stato utilizzato un microscopio confocale a scansione laser (TCS SP8-X o TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) dotato di un laser a luce bianca e di un laser ultravioletto a diodi 405. Eccitando il fluoroforo e raccogliendo il segnale con un rilevatore ibrido (HyDs), il software LAS-X è stato utilizzato per raccogliere immagini sovrapposte conformi al campionamento di Nyquist in modalità sequenziale: per i pannelli non quantitativi, si tratta di segnali altamente dinamici (ad esempio, in cellule somatiche e dendriti) mtYFP). Utilizzare HyD per rilevare il numero di PN in modalità BrightR. Il gating da 0,3 a 6 ns viene applicato per ridurre il fondo.
Imaging in tempo reale delle cellule ordinate. Dopo l'ordinamento in terreno Neurobasal-A contenente l'1% di supplemento di B27 e 0,5 mM di GlutaMax, le cellule sono state immediatamente seminate su vetrini rivestiti di poli-l-lisina (μ-Slide8 Well, Ibidi, numero di catalogo 80826), quindi mantenute a 37 °C e al 5% di CO2 per 1 ora per consentire alle cellule di stabilizzarsi. L'imaging in tempo reale è stato eseguito su un microscopio confocale a scansione laser Leica SP8 dotato di un obiettivo a olio a laser bianco HyD 63× [apertura numerica (NA) 1,4] e un tavolino riscaldante.
Il topo è stato rapidamente anestetizzato con anidride carbonica e decapitato, il cervello è stato rapidamente rimosso dal cranio e tagliato in una sezione sagittale spessa 200 μm (per l'esperimento di marcatura 13C) o spessa 275 μm (per gli esperimenti con due fotoni) riempita con i seguenti materiali Il gelato (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) è riempito con le seguenti sostanze: 125 mM di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) ghiacciato, saturo di carbonio (95% O2 e 5% CO2) a basso contenuto di Ca2 + NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucosio, 0,5 mM CaCl2 e 3,5 mM MgCl2 (pressione osmotica da 310 a 330 mmol). Trasferire le fette di cervello ottenute in una camera di preincubazione contenente Ca2 + ACSF più elevato (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio, 1,0 mM CaCl2 e 2,0 mM MgCl2) Medium) pH 7,4 e 310-320 mmol).
Durante il processo di imaging, le sezioni sono state spostate in una sala dedicata e l'esperimento è stato eseguito sotto perfusione continua di ACSF a una temperatura costante di 32-33 °C. Per l'imaging delle sezioni è stato utilizzato un microscopio a scansione laser multifotone (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) dotato di un obiettivo Leica 25x (NA 0,95, acqua), laser Ti:Zaffiro (Chameleon Vision II, Coherent). Modulo FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM di Grx1-roGFP2. Le variazioni dello stato redox citoplasmatico dei neuroni neuronali (PN) sono state misurate mediante FLIM a due fotoni in sezioni cerebrali sagittali, dove il biosensore Grx1-roGFP2 ha individuato i neuroni neuronali. Nello strato di PN, il campo di acquisizione è selezionato circa 50-80 μm al di sotto della superficie della fetta per garantire la presenza di un neurone neuronale vitale (ovvero, l'assenza di struttura a perle o di alterazioni morfologiche neuronali lungo i dendriti) e del sensore roGFP2 a doppia positività e dell'AAV che codifica per shRNA PCx o la sua sequenza di controllo (ciascuno co-esprimente mCherry). Acquisire immagini single-stack con zoom digitale 2x [lunghezza d'onda di eccitazione: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Rilevamento: HyD interno, gruppo filtro di isotiocianato di fluoresceina (FITC)] e media dell'immagine entro 2-3 minuti vengono utilizzati per garantire che vengano raccolti fotoni sufficienti (1000 fotoni in totale) per l'adattamento della curva. La sensibilità della sonda Grx1-roGFP2 e la verifica delle condizioni FLIM sono state eseguite monitorando il valore della durata di vita di roGFP2 aggiungendo 10 mM di H2O2 esogeno all'ACSF di perfusione (per massimizzare l'ossidazione, con conseguente aumento della durata di vita) e quindi aggiungendo 2 mM di ditiotreitolo (riducendo al minimo il grado di riduzione, con conseguente diminuzione della durata di vita) (Figura S8, da D a G). Utilizzare il software FLIMfit 5.1.1 per analizzare i risultati acquisiti, adattare la singola curva di decadimento esponenziale dell'intera immagine all'IRF misurata (funzione di risposta dello strumento) e χ2 è circa 1. Per calcolare la durata di un singolo PN, la maschera attorno al corpo del nervo è stata disegnata manualmente e la durata media in ciascuna maschera è stata utilizzata per la quantificazione.
Analisi del potenziale mitocondriale. Dopo che la sezione acuta è stata incubata con 100 nM di TMRM aggiunto direttamente all'ACSF perfuso per 30 minuti, le variazioni del potenziale mitocondriale dei PN sono state misurate mediante un microscopio a due fotoni. L'imaging TMRM è stato eseguito eccitando la sonda a 920 nm e utilizzando HyD interna (isotiocianato di tetrametilrodamina: 585/40 nm) per raccogliere i segnali; utilizzando la stessa lunghezza d'onda di eccitazione ma utilizzando una diversa HyD interna (FITC: 525/50) per l'imaging di mtYFP. Utilizzare il plug-in Image Calculator di ImageJ per valutare il potenziale mitocondriale a livello di singola cellula. In breve, l'equazione del plug-in: segnale = min (mtYFP, TMRM) viene utilizzata per identificare la regione mitocondriale che mostra il segnale TMRM nel Purkinje Somali nell'immagine confocale a singolo stack del canale corrispondente. Quindi l'area dei pixel nella maschera risultante viene quantificata e quindi normalizzata sulla corrispondente immagine single-stack di soglia del canale mtYFP per ottenere la frazione mitocondriale che mostra il potenziale mitocondriale.
L'immagine è stata deconvoluta con il software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Per le immagini scansionate delle piastrelle, il montaggio di una singola piastrella viene effettuato utilizzando l'algoritmo di stitching automatico fornito dal software LAS-X. Dopo la calibrazione dell'immagine, utilizzare ImageJ e Adobe Photoshop per elaborare ulteriormente l'immagine e regolare uniformemente luminosità e contrasto. Utilizzare Adobe Illustrator per la preparazione grafica.
Analisi del focus del mtDNA. Il numero di lesioni del mtDNA è stato quantificato su sezioni cerebellari marcate con anticorpi contro il DNA mediante microscopio confocale. Ogni area bersaglio è stata creata per il corpo cellulare e il nucleo di ciascuna cellula, e la rispettiva area è stata calcolata utilizzando il plug-in Multi Measure (software ImageJ). Sottrarre l'area nucleare dall'area del corpo cellulare per ottenere l'area citoplasmatica. Infine, il plug-in Analyze Particles (software ImageJ) è stato utilizzato per quantificare automaticamente i punti del DNA citoplasmatico che indicano il mtDNA sull'immagine soglia, e i risultati ottenuti sono stati normalizzati alla media PN dei topi CTRL. I risultati sono espressi come numero medio di nucleosidi per cellula.
Analisi dell'espressione proteica. Utilizzare il plug-in Image Calculator di ImageJ per valutare l'espressione proteica nella PN a livello di singola cellula. In breve, nell'immagine confocale a singolo strato del canale corrispondente, tramite l'equazione: segnale = min (mtYFP, anticorpo), viene identificata la regione mitocondriale che mostra immunoreattività a un determinato anticorpo in Purkina. Quindi, l'area dei pixel nella maschera risultante viene quantificata e quindi normalizzata sulla corrispondente immagine a singolo strato di soglia del canale mtYFP per ottenere la frazione mitocondriale della proteina visualizzata.
Analisi della densità delle cellule di Purkinje. Il plug-in Cell Counter di ImageJ è stato utilizzato per valutare la densità delle cellule di Purkinje dividendo il numero di cellule di Purkinje contate per la lunghezza dell'anello cerebellare occupato dalle cellule contate.
Preparazione e raccolta dei campioni. I cervelli del gruppo di controllo e dei topi Mfn2cKO sono stati fissati in PFA al 2%/glutaraldeide al 2,5% in tampone fosfato (PB) 0,1 M, e quindi sono state preparate sezioni coronali utilizzando ciliati (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (spessore da 50 a 60 μm). Quindi fissati in tampone PB in tetraossido di os all'1% e ferrocianuro di potassio all'1,5% a temperatura ambiente per 1 ora. Le sezioni sono state lavate tre volte con acqua distillata e quindi colorate con etanolo al 70% contenente acetato di uranile all'1% per 20 minuti. Le sezioni sono state quindi disidratate in alcol graduato e incluse in resina epossidica Durcupan ACM (resina da colata Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, numero di catalogo 14040) tra vetrini rivestiti in silicone e infine polimerizzate in forno a 60 °C per 48 ore. È stata selezionata l'area della corteccia cerebellare e sezioni ultrasottili da 50 nm sono state tagliate su Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) e prelevate su una griglia di rame a fessura di 2x1 mm rivestita con pellicola di polistirene. Le sezioni sono state colorate con una soluzione di acetato di uranile al 4% in H₂O per 10 minuti, lavate con H₂O diverse volte, quindi con citrato di piombo di Reynolds in H₂O per 10 minuti e infine lavate con H₂O diverse volte. Le micrografie sono state realizzate con un microscopio elettronico a trasmissione Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) utilizzando una fotocamera digitale TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA, Germania).
Per i topi infettati con AAV, il cervello è stato separato e sezionato in una sezione sagittale di 1 mm di spessore, e il cervelletto è stato esaminato utilizzando un microscopio a fluorescenza per identificare l'anello infettato da AAV (cioè, esprimente mCherry). Vengono utilizzati solo esperimenti in cui l'iniezione di AAV determina un'efficienza di trasduzione molto elevata dello strato di cellule di Purkinje (ovvero quasi l'intero strato) in almeno due anelli cerebellari consecutivi. L'ansa trasdotta con AAV è stata microdissettata per la post-fissazione notturna (PFA al 4% e glutaraldeide al 2,5% in tampone cocoato 0,1 M) e ulteriormente processata. Per l'inclusione EPON, il tessuto fissato è stato lavato con tampone cocoato sodico 0,1 M (Applichem) e incubato con OsO4 al 2% (os, Science Services; Caco) in tampone cocoato sodico 0,1 M (Applichem) per 4 ore, quindi lavare per 2 ore. Ripetere 3 volte con tampone cocamide 0,1 M. Successivamente, la serie ascendente di etanolo è stata utilizzata per incubare ciascuna soluzione etanolica a 4 °C per 15 minuti per disidratare il tessuto. Il tessuto è stato trasferito in ossido di propilene e incubato per una notte in EPON (Sigma-Aldrich) a 4 °C. Posizionare il tessuto in EPON fresco a temperatura ambiente per 2 ore, quindi includerlo a 62 °C per 72 ore. Utilizzare un ultramicrotomo (Leica Microsystems, UC6) e una lama diamantata (Diatome, Biel, Svizzera) per tagliare sezioni ultrasottili di 70 nm e colorare con acetato di uranile all'1,5% per 15 minuti a 37 °C, quindi colorare con soluzione di citrato di piombo per 4 minuti. Le micrografie elettroniche sono state acquisite utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione JEM-2100 Plus (JEOL) dotato di Camera OneView 4K a 16 bit (Gatan) e software DigitalMicrograph (Gatan). Per l'analisi, sono state acquisite micrografie elettroniche con zoom digitale 5000× o 10.000×.
Analisi morfologica dei mitocondri. Per tutte le analisi, i contorni dei singoli mitocondri sono stati delineati manualmente in immagini digitali utilizzando il software ImageJ. Vengono analizzati diversi parametri morfologici. La densità mitocondriale è espressa come percentuale ottenuta dividendo l'area mitocondriale totale di ciascuna cellula per l'area del citoplasma (area del citoplasma = area cellulare - area del nucleo cellulare) × 100. La rotondità dei mitocondri è calcolata con la formula [4π∙(area/perimetro 2)]. La morfologia ista dei mitocondri è stata analizzata e suddivisa in due categorie ("tubolari" e "a bolle") in base alle loro forme principali.
Analisi del numero e della densità di autofagosomi/lisosomi. Utilizzare il software ImageJ per delineare manualmente i contorni di ciascun autofagosoma/lisosoma nell'immagine digitale. L'area dell'autofagosoma/lisosoma è espressa in percentuale, calcolata dividendo l'area totale della struttura dell'autofagosoma/lisosoma di ciascuna cellula per l'area del citoplasma (area del citoplasma = area cellulare - area del nucleo) × 100. La densità di autofagosomi/lisosomi è calcolata dividendo il numero totale per il numero di strutture dell'autofagosoma/lisosoma per cellula (in termini di area citoplasmatica) (area citoplasmatica = area cellulare - area nucleare).
Etichettatura per il sezionamento acuto e la preparazione del campione. Per gli esperimenti che richiedono l'etichettatura con glucosio, trasferire le sezioni cerebrali acute in una camera di preincubazione contenente carbonio saturo (95% O2 e 5% CO2), soluzione ACSF ad alto contenuto di Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio, 1,0 mM CaCl2 e 2,0 mM MgCl2, regolati a pH 7,4 e 310-320 mOsm), in cui il glucosio è una sostituzione 13C6-glucosio (Eurisotop, numero di catalogo CLM-1396). Per gli esperimenti che richiedono la marcatura con piruvato, trasferire le sezioni cerebrali acute in un tampone ACSF con Ca2 + più elevato (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio, 1,0 mM CaCl2 e aggiungere 2,0 mM MgCl2, regolare a pH 7,4 e 310-320 mOsm) e aggiungere 1 mM 1-[1-13C]piruvato (Eurisotop, numero di catalogo CLM-1082). Incubare le sezioni per 90 minuti a 37 °C. Al termine dell'esperimento, le sezioni sono state rapidamente lavate con una soluzione acquosa (pH 7,4) contenente 75 mM di carbonato di ammonio e quindi omogeneizzate in acetonitrile (ACN): metanolo: acqua 40:40:20 (v:v:v). Dopo aver incubato le sezioni in ghiaccio per 30 minuti, i campioni sono stati centrifugati a 21.000 g per 10 minuti a 4 °C e il surnatante limpido è stato essiccato in un concentratore SpeedVac. Il pellet di metabolita essiccato risultante è stato conservato a -80 °C fino al momento dell'analisi.
Analisi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa di amminoacidi marcati con 13 C. Per l'analisi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), il pellet di metabolita è stato risospeso in 75 μl di acqua di grado LC-MS (Honeywell). Dopo centrifugazione a 21.000 g per 5 minuti a 4 °C, 20 μl del surnatante chiarificato sono stati utilizzati per l'analisi del flusso di amminoacidi, mentre il resto dell'estratto è stato immediatamente utilizzato per l'analisi degli anioni (vedi sotto). L'analisi degli amminoacidi è stata eseguita utilizzando il protocollo di derivatizzazione del cloruro di benzoile precedentemente descritto (55, 56). Nel primo passaggio, 10 μl di carbonato di sodio 100 mM (Sigma-Aldrich) sono stati aggiunti a 20 μl di estratto di metabolita, quindi 10 μl di cloruro di benzoile al 2% (Sigma-Aldrich) sono stati aggiunti all'ACN di grado LC. Il campione è stato brevemente agitato e quindi centrifugato a 21.000 g per 5 minuti a 20 °C. Trasferire il surnatante chiarificato in una fiala da 2 ml con inserto conico in vetro (volume 200 μl). I campioni sono stati analizzati utilizzando il sistema LC ad altissime prestazioni Acquity iClass (Waters) collegato allo spettrometro di massa di precisione ad alta risoluzione Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Per l'analisi, 2 μl del campione derivatizzato sono stati iniettati in una colonna T3 in silice ad alta resistenza da 100 × 1,0 mm (Waters) contenente particelle da 1,8 μm. La portata è di 100 μl/min e il sistema tampone è costituito dal tampone A (10 mM di formiato di ammonio e 0,15% di acido formico in acqua) e dal tampone B (ACN). Il gradiente è il seguente: 0%B a 0 minuti; 0%B. 0 a 15% B a 0 a 0,1 minuti; 15 a 17% B a 0,1 a 0,5 minuti; B al 17 a 55% a 0,5 a 14 minuti; B al 55 a 70% a 14 a 14,5 minuti; al 14,5 a 70 a 100% B a 18 minuti; 100% B a 18 a 19 minuti; 100 a 0% B a 19 a 19,1 minuti; 0% B a 19,1 a 28 minuti (55, 56). Lo spettrometro di massa QE-HF opera in modalità di ionizzazione positiva con un intervallo di massa m/z (rapporto massa/carica) compreso tra 50 e 750. La risoluzione applicata è di 60.000, il target ionico con controllo del guadagno (AGC) ottenuto è 3×106 e il tempo massimo di emissione ionica è di 100 millisecondi. La sorgente di ionizzazione elettrospray riscaldata (ESI) opera a una tensione di spruzzo di 3,5 kV, una temperatura capillare di 250 °C, un flusso d'aria di guaina di 60 UA (unità arbitrarie) e un flusso d'aria ausiliario di 20 UA. 250 °C. La lente S è impostata a 60 UA.
Analisi mediante cromatografia anionica-MS di acidi organici marcati con 13C. Il precipitato metabolita rimanente (55 μl) è stato analizzato utilizzando un sistema di cromatografia ionica Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) collegato a uno spettrometro di massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). In breve, 5 μl di estratto metabolita sono stati iniettati in una colonna Dionex IonPac AS11-HC dotata di HPLC (2 mm × 250 mm, granulometria 4 μm, Thermo Fisher Scientific) in modalità push-in partial loop con un rapporto di riempimento pari a 1. ) Colonna di protezione Dionex IonPac AG11-HC (2 mm × 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). La temperatura della colonna è mantenuta a 30 °C e l'autocampionatore è impostato a 6 °C. Utilizzare una cartuccia di idrossido di potassio dotata di acqua deionizzata per generare un gradiente di idrossido di potassio attraverso il generatore di eluente. Separazione dei metaboliti a una portata di 380 μl/min, applicando il seguente gradiente: da 0 a 3 minuti, 10 mM KOH; da 3 a 12 minuti, 10 a 50 mM KOH; da 12 a 19 minuti, 50 a 100 mM KOH; da 19 a 21 minuti, 100 mM KOH; da 21 a 21,5 minuti, 100 a 10 mM KOH. La colonna è stata riequilibrata con 10 mM KOH per 8,5 minuti.
I metaboliti eluiti vengono combinati con un flusso supplementare di isopropanolo da 150 μl/min dopo la colonna e quindi indirizzati a uno spettrometro di massa ad alta risoluzione che opera in modalità di ionizzazione negativa. Lo spettrometro di massa monitora l'intervallo di massa da m/z 50 a 750 con una risoluzione di 60.000. L'AGC è impostato su 1×106 e il tempo di ioni massimo è mantenuto a 100 ms. La sorgente ESI riscaldata è stata utilizzata a una tensione di spruzzo di 3,5 kV. Le altre impostazioni della sorgente ionica sono le seguenti: temperatura del capillare 275 °C; flusso di gas di guaina 60 UA; flusso di gas ausiliario 20 UA a 300 °C e impostazione della lente S a 60 UA.
Analisi dei dati dei metaboliti marcati con 13C. Utilizzare il software TraceFinder (versione 4.2, Thermo Fisher Scientific) per l'analisi dei dati del rapporto isotopico. L'identità di ciascun composto è stata verificata mediante un composto di riferimento affidabile e analizzata in modo indipendente. Per eseguire l'analisi di arricchimento isotopico, l'area del cromatogramma ionico estratto (XIC) di ciascun isotopo 13C (Mn) è stata estratta da [M + H] +, dove n è il numero di atomi di carbonio del composto target, utilizzato per analizzare gli amminoacidi o [MH] + viene utilizzato per analizzare gli anioni. L'accuratezza di massa di XIC è inferiore a cinque parti per milione e l'accuratezza di RT è di 0,05 minuti. L'analisi di arricchimento viene eseguita calcolando il rapporto tra ciascun isotopo rilevato e la somma di tutti gli isotopi del composto corrispondente. Questi rapporti sono forniti come valori percentuali per ciascun isotopo e i risultati sono espressi come percentuale molare di arricchimento (MPE), come descritto in precedenza (42).
Il pellet di neuroni congelato è stato omogeneizzato in metanolo all'80% (v/v) ghiacciato, agitato e incubato a -20 °C per 30 minuti. Agitare nuovamente il campione e agitare a +4 °C per 30 minuti. Il campione è stato centrifugato a 21.000 g per 5 minuti a 4 °C, quindi il surnatante risultante è stato raccolto ed essiccato utilizzando un concentratore SpeedVac a 25 °C per la successiva analisi. Come descritto sopra, l'analisi LC-MS è stata eseguita sugli amminoacidi delle cellule ordinate. Utilizzando TraceFinder (versione 4.2, Thermo Fisher Scientific), l'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando la massa monoisotopica di ciascun composto. La normalizzazione dei quantili dei dati dei metaboliti è stata eseguita utilizzando il pacchetto software preprocessCore (57).
Preparazione delle fette. Il topo è stato rapidamente anestetizzato con anidride carbonica e decapitato, il cervello è stato rapidamente rimosso dal cranio e il coltello vibrante pieno di ghiaccio (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) è stato utilizzato per tagliarlo in sezioni sagittali da 300 a 375 μm. Gassificazione a freddo del carbonio (95% O2 e 5% CO2) Basso Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio, 1,0 mM CaCl2 e 6,0 mM MgCl2. Regolare a pH 7,4 e 310-330 mOsm). Trasferire le fette di cervello ottenute in una camera contenente Ca2 + ACSF più elevato (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio, 4,0 mM CaCl2 e mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 e 310-320 mOsm). Conservare le fette per 20-30 minuti in modo che possano essere ripristinate prima della registrazione.
Registrazione. Per tutte le registrazioni è stato utilizzato un microscopio dotato di camera di registrazione fissa e obiettivo a immersione in acqua 20x (Scientifica). Le presunte cellule di Purkinje sono state identificate in base a (i) dimensioni corporee, (ii) posizione anatomica del cervelletto e (iii) espressione del gene reporter fluorescente mtYFP. La pipetta patch con una resistenza della punta da 5 a 11 megaohm viene estratta da un capillare in vetro borosilicato (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Germania) e da una pipetta orizzontale Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Tutte le registrazioni sono state eseguite dall'amplificatore patch clamp ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Germania), controllato dal software Signal (versione 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Regno Unito). L'esperimento è stato registrato a una frequenza di campionamento di 12,5 kHz. Il segnale viene filtrato con due filtri Bessel passa-corto con frequenze di taglio rispettivamente di 1,3 e 10 kHz. La capacità della membrana e della pipetta viene compensata dal circuito di compensazione che utilizza l'amplificatore. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti sotto il controllo di una telecamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Germania), a sua volta controllata dal software Hokawo (versione 2.8, Hamamatsu, Germania).
Configurazione e analisi di routine della cellula intera. Immediatamente prima della registrazione, riempire la pipetta con la soluzione interna contenente le seguenti sostanze: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM gluconato di potassio, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosina trifosfato (GTP) (Na) e 10,0 mM creatinina fosfato. Il pH è stato portato a 7,25 e la pressione osmotica era di 290 mOsm (saccarosio). Immediatamente dopo aver applicato una forza di 0 pA per rompere la membrana, è stato misurato il potenziale di membrana a riposo. La resistenza di ingresso è stata misurata applicando correnti iperpolarizzate di -40, -30, -20 e -10 pA. Misurare l'ampiezza della risposta in tensione e utilizzare la legge di Ohm per calcolare la resistenza di ingresso. L'attività spontanea è stata registrata in un clamp di tensione per 5 minuti e l'sPSC è stata identificata e misurata in Igor Pro (versione 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) utilizzando uno script di riconoscimento semiautomatico. La curva IV e la corrente stazionaria vengono misurate bloccando la batteria a diversi potenziali (a partire da -110 mV) e aumentando la tensione a incrementi di 5 mV. La produzione di AP è stata testata applicando una corrente depolarizzante. Bloccare la cella a -70 mV applicando un impulso di corrente depolarizzante. Regolare separatamente la dimensione del passo di ciascuna unità di registrazione (da 10 a 60 pA). Calcolare la frequenza massima di AP contando manualmente i picchi di impulso che causano la frequenza di AP più elevata. La soglia di AP viene analizzata utilizzando la derivata seconda dell'impulso di depolarizzazione che per primo innesca uno o più AP.
Configurazione e analisi del patch perforato. Eseguire la registrazione del patch perforato utilizzando protocolli standard. Utilizzare una pipetta priva di ATP e GTP che non contenga i seguenti ingredienti: 128 mM gluconato K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA e 2 mM MgCl2, e portare a pH 7,2 (utilizzando KOH). ATP e GTP vengono omessi dalla soluzione intracellulare per prevenire una permeabilità incontrollata della membrana cellulare. La pipetta del patch viene riempita con una soluzione interna contenente amfotericina (circa 200-250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) per ottenere un patch record perforato. L'amfotericina è stata sciolta in dimetilsolfossido (concentrazione finale: 0,1-0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). La concentrazione di DMSO utilizzata non ha avuto effetti significativi sui neuroni studiati. Durante il processo di punzonatura, la resistenza del canale (Ra) è stata monitorata continuamente e l'esperimento è stato avviato dopo che l'ampiezza di Ra e AP si è stabilizzata (20-40 minuti). L'attività spontanea è stata misurata in un morsetto di tensione e/o corrente per 2-5 minuti. L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando Igor Pro (versione 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versione 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) e GraphPad Prism (versione 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Stati Uniti. Per identificare gli AP spontanei, viene utilizzato il plug-in NeuroMatic v3.0c di IgorPro. Identifica automaticamente gli AP utilizzando una soglia specifica, che viene regolata individualmente per ogni record. Utilizzando l'intervallo di picco, determinare la frequenza di picco con la frequenza di picco istantanea massima e la frequenza di picco media.
Isolamento di PN. Adattandosi al protocollo precedentemente pubblicato, i PN sono stati purificati dal cervelletto di topo in una fase specifica (58). In breve, il cervelletto è stato sezionato e triturato in un mezzo di dissociazione ghiacciato [senza HBSS Ca2+ e Mg2+, integrato con 20 mM di glucosio, penicillina (50 U/ml) e streptomicina (0,05 mg/ml)], e quindi digerito in papaina [HBSS, integrato con 1-cisteina·HCl (1 mg/ml), papaina (16 U/ml) e deossiribonucleasi I (DNasi I; 0,1 mg/ml)] Trattare per 30 minuti a 30°C. Lavare prima i tessuti nel terreno HBSS contenente muco d'uovo (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) e DNasi (0,1 mg/ml) a temperatura ambiente per prevenire la digestione enzimatica, e poi nel terreno HBSS contenente glucosio 20 mM. Macinando delicatamente in HBSS, penicillina (50 U/ml), streptomicina (0,05 mg/ml) e DNasi (0,1 mg/ml) si rilasciano singole cellule. La sospensione cellulare risultante è stata filtrata attraverso un colino cellulare da 70 μm, quindi le cellule sono state centrifugate (1110 rpm, 5 minuti, 4 °C) e risospese nel terreno di smistamento [HBSS, integrato con glucosio 20 mM, siero bovino fetale al 20%, penicillina (50 U/ml) e streptomicina (0,05 mg/ml)]; valutare la vitalità cellulare con ioduro di propidio e regolare la densità cellulare a 1×106 - 2×106 cellule/ml. Prima della citometria a flusso, la sospensione è stata filtrata attraverso un filtro cellulare da 50 μm.
Citofluorimetro. Il sorting cellulare è stato eseguito a 4 °C utilizzando la macchina FACSAria III (BD Biosciences) e il software FACSDiva (BD Biosciences, versione 8.0.1). La sospensione cellulare è stata classificata utilizzando un ugello da 100 μm a una pressione di 20 psi a una velocità di ~2800 eventi/sec. Poiché i criteri di gating tradizionali (dimensione cellulare, discriminazione bimodale e caratteristiche di scattering) non possono garantire il corretto isolamento del PN da altri tipi cellulari, la strategia di gating è basata sul confronto diretto dell'intensità e dell'autofluorescenza di YFP nei topi mitoYFP+ ​​e mitoYFP- di controllo. YFP viene eccitato irradiando il campione con una linea laser a 488 nm e il segnale viene rilevato utilizzando un filtro passa-banda a 530/30 nm. Nei topi mitoYFP+, la forza relativa del gene reporter Rosa26-mitoYFP viene utilizzata anche per distinguere i frammenti del corpo neuronale e dell'assone. Il 7-AAD viene eccitato con un laser giallo a 561 nm e rilevato con un filtro passa-banda a 675/20 nm per escludere le cellule morte. Per separare contemporaneamente gli astrociti, la sospensione cellulare è stata colorata con ACSA-2-APC, quindi il campione è stato irradiato con un laser a 640 nm e un filtro passa-banda a 660/20 nm è stato utilizzato per rilevare il segnale.
Le cellule raccolte sono state centrifugate (1110 rpm, 5 minuti, 4 °C) e conservate a -80 °C fino al momento dell'utilizzo. I topi Mfn2cKO e la loro cucciolata vengono classificati lo stesso giorno per ridurre al minimo la variabilità procedurale. La presentazione e l'analisi dei dati FACS sono state eseguite utilizzando il software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Come accennato in precedenza (59), la PCR in tempo reale viene utilizzata per isolare il DNA dai neuroni selezionati per la successiva quantificazione del mtDNA. La linearità e la sensibilità di soglia sono state inizialmente testate eseguendo la qPCR su diversi numeri di cellule. In breve, raccogliere 300 PN in un tampone di lisi costituito da 50 mM di tris-HCl (pH 8,5), 1 mM di EDTA, 0,5% di Tween 20 e proteinasi K (200 ng/ml) e incubare a 55 °C per 120 minuti. Le cellule sono state ulteriormente incubate a 95 °C per 10 minuti per garantire la completa inattivazione della proteinasi K. Utilizzando una sonda TaqMan (Thermo Fisher) specifica per mt-Nd1, il mtDNA è stato misurato mediante PCR semi-quantitativa nel sistema Real-Time PCR 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Geni Science, numero di catalogo Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numero di catalogo AIVI3E8) e 18S (Thermo Fisher Scientific, numero di catalogo Hs99999901_s1).
Preparazione del campione di proteoma. Riscaldando la soluzione a 95 °C per 10 minuti e sonicando, nel tampone di lisi [6 M di cloruro di guanidina, 10 mM di tris(2-carbossietil) fosfina cloridrato, 10 mM di cloroacetammide e 100 mM di tris-Lyse, pellet di neuroni congelati in HCl]. Su Bioruptor (Diagenode) per 10 minuti (30 secondi di impulso / 30 secondi di pausa). Il campione è stato diluito 1:10 in 20 mM di tris-HCl (pH 8,0), miscelato con 300 ng di tripsina oro (Promega) e incubato per una notte a 37 °C per ottenere una digestione completa. Il secondo giorno, il campione è stato centrifugato a 20.000 g per 20 minuti. Il surnatante è stato diluito con acido formico allo 0,1% e la soluzione è stata desalinizzata con StageTips autoprodotti. Il campione è stato essiccato in uno strumento SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) a 45 °C, quindi il peptide è stato sospeso in acido formico allo 0,1%. Tutti i campioni sono stati preparati simultaneamente dalla stessa persona. Per analizzare i campioni di astrociti, 4 μg di peptidi desalati sono stati marcati con un tag di massa tandem (TMT10plex, numero di catalogo 90110, Thermo Fisher Scientific) con un rapporto peptide/reagente TMT di 1:20. Per la marcatura con TMT, 0,8 mg di reagente TMT sono stati risospesi in 70 μl di ACN anidro e il peptide essiccato è stato ricostituito in 9 μl di TEAB (bicarbonato di trietilammonio) 0,1 M, a cui sono stati aggiunti 7 μl di reagente TMT in ACN. La concentrazione era del 43,75%. Dopo 60 minuti di incubazione, la reazione è stata bloccata con 2 μl di idrossilammina al 5%. I peptidi marcati sono stati raccolti, essiccati, risospesi in 200 μl di acido formico (FA) allo 0,1%, divisi in due e quindi desalinizzati utilizzando StageTips autocostruiti. Utilizzando il cromatografo liquido ad altissime prestazioni UltiMate 3000 (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), una delle due metà è stata frazionata su una colonna cromatografica Acquity da 1 mm x 150 mm riempita con 130 Å1,7 μm di particelle C18 (Waters, n. catalogo SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Separare i peptidi a una velocità di flusso di 30 μl/min, separare dall'1% al 50% del tampone B per 85 minuti con un gradiente graduale di 96 minuti, dal 50% al 95% del tampone B per 3 minuti, quindi 8 minuti per il tampone B al 95%; il tampone A è composto dal 5% di ACN e 10 mM di bicarbonato di ammonio (ABC), e il tampone B è composto dall'80% di ACN e 10 mM di ABC. Raccogliere le frazioni ogni 3 minuti e combinarle in due gruppi (1 + 17, 2 + 18, ecc.) ed essiccarle in una centrifuga sotto vuoto.
Analisi LC-MS/MS. Per la spettrometria di massa, i peptidi (numero r119.aq) sono stati separati su una colonna analitica PicoFrit da 25 cm e 75 μm di diametro interno (nuovo obiettivo, codice PF7508250) dotata di terreno di coltura ReproSil-Pur 120 C18-AQ da 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), utilizzare EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germania). La colonna è stata mantenuta a 50 °C. I tamponi A e B sono rispettivamente acido formico allo 0,1% in acqua e acido formico allo 0,1% in ACN all'80%. I peptidi sono stati separati dal tampone B al 6% al 31% per 65 minuti e dal tampone B al 31% al 50% per 5 minuti con un gradiente di 200 nl/min. I peptidi eluiti sono stati analizzati con uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). La misurazione del rapporto m/z del precursore peptidico è stata eseguita con una risoluzione di 120.000 nell'intervallo da 350 a 1500 m/z. Utilizzando un'energia di collisione normalizzata al 27%, il precursore più forte con uno stato di carica da 2 a 6 è stato selezionato per la scissione con dissociazione ad alta energia C-trap (HCD). Il tempo di ciclo è stato impostato su 1 s. Il valore m/z del frammento peptidico è stato misurato nella trappola ionica utilizzando il target AGC più piccolo di 5×104 e il tempo di iniezione massimo di 86 ms. Dopo la frammentazione, il precursore è stato inserito nella lista di esclusione dinamica per 45 s. I peptidi marcati con TMT sono stati separati su una colonna Acclaim PepMap da 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, numero di catalogo 164942) e gli spettri di migrazione sono stati analizzati su uno spettrometro di massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) dotato di un'apparecchiatura FAIMS (High-Field Asymmetric Waveform Ion) (Thermo Fisher Scientific) che opera a due tensioni di compensazione di -50 e -70 V. Per la misurazione del segnale ionico del report TMT viene utilizzato MS3, selezionato in base al precursore di sincronizzazione. La separazione dei peptidi è stata effettuata su EASY-nLC 1200, utilizzando un'eluizione a gradiente lineare al 90%, con una concentrazione del tampone dal 6% al 31%; il tampone A era allo 0,1% di FA e il tampone B era allo 0,1% di FA e all'80% di ACN. La colonna analitica è stata utilizzata a 50 °C. Utilizzare FreeStyle (versione 1.6, Thermo Fisher Scientific) per dividere il file originale in base alla tensione di compensazione FAIMS.
Identificazione e quantificazione delle proteine. Utilizzando il motore di ricerca integrato Andromeda, i dati originali sono stati analizzati utilizzando MaxQuant versione 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Oltre alle sequenze di ricombinasi Cre e YFP ottenute da Aequorea victoria, sono stati ricercati spettri di frammenti peptidici per la sequenza canonica e la sequenza isoforma del proteoma di riferimento del topo (Proteome ID UP000000589, scaricato da UniProt a maggio 2017). L'ossidazione della metionina e l'acetilazione N-terminale delle proteine ​​sono state impostate come modifiche variabili; la metilazione della cisteina carbamoil è stata impostata come modifiche fisse. I parametri di digestione sono impostati su "specificità" e "tripsina/P". Il numero minimo di peptidi e peptidi rasoio utilizzati per l'identificazione delle proteine ​​è 1; il numero minimo di peptidi univoci è 0. Nelle condizioni di corrispondenza della mappa peptidica, il tasso di identificazione delle proteine ​​è stato di 0,01. L'opzione "Secondo Peptide" è abilitata. Utilizzare l'opzione "Corrispondenza tra esecuzioni" per trasferire le identificazioni corrette tra diversi file originali. Utilizzare il rapporto minimo LFQ di conteggio 1 per la quantificazione senza etichetta (LFQ) (60). L'intensità LFQ viene filtrata per almeno due valori validi in almeno un gruppo di genotipi a ogni punto temporale ed è estrapolata da una distribuzione normale con un'ampiezza di 0,3 e una deviazione di 1,8. Utilizzare la piattaforma di calcolo Perseus (https://maxquant.net/perseus/) e R (https://r-project.org/) per analizzare i risultati LFQ. Un test t moderato a due vie del pacchetto software limma è stato utilizzato per l'analisi dell'espressione differenziale (61). L'analisi esplorativa dei dati viene eseguita utilizzando ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally e pheatmap. I dati proteomici basati su TMT sono stati analizzati utilizzando MaxQuant versione 1.6.10.43. Cerca dati proteomici grezzi dal database di proteomica umana di UniProt, scaricato a settembre 2018. L'analisi include il fattore di correzione della purezza isotopica fornito dal produttore. Utilizza limma in R per l'analisi dell'espressione differenziale. I dati originali, i risultati della ricerca nel database, il flusso di lavoro e i risultati dell'analisi dei dati sono tutti archiviati nell'alleanza ProteomeXchange tramite il repository dei partner PRIDE con l'identificativo del set di dati PXD019690.
Le annotazioni funzionali arricchiscono l'analisi. Lo strumento Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) è stato utilizzato per determinare la ricchezza dei termini di annotazione funzionale del set di dati a 8 settimane (Figura 1). In breve, l'elenco proteico quantitativo ottenuto dall'analisi dei dati LC-MS/MS (spettrometria di massa tandem) viene utilizzato con i seguenti criteri di filtro: Mus musculus viene selezionato come specie e background, e la categoria mostra il valore di P corretto da Benjamini per un arricchimento pari o inferiore a 0,05 considerato significativo. Per questo grafico, vengono mostrate le prime cinque categorie in eccesso in ciascun cluster in base al valore di P corretto. Utilizzando il test t multiplo, utilizzando il programma di boost lineare a due stadi di Benjamini, Krieger e Yekutieli (Q = 5%), l'analisi dell'espressione proteica nel tempo viene eseguita sui candidati importanti identificati in ciascuna categoria e ogni riga viene analizzata separatamente. Non è necessario adottare una deviazione standard coerente.
Per confrontare i risultati di questo studio con i database pubblicati e generare un diagramma di Venn in Figura 1, abbiamo combinato l'elenco proteico quantitativo con le annotazioni di MitoCarta 2.0 (24). Utilizzare lo strumento online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) per generare il diagramma.
Per informazioni dettagliate sulle procedure statistiche utilizzate per l'analisi proteomica, si prega di fare riferimento alla sezione corrispondente di Materiali e Metodi. Per tutti gli altri esperimenti, informazioni dettagliate sono disponibili nella legenda corrispondente. Salvo diversa indicazione, tutti i dati sono espressi come media ± SEM e tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software GraphPad Prism 8.1.2.
Per materiali supplementari per questo articolo, vedere http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
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Di E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'analisi proteomica dei neuroni disfunzionali ha rivelato che i programmi metabolici vengono attivati ​​per contrastare la neurodegenerazione.
Di E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
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