I metaboliti immunomodulatori sono una caratteristica chiave del microambiente tumorale (TME), ma, a parte poche eccezioni, la loro identità rimane in gran parte sconosciuta. In questo studio, abbiamo analizzato tumori e cellule T provenienti da tumori e asciti di pazienti con carcinoma sieroso di alto grado (HGSC) per rivelare il metaboloma di questi diversi compartimenti del TME. Asciti e cellule tumorali presentano notevoli differenze nei metaboliti. Rispetto all'ascite, le cellule T che infiltrano il tumore sono significativamente arricchite in 1-metilnicotinamide (MNA). Sebbene il livello di MNA nelle cellule T sia elevato, l'espressione della nicotinamide N-metiltransferasi (un enzima che catalizza il trasferimento dei gruppi metilici dalla S-adenosilmetionina alla nicotinamide) è limitata ai fibroblasti e alle cellule tumorali. Funzionalmente, l'MNA induce le cellule T a secernere la citochina tumorale alfa. Pertanto, l'MNA derivato dal TME contribuisce alla regolazione immunitaria delle cellule T e rappresenta un potenziale bersaglio dell'immunoterapia per il trattamento del cancro umano.
I metaboliti derivati ​​dal tumore possono avere un profondo effetto inibitorio sull'immunità antitumorale e sempre più prove dimostrano che possono anche fungere da forza trainante chiave per la progressione della malattia (1). Oltre all'effetto Warburg, recenti studi hanno iniziato a caratterizzare lo stato metabolico delle cellule tumorali e la sua relazione con lo stato immunitario del microambiente tumorale (TME). Studi su modelli murini e cellule T umane hanno dimostrato che il metabolismo della glutammina (2), il metabolismo ossidativo (3) e il metabolismo del glucosio (4) possono agire indipendentemente su vari sottogruppi di cellule immunitarie. Diversi metaboliti in queste vie inibiscono la funzione antitumorale delle cellule T. È stato dimostrato che il blocco del coenzima tetraidrobiopterina (BH4) può danneggiare la proliferazione delle cellule T e l'aumento di BH4 nell'organismo può potenziare la risposta immunitaria antitumorale mediata da CD4 e CD8. Inoltre, l'effetto immunosoppressivo della chinurenina può essere ripristinato dalla somministrazione di BH4 (5). Nel glioblastoma mutante con isocitrato deidrogenasi (IDH), la secrezione di (R)-2-idrossiglutarato enantiometabolico (R-2-HG) inibisce l'attivazione, la proliferazione e l'attività citolitica delle cellule T (6). Recentemente, è stato dimostrato che il metilgliossale, un sottoprodotto della glicolisi, è prodotto dalle cellule soppressorie di origine mieloide e che il trasferimento del metilgliossale alle cellule T può inibire la funzione delle cellule T effettrici. Nel trattamento, la neutralizzazione del metilgliossale può superare l'attività delle cellule soppressorie di origine mieloide (MDSC) e potenziare sinergicamente la terapia di blocco dei checkpoint nei modelli murini (7). Questi studi sottolineano collettivamente il ruolo chiave dei metaboliti derivati ​​dal TME nella regolazione della funzione e dell'attività delle cellule T.
La disfunzione delle cellule T è stata ampiamente segnalata nel carcinoma ovarico (8). Ciò è in parte dovuto alle caratteristiche metaboliche insite nell'ipossia e nella vascolarizzazione tumorale anomala (9), che determina la conversione di glucosio e triptofano in sottoprodotti come acido lattico e chinurenina. Un eccesso di lattato extracellulare riduce la produzione di interferone-γ (IFN-γ) e guida la differenziazione di sottogruppi mielosoppressivi (10, 11). Il consumo di triptofano inibisce direttamente la proliferazione delle cellule T e inibisce la segnalazione del recettore delle cellule T (12-14). Nonostante queste osservazioni, molti studi sul metabolismo immunitario sono stati condotti su colture di cellule T in vitro utilizzando terreni ottimizzati, o limitati a modelli murini omologhi in vivo, nessuno dei quali riflette pienamente l'eterogeneità dei tumori umani e dell'ambiente macro e micro fisiologico.
Una caratteristica comune del carcinoma ovarico è la diffusione peritoneale e la comparsa di ascite. L'accumulo di liquido cellulare nell'ascite è associato a malattia avanzata e prognosi sfavorevole (15). Secondo alcuni studi, questo compartimento unico è ipossico, presenta alti livelli di fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e indoleamina 2,3-diossigenasi (IDO) ed è infiltrato da cellule T regolatrici e cellule mieloidi inibitorie (15-18). L'ambiente metabolico dell'ascite può essere diverso da quello del tumore stesso, quindi la riprogrammazione delle cellule T nello spazio peritoneale non è chiara. Inoltre, le principali differenze e l'eterogeneità tra ascite e metaboliti presenti nell'ambiente tumorale possono ostacolare l'infiltrazione delle cellule immunitarie e la loro funzione sui tumori, e sono necessarie ulteriori ricerche.
Per risolvere questi problemi, abbiamo progettato un metodo sensibile di separazione cellulare e spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida (LC-MS/MS) per studiare diversi tipi cellulari (inclusi i linfociti T CD4+ e CD8+), nonché all'interno e tra tumori. I suoi metaboliti si estendono alle cellule dello stesso ambiente ascite-tumorale del paziente. Utilizziamo questo metodo in combinazione con la citometria a flusso ad alta dimensionalità e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) per fornire un ritratto ad alta risoluzione dello stato metabolico di queste popolazioni chiave. Questo metodo ha rivelato un aumento significativo del livello di 1-metilnicotinamide (MNA) nei linfociti T tumorali, e esperimenti in vitro hanno dimostrato che l'effetto immunomodulatore dell'MNA sulla funzione dei linfociti T era precedentemente sconosciuto. In generale, questo metodo rivela le interazioni metaboliche reciproche tra tumori e cellule immunitarie e fornisce informazioni uniche sui metaboliti della regolazione immunitaria, che possono essere utili per il trattamento dell'immunoterapia basata sui linfociti T del carcinoma ovarico.
Abbiamo utilizzato la citometria a flusso ad alta dimensionalità per quantificare simultaneamente l'assorbimento del glucosio [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)ammino)-2-desossiglucosio (2-NBDG) e l'attività mitocondriale [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) sono marcatori tipici affiancati che distinguono le cellule immunitarie e le popolazioni di cellule tumorali (Tabella S2 e Figura S1A). Questa analisi ha mostrato che, rispetto alle cellule T, le asciti e le cellule tumorali hanno livelli di assorbimento del glucosio più elevati, ma presentano differenze minori nell'attività mitocondriale. L'assorbimento medio di glucosio delle cellule tumorali [CD45-EpCAM (EpCAM)+] è da tre a quattro volte superiore a quello delle cellule T, e l'assorbimento medio di glucosio delle cellule T CD4+ è 1,2 volte superiore a quello delle cellule T CD8+, il che indica che i linfociti infiltranti il ​​tumore (TIL) hanno requisiti metabolici diversi anche nello stesso TME (Figura 1A). Al contrario, l'attività mitocondriale nelle cellule tumorali è simile a quella delle cellule T CD4+, e l'attività mitocondriale di entrambi i tipi cellulari è superiore a quella delle cellule T CD8+ (Figura 1B). In generale, questi risultati rivelano il livello metabolico. L'attività metabolica delle cellule tumorali è superiore a quella delle cellule T CD4+, e l'attività metabolica delle cellule T CD4+ è superiore a quella delle cellule T CD8+. Nonostante questi effetti tra i tipi cellulari, non vi è alcuna differenza coerente nello stato metabolico delle cellule T CD4+ e CD8+ o nelle loro proporzioni relative nell'ascite rispetto ai tumori (Figura 1C). Al contrario, nella frazione di cellule CD45, la proporzione di cellule EpCAM+ nel tumore è aumentata rispetto all'ascite (Figura 1D). Abbiamo anche osservato una chiara differenza metabolica tra le componenti cellulari EpCAM+ ed EpCAM-. Le cellule EpCAM+ (tumorali) presentano un assorbimento di glucosio e un'attività mitocondriale più elevati rispetto alle cellule EpCAM-, che sono molto più elevati dell'attività metabolica dei fibroblasti nelle cellule tumorali nella TME (Figura 1, E e F).
(A e B) Intensità di fluorescenza mediana (MFI) dell'assorbimento del glucosio (2-NBDG) (A) e attività mitocondriale delle cellule T CD4 + (MitoTracker rosso scuro) (B) Grafici rappresentativi (sinistra) e dati tabulati (destra), cellule T CD8 + e cellule tumorali EpCAM + CD45 da ascite e tumore. (C) Il rapporto tra cellule CD4 + e CD8 + (di cellule T CD3 +) in ascite e tumore. (D) Proporzione di cellule tumorali EpCAM + in ascite e tumore (CD45−). (E e F) EpCAM + CD45-tumore e EpCAM-CD45-matrice assorbimento del glucosio (2-NBDG) (E) e attività mitocondriale (MitoTracker rosso scuro) (F) grafici rappresentativi (sinistra) e dati tabulati (destra) Ascite e cellule tumorali. (G) Grafici rappresentativi dell'espressione di CD25, CD137 e PD1 mediante citometria a flusso. (H e I) Espressione di CD25, CD137 e PD1 su cellule T CD4+ (H) e cellule T CD8+ (I). (J e K) Fenotipi naive, a memoria centrale (Tcm), effettore (Teff) e a memoria effettrice (Tem) basati sull'espressione di CCR7 e CD45RO. Immagini rappresentative (sinistra) e dati tabulari (destra) di cellule T CD4+ (J) e cellule T CD8+ (K) in asciti e tumori. Valori di p determinati mediante t-test appaiato (*P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). La linea rappresenta i pazienti abbinati (n = 6). FMO, fluorescenza meno uno; MFI, intensità di fluorescenza mediana.
Ulteriori analisi hanno rivelato altre differenze significative tra lo stato fenotipico delle cellule T altamente risolto. La memoria attivata (Figura 1, da G a I) e quella effettrice (Figura 1, J e K) nei tumori sono molto più frequenti rispetto all'ascite (proporzione di cellule T CD3+). Analogamente, l'analisi del fenotipo mediante l'espressione di marcatori di attivazione (CD25 e CD137) e marcatori di deplezione [proteina della morte cellulare programmata 1 (PD1)] ha mostrato che, sebbene le caratteristiche metaboliche di queste popolazioni siano diverse (Figura S1, da B a E), non sono state osservate differenze metaboliche significative in modo coerente tra i sottogruppi naive, effettori o di memoria (Figura S1, da F a I). ​​Questi risultati sono stati confermati utilizzando metodi di apprendimento automatico per assegnare automaticamente i fenotipi cellulari (21), che hanno ulteriormente rivelato la presenza di un gran numero di cellule del midollo osseo (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) nell'ascite del paziente (Figura S2A). Tra tutti i tipi cellulari identificati, questa popolazione di cellule mieloidi ha mostrato il più elevato assorbimento di glucosio e la più elevata attività mitocondriale (Figura S2, da B a G). Questi risultati evidenziano le forti differenze metaboliche tra i diversi tipi cellulari riscontrati nell'ascite e nei tumori nei pazienti con HGSC.
La sfida principale nella comprensione delle caratteristiche metabonomiche del TIL è la necessità di isolare campioni di cellule T di purezza, qualità e quantità sufficienti dai tumori. Studi recenti hanno dimostrato che i metodi di selezione e arricchimento delle microsfere basati sulla citometria a flusso possono portare a modifiche nei profili dei metaboliti cellulari (22-24). Per superare questo problema, abbiamo ottimizzato il metodo di arricchimento delle microsfere per isolare e isolare il TIL da carcinoma ovarico umano resecato chirurgicamente prima dell'analisi mediante LC-MS/MS (vedere Materiali e Metodi; Figura 2A). Per valutare l'impatto complessivo di questo protocollo sulle modifiche dei metaboliti, abbiamo confrontato i profili metabolici delle cellule T attivate da donatori sani dopo la suddetta fase di separazione delle microsfere con cellule che non erano state separate dalle microsfere ma erano rimaste in ghiaccio. Questa analisi di controllo qualità ha rilevato un'elevata correlazione tra queste due condizioni (r = 0,77) e la ripetibilità tecnica del gruppo di 86 metaboliti presenta un'elevata ripetibilità (Figura 2B). Pertanto, questi metodi possono eseguire un'analisi accurata dei metaboliti nelle cellule sottoposte ad arricchimento del tipo cellulare, fornendo così la prima piattaforma ad alta risoluzione per l'identificazione di metaboliti specifici nelle HGSC, consentendo così alle persone di acquisire una comprensione più approfondita della specificità cellulare del programma del metabolismo sessuale.
(A) Diagramma schematico dell'arricchimento con biglie magnetiche. Prima dell'analisi mediante LC-MS/MS, le cellule saranno sottoposte a tre cicli consecutivi di arricchimento con biglie magnetiche o rimarranno in ghiaccio. (B) Effetto del tipo di arricchimento sull'abbondanza di metaboliti. Media di tre misurazioni per ciascun tipo di arricchimento ± SE. La linea grigia rappresenta una relazione 1:1. La correlazione intra-classe (ICC) di misurazioni ripetute è mostrata nell'etichetta dell'asse. NAD, nicotinamide adenina dinucleotide. (C) Diagramma schematico del flusso di lavoro dell'analisi dei metaboliti dei pazienti. Asciti o tumori vengono raccolti dai pazienti e crioconservati. Una piccola porzione di ciascun campione è stata analizzata mediante citometria a flusso, mentre i campioni rimanenti sono stati sottoposti a tre cicli di arricchimento per cellule CD4+, CD8+ e CD45-. Queste frazioni cellulari sono state analizzate mediante LC-MS/MS. (D) Mappa termica dell'abbondanza standardizzata dei metaboliti. Il dendrogramma rappresenta il clustering di Ward delle distanze euclidee tra i campioni. (E) Analisi delle componenti principali (PCA) della mappa dei metaboliti del campione, che mostra tre repliche di ciascun campione; i campioni dello stesso paziente sono collegati da una linea. (F) PCA del profilo metabolico del campione condizionato al paziente (ovvero, utilizzando la ridondanza parziale); il tipo di campione è limitato dall'involucro convesso. PC1, componente principale 1; PC2, componente principale 2.
Successivamente, abbiamo applicato questo metodo di arricchimento per analizzare 99 metaboliti nelle frazioni cellulari CD4+, CD8+ e CD45- nelle asciti primarie e nei tumori di sei pazienti con HGSC (Figura 2C, Figura S3A e Tabelle S3 e S4). La popolazione di interesse rappresenta dal 2% al 70% dell'ampio campione originale di cellule viventi e la proporzione di cellule varia notevolmente tra i pazienti. Dopo la separazione delle microsfere, la frazione arricchita di interesse (CD4+, CD8+ o CD45-) rappresenta in media oltre l'85% di tutte le cellule viventi nel campione. Questo metodo di arricchimento ci consente di analizzare popolazioni cellulari provenienti dal metabolismo del tessuto tumorale umano, cosa impossibile da fare con campioni di grandi dimensioni. Utilizzando questo protocollo, abbiamo determinato che L-chinurenina e adenosina, questi due metaboliti immunosoppressori ben caratterizzati, erano elevati nelle cellule T tumorali o nelle cellule tumorali (Figure S3, B e C). Pertanto, questi risultati dimostrano la fedeltà e la capacità della nostra tecnologia di separazione cellulare e spettrometria di massa di individuare metaboliti biologicamente importanti nei tessuti dei pazienti.
La nostra analisi ha inoltre rivelato una forte separazione metabolica dei tipi cellulari all'interno e tra i pazienti (Figura 2D e Figura S4A). In particolare, rispetto ad altri pazienti, il paziente 70 ha mostrato caratteristiche metaboliche diverse (Figura 2E e Figura S4B), indicando che potrebbe esserci una sostanziale eterogeneità metabolica tra i pazienti. È opportuno notare che, rispetto ad altri pazienti (da 1,2 a 2 litri; Tabella S1), la quantità totale di ascite raccolta nel paziente 70 (80 ml) era inferiore. Il controllo dell'eterogeneità inter-paziente durante l'analisi delle componenti principali (ad esempio, utilizzando l'analisi di ridondanza parziale) mostra cambiamenti coerenti tra i tipi cellulari, e i tipi cellulari e/o il microambiente sono chiaramente aggregati in base al profilo metabolico (Figura 2F). L'analisi dei singoli metaboliti ha enfatizzato questi effetti e ha rivelato differenze significative tra i tipi cellulari e il microambiente. Vale la pena notare che la differenza più estrema osservata riguarda l'MNA, che è solitamente arricchito nelle cellule CD45- e nelle cellule CD4+ e CD8+ che infiltrano il tumore (Figura 3A). Per le cellule CD4+, questo effetto è più evidente e anche l'MNA nelle cellule CD8+ sembra essere fortemente influenzato dall'ambiente. Tuttavia, questo non è importante, poiché solo tre dei sei pazienti possono essere valutati per i punteggi CD8+ tumorali. Oltre all'MNA, in diversi tipi di cellule in ascite e tumori, anche altri metaboliti scarsamente caratterizzati nel TIL sono differenzialmente ricchi (Figure S3 e S4). Pertanto, questi dati rivelano un promettente set di metaboliti immunomodulatori per ulteriori ricerche.
(A) Contenuto normalizzato di MNA nelle cellule CD4+, CD8+ e CD45- da ascite e tumore. Il box plot mostra la mediana (linea), l'intervallo interquartile (cerniera di frame) e l'intervallo dei dati, fino a 1,5 volte l'intervallo interquartile (baffi di frame). Come descritto in Materiali e metodi per i pazienti, utilizzare il valore di limma del paziente per determinare il valore P (*P<0,05 e **P<0,01). (B) Diagramma schematico del metabolismo di MNA (60). Metaboliti: S-adenosil-1-metionina; SAH, S-adenosina-1-omocisteina; NA, nicotinamide; MNA, 1-metilnicotinamide; 2-PY, 1-metil-2-piridone-5-carbossamide; 4-PY, 1-metil-4-piridone-5-carbossamide; NR, nicotinamide ribosio; NMN, nicotinamide mononucleotide. Enzimi (verde): NNMT, nicotinamide N-metiltransferasi; SIRT, sirtuine; NAMPT, nicotinamide fosforibosil transferasi; AOX1, aldeide ossidasi 1; NRK, nicotinamide riboside chinasi; NMNAT, nicotinamide mononucleotide adenilato transferasi; Pnp1, purina nucleoside fosforilasi. (C) t-SNE di scRNA-seq di ascite (grigio) e tumore (rosso; n = 3 pazienti). (D) Espressione di NNMT in diverse popolazioni cellulari identificate utilizzando scRNA-seq. (E) Espressione di NNMT e AOX1 in SK-OV-3, rene embrionale umano (HEK) 293T, cellule T e cellule T trattate con MNA. L'espressione ripiegata è mostrata in relazione a SK-OV-3. Viene mostrato il pattern di espressione con SEM (n = 6 donatori sani). I valori di Ct superiori a 35 sono considerati non rilevabili (UD). (F) Espressione di SLC22A1 e SLC22A2 in SK-OV-3, HEK293T, cellule T e cellule T trattate con 8 mM MNA. L'espressione ripiegata è mostrata rispetto a SK-OV-3. Viene mostrato il pattern di espressione con SEM (n = 6 donatori sani). I valori di Ct superiori a 35 sono considerati non rilevabili (UD). (G) Contenuto cellulare di MNA in cellule T di donatori sani attivati ​​dopo 72 ore di incubazione con MNA. Viene mostrato il pattern di espressione con SEM (n = 4 donatori sani).
L'MNA viene prodotto trasferendo il gruppo metilico dalla S-adenosil-1-metionina (SAM) alla nicotinamide (NA) tramite la nicotinamide N-metiltransferasi (NNMT; Figura 3B). L'NNMT è sovraespresso in una varietà di tumori umani ed è associato a proliferazione, invasione e metastasi (25-27). Per comprendere meglio la fonte dell'MNA nelle cellule T nella TME, abbiamo utilizzato scRNA-seq per caratterizzare l'espressione di NNMT in diversi tipi cellulari nell'ascite e nei tumori di tre pazienti con HGSC (Tabella S5). L'analisi di circa 6.500 cellule ha mostrato che nell'ascite e nell'ambiente tumorale, l'espressione di NNMT era limitata alle presunte popolazioni di fibroblasti e cellule tumorali (Figura 3, C e D). Vale la pena notare che non vi è alcuna espressione ovvia di NNMT in nessuna popolazione che esprime PTPRC (CD45 +) (Figura 3D e Figura S5A), il che indica che l'MNA rilevato nello spettro dei metaboliti è stato introdotto nelle cellule T. L'espressione dell'aldeide ossidasi 1 (AOX1) converte l'MNA in 1-metil-2-piridone-5-carbossamide (2-PYR) o 1-metil-4-piridone-5-carbossamide (4-PYR); Figura 3B) è anche limitata alla popolazione di fibroblasti che esprimono COL1A1 (Figura S5A), che insieme indicano che le cellule T non hanno la capacità di metabolizzare l'MNA convenzionale. Il modello di espressione di questi geni correlati all'MNA è stato verificato utilizzando un secondo set di dati cellulari indipendenti da asciti di pazienti con HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Inoltre, l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) di cellule T di donatori sani trattati con MNA ha mostrato che, rispetto alle cellule tumorali ovariche SK-OV-3 di controllo, NNMT o AOX1 non erano quasi espressi (Figura 3E). Questi risultati inattesi indicano che l'MNA potrebbe essere secreto dai fibroblasti o dai tumori nelle cellule T adiacenti nella TME.
Sebbene i candidati includano la famiglia di trasportatori di cationi organici da 1 a 3 (OCT1, OCT2 e OCT3) codificati dalla famiglia di trasportatori solubili 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 e SLC22A3), i potenziali trasportatori di MNA sono ancora indefiniti (28). La QPCR dell'mRNA da cellule T di donatori sani ha mostrato bassi livelli di espressione di SLC22A1 ma livelli non rilevabili di SLC22A2, il che ha confermato che era stato precedentemente riportato in letteratura (Figura 3F) (29). Al contrario, la linea cellulare del tumore ovarico SK-OV-3 ha espresso alti livelli di entrambi i trasportatori (Figura 3F).
Per testare la possibilità che le cellule T abbiano la capacità di assorbire MNA estraneo, cellule T sane di donatori sono state coltivate per 72 ore in presenza di diverse concentrazioni di MNA. In assenza di MNA esogeno, il contenuto cellulare di MNA non può essere rilevato (Figura 3G). Tuttavia, le cellule T attivate trattate con MNA esogeno hanno mostrato un aumento dose-dipendente del contenuto di MNA nelle cellule, fino a 6 mM di MNA (Figura 3G). Questo risultato indica che, nonostante il basso livello di espressione del trasportatore e la mancanza del principale enzima responsabile del metabolismo intracellulare dell'MNA, le cellule TIL possono ancora assorbire l'MNA.
Lo spettro di metaboliti nelle cellule T dei pazienti e gli esperimenti di assorbimento di MNA in vitro aumentano la possibilità che i fibroblasti associati al cancro (CAF) secernono MNA e che le cellule tumorali possano regolare il fenotipo e la funzione del TIL. Per determinare l'effetto dell'MNA sulle cellule T, le cellule T di donatori sani sono state attivate in vitro in presenza o assenza di MNA e ne sono state valutate la proliferazione e la produzione di citochine. Dopo 7 giorni di aggiunta di MNA alla dose più elevata, il numero di raddoppio della popolazione è stato moderatamente ridotto, mentre il vigore è stato mantenuto a tutte le dosi (Figura 4A). Inoltre, il trattamento con MNA esogeno ha determinato un aumento della proporzione di cellule T CD4+ e CD8+ che esprimono il fattore di necrosi tumorale-α (TNFα; Figura 4B). Al contrario, la produzione intracellulare di IFN-γ è risultata significativamente ridotta nelle cellule T CD4+, ma non in quelle CD8+, e non si è osservata alcuna variazione significativa nell'interleuchina 2 (IL-2; Figura 4, C e D). Pertanto, il test immunoenzimatico (ELISA) dei surnatanti di queste colture di cellule T trattate con MNA ha mostrato un aumento significativo di TNFα, una diminuzione di IFN-γ e nessuna variazione di IL-2 (Figura 4, da E a G). La diminuzione di IFN-γ indica che l'MNA può svolgere un ruolo nell'inibizione dell'attività antitumorale delle cellule T. Per simulare l'effetto dell'MNA sulla citotossicità mediata dalle cellule T, le cellule T con recettore antigenico chimerico (FRα-CAR-T) che prendono di mira il recettore α del folato e le cellule CAR-T (GFP) regolate dalla proteina fluorescente verde (GFP) (CAR-T) sono prodotte da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di donatori sani. Le cellule CAR-T sono state coltivate per 24 ore in presenza di MNA e poi co-coltivate con cellule tumorali ovariche umane SK-OV-3 che esprimono il recettore del folato α con un rapporto effettore/bersaglio di 10:1. Il trattamento con MNA ha determinato una significativa diminuzione dell'attività di uccisione delle cellule FRα-CAR-T, simile a quella delle cellule FRα-CAR-T trattate con adenosina (Figura 4H).
(A) Conta totale delle cellule vitali e raddoppio della popolazione (PD) direttamente dalla coltura al giorno 7. Il grafico a barre rappresenta la media + SEM di sei donatori sani. Rappresenta i dati di almeno n = 3 esperimenti indipendenti. (B a D) CD3/CD28 e IL-2 sono stati utilizzati per attivare le cellule T alle rispettive concentrazioni di MNA per 7 giorni. Prima dell'analisi, le cellule sono state stimolate con PMA/ionomicina con GolgiStop per 4 ore. Espressione di TNFα (B) nelle cellule T. Immagine di esempio (sinistra) e dati tabulari (destra) dell'espressione di TNFα in cellule viventi. Espressione di IFN-γ (C) e IL-2 (D) nelle cellule T. L'espressione delle citochine è stata misurata mediante citometria a flusso. Il grafico a barre rappresenta la media (n = 6 donatori sani) + SEM. Utilizzare l'analisi della varianza a una via e misure ripetute (*P<0,05 e **P<0,01) per determinare il valore di P. Rappresenta i dati di almeno n = 3 esperimenti indipendenti. (E a ​​G) CD3/CD28 e IL-2 sono stati utilizzati per attivare le cellule T alle rispettive concentrazioni di MNA per 7 giorni. Il terreno è stato raccolto prima e dopo 4 ore di stimolazione con PMA/ionomicina. Le concentrazioni di TNFα (E), IFN-γ (F) e IL-2 (G) sono state misurate mediante ELISA. Il grafico a barre rappresenta la media (n = 5 donatori sani) + SEM. Il valore di P è stato determinato utilizzando l'analisi della varianza a una via e misurazioni ripetute (*P < 0,05). La linea tratteggiata indica il limite di rilevamento della rilevazione. (H) Saggio di lisi cellulare. Le cellule FRα-CAR-T o GFP-CAR-T sono state aggiustate con adenosina (250 μM) o MNA (10 mM) per 24 ore, oppure lasciate non trattate (Ctrl). È stata misurata la percentuale di uccisione delle cellule SK-OV-3. Valore p determinato dal test t di Welch (*P<0,5 e **P<0,01).
Per comprendere in modo più approfondito la regolazione dell'espressione di TNFα dipendente da MNA, sono state valutate le variazioni dell'mRNA di TNFα nelle cellule T trattate con MNA (Figura 5A). Le cellule T sane dei donatori trattate con MNA hanno mostrato un aumento di due volte dei livelli di trascrizione di TNFα, indicando che MNA dipende dalla regolazione trascrizionale di TNFα. Per indagare questo possibile meccanismo regolatorio, due fattori di trascrizione noti che regolano TNFα, ovvero il fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) e la proteina specifica 1 (Sp1), sono stati valutati in risposta al legame di MNA al promotore prossimale di TNFα (30). Il promotore di TNFα contiene 6 siti di legame NFAT identificati e 2 siti di legame Sp1, sovrapposti in un sito [-55 paia di basi (bp) dal 5'cap] (30). L'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) ha mostrato che, quando trattate con MNA, il legame di Sp1 al promotore di TNFα è triplicato. Anche l'incorporazione di NFAT è aumentata e ha acquisito importanza (Figura 5B). Questi dati indicano che l'MNA regola l'espressione di TNFα attraverso la trascrizione di Sp1 e, in misura minore, l'espressione di NFAT.
(A) Rispetto alle cellule T coltivate senza MNA, variazione dell'espressione di TNFα nelle cellule T trattate con MNA. È mostrato il pattern di espressione con SEM (n = 5 donatori sani). Rappresenta i dati di almeno n = 3 esperimenti indipendenti. (B) Il promotore di TNFα delle cellule T trattate con o senza 8 mM di MNA dopo NFAT e Sp1 sono stati combinati con (Ctrl) e stimolazione con PMA/ionomicina per 4 ore. L'immunoglobulina G (IgG) e H3 sono state utilizzate rispettivamente come controlli negativi e positivi per l'immunoprecipitazione. La quantificazione di ChIP ha mostrato che il legame di Sp1 e NFAT al promotore di TNFα nelle cellule trattate con MNA è aumentato di diverse volte rispetto al controllo. Rappresenta i dati di almeno n = 3 esperimenti indipendenti. Valore di P determinato da t-test multipli (*** P <0,01). (C) Rispetto all'ascite di HGSC, le cellule T (non citotossiche) hanno mostrato un'espressione aumentata di TNF nel tumore. I colori rappresentano pazienti diversi. Le cellule visualizzate sono state campionate casualmente a 300 e modificate per limitare il sovradisegno (** Padj = 0,0076). (D) Modello proposto di MNA per il cancro ovarico. L'MNA è prodotto nelle cellule tumorali e nei fibroblasti nel TME e viene assorbito dalle cellule T. L'MNA aumenta il legame di Sp1 al promotore del TNFα, portando a un aumento della trascrizione del TNFα e alla produzione di citochine del TNFα. L'MNA causa anche una diminuzione dell'IFN-γ. L'inibizione della funzione delle cellule T porta a una ridotta capacità di uccisione e a un'accelerazione della crescita tumorale.
Secondo alcuni studi, il TNFα ha effetti antitumorali e antitumorali dipendenti dal recettore anteriore e posteriore, ma ha un ruolo ben noto nel promuovere la crescita e la metastasi del cancro ovarico (31-33). Secondo alcuni studi, la concentrazione di TNFα nell'ascite e nei tessuti tumorali nelle pazienti con cancro ovarico è superiore a quella nei tessuti benigni (34-36). In termini di meccanismo, il TNFα può regolare l'attivazione, la funzione e la proliferazione dei globuli bianchi e modificare il fenotipo delle cellule tumorali (37, 38). In linea con questi risultati, l'analisi dell'espressione genica differenziale ha mostrato che il TNF era significativamente sovraregolato nelle cellule T nei tessuti tumorali rispetto alle asciti (Figura 5C). L'aumento dell'espressione del TNF era evidente solo nelle popolazioni di cellule T con un fenotipo non citotossico (Figura S5A). In sintesi, questi dati supportano l'ipotesi che l'MNA abbia un duplice effetto immunosoppressivo e di promozione del tumore nelle HGSC.
La marcatura fluorescente basata sulla citometria a flusso è diventata il metodo principale per studiare il metabolismo dei TIL. Questi studi hanno dimostrato che, rispetto ai linfociti del sangue periferico o alle cellule T degli organi linfoidi secondari, i TIL murini e umani presentano una maggiore tendenza all'assorbimento di glucosio (4, 39) e una graduale perdita della funzione mitocondriale (19, 40). Sebbene in questo studio abbiamo osservato risultati simili, lo sviluppo chiave consiste nel confrontare il metabolismo delle cellule tumorali e dei TIL provenienti dallo stesso tessuto tumorale resecato. In linea con alcuni di questi precedenti studi, le cellule tumorali (CD45-EpCAM+) provenienti da asciti e tumori presentano un assorbimento di glucosio maggiore rispetto alle cellule T CD8+ e CD4+, a supporto del fatto che l'elevato assorbimento di glucosio delle cellule tumorali può essere paragonato a quello delle cellule T. Il concetto di competizione delle cellule T. TME. Tuttavia, l'attività mitocondriale delle cellule tumorali è superiore a quella delle cellule T CD8+, ma l'attività mitocondriale è simile a quella delle cellule T CD4+. Questi risultati rafforzano il tema emergente secondo cui il metabolismo ossidativo è importante per le cellule tumorali (41, 42). Suggeriscono inoltre che le cellule T CD8+ potrebbero essere più suscettibili alla disfunzione ossidativa rispetto alle cellule T CD4+, o che le cellule T CD4+ potrebbero utilizzare fonti di carbonio diverse dal glucosio per mantenere l'attività mitocondriale (43, 44). Va notato che non abbiamo osservato alcuna differenza nell'assorbimento del glucosio o nell'attività mitocondriale tra le cellule effettori T CD4+, le cellule di memoria effettori T e le cellule di memoria centrale T nell'ascite. Analogamente, lo stato di differenziazione delle cellule T CD8+ nei tumori non ha nulla a che fare con i cambiamenti nell'assorbimento del glucosio, evidenziando la differenza significativa tra le cellule T coltivate in vitro e le cellule TIL umane in vivo (22). Queste osservazioni sono state confermate anche dall'uso dell'allocazione automatica imparziale della popolazione cellulare, che ha ulteriormente rivelato che le cellule CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ con un maggiore assorbimento del glucosio e attività mitocondriale rispetto alle cellule tumorali sono prevalenti ma hanno una popolazione cellulare metabolicamente attiva. Questa popolazione potrebbe rappresentare la presunta sottopopolazione di cellule soppressorie mieloidi o cellule dendritiche plasmacitoidi identificate nell'analisi scRNA-seq. Sebbene entrambe siano state segnalate nei tumori ovarici umani [45], necessitano ancora di ulteriori studi per descrivere questa sottopopolazione mieloide.
Sebbene i metodi basati sulla citometria a flusso possano chiarire le differenze generali nel metabolismo del glucosio e ossidativo tra i tipi cellulari, i metaboliti precisi prodotti dal glucosio o da altre fonti di carbonio per il metabolismo mitocondriale nella TME non sono ancora stati determinati. L'assegnazione della presenza o dell'assenza di metaboliti a un dato sottoinsieme di TIL richiede la purificazione della popolazione cellulare dal tessuto escisso. Pertanto, il nostro metodo di arricchimento cellulare combinato con la spettrometria di massa può fornire informazioni sui metaboliti che sono differenzialmente arricchiti nelle popolazioni di cellule T e tumorali in campioni di pazienti corrispondenti. Sebbene questo metodo presenti vantaggi rispetto al cell sorting attivato dalla fluorescenza, alcune librerie di metaboliti possono essere influenzate a causa della stabilità intrinseca e/o del rapido turnover (22). Ciononostante, il nostro metodo è stato in grado di identificare due metaboliti immunosoppressori riconosciuti, adenosina e chinurenina, poiché variano notevolmente tra i tipi di campione.
La nostra analisi metabonomica dei tumori e dei sottotipi di TIL fornisce ulteriori approfondimenti sul ruolo dei metaboliti nella TME ovarica. In primo luogo, utilizzando la citometria a flusso, abbiamo determinato che non vi era alcuna differenza nell'attività mitocondriale tra tumori e cellule T CD4+. Tuttavia, l'analisi LC-MS/MS ha rivelato variazioni significative nell'abbondanza di metaboliti tra queste popolazioni, indicando che le conclusioni sul metabolismo di TIL e sulla sua attività metabolica complessiva richiedono un'interpretazione attenta. In secondo luogo, l'MNA è il metabolita con la maggiore differenza tra cellule CD45 e cellule T nell'ascite, non nei tumori. Pertanto, la compartimentalizzazione e la localizzazione del tumore possono avere effetti diversi sul metabolismo di TIL, il che evidenzia la possibile eterogeneità in un dato microambiente. In terzo luogo, l'espressione dell'enzima NNMT che produce MNA è principalmente limitata al CAF, che è presente in misura minore nelle cellule tumorali, ma livelli rilevabili di MNA si osservano nelle cellule T derivate dal tumore. La sovraespressione di NNMT nel CAF ovarico ha un noto effetto promotore del cancro, in parte dovuto alla promozione del metabolismo del CAF, dell'invasione tumorale e delle metastasi (27). Sebbene il livello complessivo di TIL sia moderato, l'espressione di NNMT nel CAF è strettamente correlata al sottotipo mesenchimale del Cancer Genome Atlas (TCGA), associato a una prognosi sfavorevole (27, 46, 47). Infine, anche l'espressione dell'enzima AOX1 responsabile della degradazione dell'MNA è limitata alla popolazione CAF, il che indica che le cellule T non sono in grado di metabolizzare l'MNA. Questi risultati supportano l'idea che, sebbene siano necessari ulteriori studi per verificare questa scoperta, alti livelli di MNA nelle cellule T possano indicare la presenza di un microambiente immunosoppressivo nel CAF.
Considerati i bassi livelli di espressione dei trasportatori MNA e i livelli non rilevabili di proteine ​​chiave coinvolte nel metabolismo dell'MNA, la presenza di MNA nei linfociti T è inaspettata. Né NNMT né AOX1 sono stati rilevati mediante analisi scRNA-seq e qPCR mirata di due coorti indipendenti. Questi risultati indicano che l'MNA non viene sintetizzato dai linfociti T, ma assorbito dal TME circostante. Esperimenti in vitro mostrano che i linfociti T tendono ad accumulare MNA esogeno.
I nostri studi in vitro hanno dimostrato che l'MNA esogeno induce l'espressione del TNFα nelle cellule T e migliora il legame di Sp1 al promotore del TNFα. Sebbene il TNFα abbia sia funzioni antitumorali che antitumorali, nel carcinoma ovarico può promuovere la crescita del tumore (31-33). La neutralizzazione del TNFα nella coltura cellulare del tumore ovarico o l'eliminazione del segnale del TNFα nei modelli murini può migliorare la produzione di citochine infiammatorie mediata dal TNFα e inibire la crescita tumorale (32, 35). Pertanto, in questo caso, l'MNA derivato dal TME può agire come metabolita pro-infiammatorio attraverso un meccanismo dipendente dal TNFα attraverso il circuito autocrino, promuovendo così l'insorgenza e la diffusione del tumore ovarico (31). Sulla base di questa possibilità, il blocco del TNFα è in fase di studio come potenziale agente terapeutico per il carcinoma ovarico (37, 48, 49). Inoltre, l'MNA compromette la citotossicità delle cellule CAR-T nei confronti delle cellule tumorali ovariche, fornendo ulteriori prove dell'immunosoppressione mediata dall'MNA. Nel complesso, questi risultati suggeriscono un modello in cui i tumori e le cellule CAF secernono MNA nella TME extracellulare. Attraverso (i) la stimolazione della crescita del cancro ovarico indotta dal TNF e (ii) l'inibizione dell'attività citotossica delle cellule T indotta dall'MNA, ciò potrebbe avere un duplice effetto tumorale (Figura 5D).
In conclusione, applicando una combinazione di arricchimento cellulare rapido, sequenziamento di singole cellule e profilazione metabolica, questo studio ha rivelato le enormi differenze immunometabolomiche tra tumori e cellule ascitiche nei pazienti con HGSC. Questa analisi completa ha mostrato che esistono differenze nell'assorbimento del glucosio e nell'attività mitocondriale tra le cellule T e ha identificato l'MNA come un metabolita immunoregolatore non autonomo. Questi dati hanno un impatto su come la TME influisce sul metabolismo delle cellule T nei tumori umani. Sebbene sia stata segnalata la competizione diretta per i nutrienti tra cellule T e cellule tumorali, i metaboliti possono anche agire come regolatori indiretti per promuovere la progressione tumorale e possibilmente sopprimere le risposte immunitarie endogene. L'ulteriore descrizione del ruolo funzionale di questi metaboliti regolatori potrebbe aprire la strada a strategie alternative per potenziare la risposta immunitaria antitumorale.
I campioni dei pazienti e i dati clinici sono stati ottenuti tramite il deposito di tessuti tumorali della Columbia Britannica certificato dal Canadian Tissue Repository Network. In conformità con il protocollo approvato dal Comitato Etico per la Ricerca sul Cancro della Columbia Britannica e dall'Università della British Columbia (H07-00463), tutti i campioni e i dati clinici dei pazienti hanno ottenuto il consenso informato scritto o hanno formalmente rinunciato al consenso. I campioni sono conservati nella BioBank certificata (BRC-00290). Le caratteristiche dettagliate dei pazienti sono riportate nelle Tabelle S1 e S5. Per la crioconservazione, il campione tumorale del paziente viene scomposto meccanicamente con un bisturi e poi filtrato attraverso un filtro da 100 micron per ottenere una sospensione cellulare singola. L'ascite del paziente è stata centrifugata a 1500 rpm per 10 minuti a 4 °C per sedimentare le cellule e rimuovere il surnatante. Le cellule ottenute da tumore e ascite sono state crioconservate in siero umano AB inattivato termicamente al 50% (Sigma-Aldrich), RPMI-1640 al 40% (Thermo Fisher Scientific) e dimetilsolfossido al 10%. Queste sospensioni cellulari singole conservate sono state scongelate e utilizzate per la metabolomica e la determinazione dei metaboliti descritte di seguito.
Il terreno completo è costituito da 0,22 μm filtrato 50:50 integrato con RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM di L-glutammina (Thermo Fisher Scientific) integrato con il 10% di siero umano AB inattivato termicamente (Sigma-Aldrich), 12,5 mM di Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM di L-glutammina (Thermo Fisher Scientific), 1 x soluzione di penicillina e streptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) e 50 μMB di mercaptoetanolo. AimV (Invitrogen) è integrato con 20 mM di Hepes (Thermo Fisher Scientific) e 2 mM di L-glutammina (Thermo Fisher Scientific). Il tampone di colorazione del citofluorimetro era costituito da 0,22 μm di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; Invitrogen) filtrata, addizionata con il 3% di siero umano AB inattivato termicamente (Sigma). Il tampone di arricchimento cellulare era composto da 0,22 μm di PBS filtrato e addizionato con lo 0,5% di siero umano AB inattivato termicamente (Sigma-Aldrich).
In un terreno completo a 37 °C, le cellule sono state colorate con 10 nM di MT DR e 100 μM di 2-NBDG per 30 minuti. Successivamente, le cellule sono state colorate con il colorante di vitalità eF506 a 4 °C per 15 minuti. Risospendere le cellule in FC Block (eBioscience) e Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluire nel tampone di colorazione per citometria a flusso (secondo le istruzioni del produttore) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Colorare le cellule con un set di anticorpi (Tabella S2) nel tampone di colorazione per citometria a flusso a 4 °C per 20 minuti. Risospendere le cellule nel tampone di colorazione per citometria a flusso (Cytek Aurora; configurazione 3L-16V-14B-8R) prima dell'analisi. Utilizzare SpectroFlo e FlowJo V10 per analizzare i dati di conteggio cellulare e utilizzare GraphPad Prism 8 per creare i dati. L'intensità di fluorescenza mediana (MFI) di 2-NBDG e MT DR è stata log-normalizzata, quindi è stato utilizzato un test t per dati appaiati per l'analisi statistica per tenere conto dei pazienti abbinati. Rimuovere dall'analisi tutte le popolazioni con meno di 40 eventi; inserire un valore MFI pari a 1 per eventuali valori negativi prima di eseguire l'analisi statistica e la visualizzazione dei dati.
Per integrare la strategia di gating manuale del pannello di processo sopra riportato, abbiamo utilizzato l'annotazione completa dell'albero di restrizione della forma (FAUST) (21) per assegnare automaticamente le cellule alla popolazione dopo aver eliminato le cellule morte in FlowJo. Abbiamo gestito manualmente l'output per unire le popolazioni che sembrano essere allocate in modo errato (combinando cellule tumorali PD1+ con PD1-) e le popolazioni mantenute. Ogni campione contiene una media di oltre il 2% di cellule, per un totale di 11 popolazioni.
La centrifugazione a gradiente di densità con Ficoll è stata utilizzata per separare i PBMC dai prodotti di separazione dei leucociti (STEMCELL Technologies). Le cellule T CD8+ sono state isolate dai PBMC utilizzando le microsfere CD8 (Miltenyi) ed espanse in terreno completo utilizzando TransAct (Miltenyi) per 2 settimane secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state lasciate riposare per 5 giorni in terreno completo contenente IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) e quindi stimolate nuovamente con TransAct. Il settimo giorno, secondo le istruzioni del produttore, le microsfere CD45 umane (Miltenyi) sono state utilizzate per arricchire le cellule in tre cicli consecutivi. Le cellule sono state suddivise in aliquote per l'analisi citofluorimetrica (come descritto sopra) e un milione di cellule è stato suddiviso in aliquote tre volte per l'analisi LC-MS/MS. I campioni sono stati processati mediante LC-MS/MS come descritto di seguito. Abbiamo stimato il valore del metabolita mancante con un numero di ioni pari a 1.000. Ogni campione viene normalizzato in base al numero totale di ioni (TIC), convertito logaritmicamente e normalizzato automaticamente in MetaboAnalystR prima dell'analisi.
La sospensione cellulare singola di ciascun paziente è stata scongelata e filtrata attraverso un filtro da 40 μm in un terreno completo (come descritto sopra). Secondo il protocollo del produttore, sono stati utilizzati tre cicli consecutivi di selezione positiva mediante separazione con biglie magnetiche utilizzando MicroBeads (Miltenyi) per arricchire i campioni di cellule CD8+, CD4+ e CD45- (su ghiaccio). In breve, le cellule vengono risospese nel tampone di arricchimento cellulare (come descritto sopra) e contate. Le cellule sono state incubate con biglie umane CD8, biglie umane CD4 o biglie umane CD45 (Miltenyi) a 4 °C per 15 minuti, quindi lavate con tampone di arricchimento cellulare. Il campione viene fatto passare attraverso la colonna LS (Miltenyi) e vengono raccolte le frazioni positive e negative. Per ridurre la durata e massimizzare la fase di recupero cellulare, la frazione CD8 viene quindi utilizzata per il secondo ciclo di arricchimento CD4+ e la frazione CD4 viene utilizzata per il successivo arricchimento CD45. Mantenere la soluzione nel ghiaccio durante tutto il processo di separazione.
Per preparare i campioni per l'analisi dei metaboliti, le cellule sono state lavate una volta con una soluzione salina ghiacciata e a ciascun campione è stato aggiunto 1 ml di metanolo all'80%, quindi agitate e congelate rapidamente in azoto liquido. I campioni sono stati sottoposti a tre cicli di congelamento-scongelamento e centrifugati a 14.000 giri al minuto per 15 minuti a 4 °C. Il surnatante contenente i metaboliti è stato evaporato fino a essiccazione. I metaboliti sono stati ridisciolti in 50 μl di acido formico allo 0,03%, agitati per miscelare e quindi centrifugati per rimuovere i detriti.
Estrarre i metaboliti come descritto sopra. Trasferire il surnatante in un flacone per cromatografia liquida ad alte prestazioni per la ricerca metabolomica. Utilizzare un protocollo di trattamento casuale per trattare ciascun campione con un numero simile di cellule per prevenire gli effetti batch. Abbiamo eseguito una valutazione qualitativa dei metaboliti globali precedentemente pubblicata sullo spettrometro di massa a triplo quadrupolo AB SCIEX QTRAP 5500 (50). L'analisi cromatografica e l'integrazione dell'area dei picchi sono state eseguite utilizzando il software MultiQuant versione 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
È stato utilizzato un conteggio ionico di 1000 per stimare il valore del metabolita mancante e il TIC di ciascun campione è stato utilizzato per calcolare l'area di picco normalizzata di ciascun metabolita rilevato, al fine di correggere le variazioni introdotte dall'analisi strumentale derivante dall'elaborazione del campione. Dopo la normalizzazione del TIC, MetaboAnalystR(51) (parametro predefinito) viene utilizzato per la conversione logaritmica e la scala automatica della linea di norma. Abbiamo utilizzato l'analisi delle componenti principali (PCA) con il pacchetto R vegano per eseguire un'analisi esplorativa delle differenze del metaboloma tra i tipi di campione e abbiamo utilizzato l'analisi di ridondanza parziale per analizzare i pazienti. Abbiamo utilizzato il metodo Ward per costruire un dendrogramma di mappa di calore per raggruppare la distanza euclidea tra i campioni. Abbiamo utilizzato limma (52) sull'abbondanza standardizzata dei metaboliti per identificare metaboliti differenzialmente abbondanti nell'intero tipo cellulare e nel microambiente. Per semplificare la spiegazione, utilizziamo il parametro medio di gruppo per specificare il modello e consideriamo i tipi cellulari nel microambiente come ciascun gruppo (n = 6 gruppi); Per il test di significatività, abbiamo eseguito tre misurazioni ripetute per ciascun metabolita. Per evitare false repliche, il paziente è stato incluso come ostacolo nel disegno limma. Per verificare le differenze nei metaboliti tra diversi pazienti, abbiamo aggiustato il modello limma includendo i pazienti in modo fisso. Riportiamo la significatività del contrasto pre-specificato tra il tipo cellulare e il microambiente di Padj <0,05 (correzione di Benjamini-Hochberg).
Dopo l'arricchimento del vigore cellulare utilizzando il kit Miltenyi Dead Cell Removal (>80% di vitalità), è stato eseguito il sequenziamento del trascrittoma a singola cellula su tutti i campioni di ascite e tumore congelati vivi utilizzando un protocollo di espressione genica 5' 10x. Sono stati analizzati cinque casi con tumori e asciti corrispondenti, sebbene la bassa vitalità di un campione tumorale ne abbia impedito l'inclusione. Per ottenere selezioni multiple di pazienti, abbiamo combinato i campioni di ciascun paziente nelle corsie del controller al cromo 10x e analizzato separatamente le asciti e i siti tumorali. Dopo il sequenziamento [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genoma del Quebec; una media di 73.488 e 41.378 letture per cellula rispettivamente per tumore e ascite]], abbiamo utilizzato CellSNP e Vireo (53) (basato su CellSNP come Il comune SNP umano (VCF) fornito da GRCh38 viene assegnato a un'identità di donatore. Utilizziamo SNPRelate per dedurre l'identità più vicina (IBS) dello stato del genotipo del paziente (IBS), escludendo le cellule non assegnate e le cellule identificate come duplex e i donatori corrispondenti tra ascite e campioni tumorali (54). Sulla base di questo compito, abbiamo conservato tre casi con abbondante rappresentazione cellulare nel tumore e nell'ascite per l'analisi a valle. Dopo aver eseguito una fase di filtrazione di massa nel confezionamento BioConductor scater (55) e scran (56), questo ha prodotto 6975 cellule (rispettivamente 2792 e 4183 cellule da tumore e ascite) per l'analisi. Utilizziamo il clustering di Louvain di igraph (57) della rete condivisa del vicino più prossimo (SNN) basato sulla distanza di Jaccard dalle cellule del cluster per espressione. I cluster sono stati annotati manualmente in tipi cellulari putativi in ​​base all'espressione genica del marcatore e visualizzati con t-SNE. Le cellule T citotossiche sono definite dall'espressione di CD8A e GZMA, escludendo i sottocluster con bassa espressione proteica ribosomiale. Abbiamo avuto accesso ai dati pubblicati di Izar et al. (16), incluso il loro embedding con t-SNE, in grado di controllare la sovrapposizione di espressione tra i marcatori delle cellule immunitarie e l'espressione di NNMT.
Le cellule PBMC sono state separate dai prodotti di separazione leucocitaria (STEMCELL Technologies) mediante centrifugazione a gradiente di densità con Ficoll. Le cellule CD3+ sono state isolate dalle PBMC utilizzando biglie di CD3 (Miltenyi). In presenza o assenza di MNA, le cellule CD3+ sono state attivate con CD3 legato alla piastra (5 μg/ml), CD28 solubile (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin). L'ultimo giorno di espansione, la vitalità (colorante fissabile eFluor450, eBioscience) e la proliferazione (123 eBeads, Thermo Fisher Scientific) sono state valutate mediante citometria a flusso. Valutare la funzione effettrice stimolando le cellule con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) con GolgiStop per 4 ore e monitorare CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) (BioLegend) e TNFα-fluoresceina isotiocianato (FITC) (MAb11, BD). Stimolare le cellule qPCR e ChIP con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) per 4 ore. Il supernatante ELISA è stato raccolto prima e dopo la stimolazione con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) per 4 ore.
Seguire il protocollo del produttore per isolare l'RNA utilizzando il kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Utilizzare QIAshredder (QIAGEN) per omogeneizzare il campione. Utilizzare il kit RNA-cDNA ad alta capacità (Thermo Fisher Scientific) per sintetizzare il DNA complementare (cDNA). Utilizzare TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) per quantificare l'espressione genica (secondo il protocollo del produttore) con le seguenti sonde: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldeide-3-fosfato di idrogeno (GAPDH)] e Hs01010726_m1 (SLC22A2). I campioni sono stati analizzati sul sistema PCR real-time StepOnePlus (Applied Biosystems) nella piastra di reazione ottica rapida MicroAmp a 96 pozzetti (Applied Biosystems) con pellicola ottica MicroAmp. Qualsiasi valore Ct superiore a 35 è considerato al di sopra della soglia di rilevabilità e contrassegnato come non rilevabile.
Eseguire la ChIP come precedentemente descritto (58). In breve, le cellule sono state trattate con formaldeide (concentrazione finale 1,42%) e incubate a temperatura ambiente per 10 minuti. Utilizzare tampone di rigonfiamento integrato (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl e 0,1% NP-40) su ghiaccio per 10 minuti, quindi risospendere in tampone di immunoprecipitazione come descritto (58). Il campione è stato quindi sonicato con i seguenti cicli: 10 cicli (20 impulsi da 1 secondo) e un tempo statico di 40 secondi. Incubare gli anticorpi immunoglobulina G di grado ChIP (Cell Signaling Technology; 1 μl), istone H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) e SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) con il campione a 4 °C agitando per una notte. Incubare le biglie di proteina A (Thermo Fisher Scientific) con il campione a 4 °C agitando delicatamente per 1 ora, quindi utilizzare biglie Chelex (Bio-Rad) per arricchire il DNA e utilizzare la proteinasi K (Thermo Fisher) per la digestione delle proteine. Il promotore del TNFα è stato rilevato tramite PCR: in avanti, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; al contrario, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (prodotto di 207 bp). Le immagini sono state prodotte da Image Lab (Bio-Rad) e quantificate utilizzando il software ImageJ.
Il supernatante della coltura cellulare è stato raccolto come descritto sopra. La determinazione è stata effettuata secondo le procedure del produttore del kit ELISA per TNFα umano (Invitrogen), del kit ELISA per IL-2 umana (Invitrogen) e del kit ELISA per IFN-γ umano (Abcam). Secondo il protocollo del produttore, il supernatante è stato diluito 1:100 per rilevare TNFα e IL-2 e 1:3 per rilevare IFN-γ. Utilizzare il lettore multietichetta EnVision 2104 (PerkinElmer) per misurare l'assorbanza a 450 nm.
Le cellule PBMC sono state separate dai prodotti di separazione leucocitaria (STEMCELL Technologies) mediante centrifugazione a gradiente di densità di Ficoll. Le cellule CD3+ sono state isolate dalle PBMC utilizzando biglie di CD3 (Miltenyi). In presenza o assenza di MNA, le cellule CD3+ sono state attivate con CD3 legato alla piastra (5 μg/ml), CD28 solubile (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin) per 3 giorni. Dopo 3 giorni, le cellule sono state raccolte e lavate con soluzione salina allo 0,9% e il pellet è stato congelato rapidamente. La conta cellulare è stata eseguita mediante citometria a flusso (Cytek Aurora; configurazione 3L-16V-14B-8R) utilizzando biglie eBeads da 123 count.
Estrarre i metaboliti come descritto sopra. L'estratto secco è stato ricostituito a una concentrazione di 4000 equivalenti cellulari/μl. Analizzare il campione mediante cromatografia a fase inversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e colonna CORTECS T3 (2,1×150 mm, dimensione delle particelle 1,6 μm, dimensione dei pori 120 Å; n. 186008500, Waters). Spettrometro di massa polare (6470, Agilent), in cui la ionizzazione elettrospray opera in modalità positiva. La fase mobile A è costituita da acido formico allo 0,1% (in H2O), la fase mobile B è costituita da acetonitrile al 90% e acido formico allo 0,1%. Il gradiente LC è compreso tra 0 e 2 minuti per il 100% di A, tra 2 e 7,1 minuti per il 99% di B e tra 7,1 e 8 minuti per il 99% di B. Quindi riequilibrare la colonna con la fase mobile A a una portata di 0,6 ml/min per 3 minuti. La portata è di 0,4 ml/min e la camera della colonna viene riscaldata a 50 °C. Utilizzare lo standard chimico puro MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) per stabilire il tempo di ritenzione (RT) e la trasformazione (RT = 0,882 minuti, trasformazione 1 = 137→94,1, trasformazione 2 = 137→92, conversione 3 = 137→78). Quando tutte e tre le transizioni si verificano al tempo di ritenzione corretto, la transizione 1 viene utilizzata per la quantificazione al fine di garantire la specificità. La curva standard di MNA (Toronto Research Chemical Company) è stata generata da sei diluizioni seriali della soluzione madre (1 mg/ml) per ottenere standard rispettivamente di 0,1, 1,0, 10 e 100 ng/ml e 1,0 e 10 μg/ml di soluzione liquida. Il limite di rilevabilità è di 1 ng/ml e la risposta lineare è compresa tra 10 ng/ml e 10 μg/ml. Ogni iniezione di due microlitri di campione e standard viene utilizzata per l'analisi LC/MS e un campione di controllo di qualità misto viene analizzato ogni otto iniezioni per garantire la stabilità della piattaforma di analisi. Le risposte MNA di tutti i campioni cellulari trattati con MNA rientravano nell'intervallo lineare del test. L'analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il software di analisi quantitativa MassHunter (v9.0, Agilent).
Il costrutto αFR-CAR di seconda generazione è stato tratto da Song et al. (59). In breve, il costrutto contiene i seguenti elementi: sequenza leader di CD8a, frammento variabile a catena singola specifico per αFR umano, regione cerniera e transmembrana di CD8a, dominio intracellulare CD27 e dominio intracellulare CD3z. La sequenza CAR completa è stata sintetizzata da GenScript e quindi clonata nel vettore di espressione lentivirale di seconda generazione a monte della cassetta di espressione GFP utilizzata per valutare l'efficienza di trasduzione.
Il lentivirus è prodotto mediante trasfezione di cellule HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); coltivate in terreno Eagle modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di PenStrep, e utilizzando il vettore CAR-GFP. I plasmidi di confezionamento (psPAX2 e pMD2.G, Addgene) utilizzano ammina lipofettante (Sigma-Aldrich). Il surnatante contenente il virus è stato raccolto 48 e 72 ore dopo la trasfezione, filtrato e concentrato mediante ultracentrifugazione. Conservare il surnatante virale concentrato a -80 °C fino alla trasduzione.
Le cellule PBMC vengono separate dai prodotti di separazione dei leucociti di donatori sani (STEMCELL Technologies) mediante centrifugazione a gradiente di densità di Ficoll. Utilizzare microsfere CD8 a selezione positiva (Miltenyi) per isolare le cellule CD8+ dalle cellule PBMC. Stimolare le cellule T con TransAct (Miltenyi) e in terreno TexMACS [Miltenyi; integrato con il 3% di siero umano inattivato termicamente, l'1% di PenStrep e IL-2 (300 U/ml)]. Ventiquattro ore dopo la stimolazione, le cellule T sono state trasdotte con lentivirus (10 μl di supernatante virale concentrato per 106 cellule). Da 1 a 3 giorni dopo la trasduzione su Cytek Aurora (su FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), valutare l'espressione di GFP delle cellule per dimostrare un'efficienza di trasduzione di almeno il 30%.
Le cellule CAR-T sono state coltivate per 24 ore in Immunocult (STEMCELL Technologies; integrato con PenStrep all'1%) nelle seguenti condizioni: non trattate, trattate con 250 μM di adenosina o 10 mM di MNA. Dopo il pretrattamento, le cellule CAR-T sono state lavate con PBS e combinate con 20.000 cellule SK-OV-3 [ATCC; in terreno McCoy 5A (Sigma-Aldrich) integrato con FBS al 10% e PenStrep all'1% a 10: Il rapporto effettore/bersaglio di 1 è stato amplificato in triplicato nel terreno Immunocult integrato. Le cellule SK-OV-3 e le cellule SK-OV-3 lisate con saponina digitale (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) sono state utilizzate rispettivamente come controlli negativi e positivi. Dopo 24 ore di co-coltura, il surnatante è stato raccolto e la lattato deidrogenasi (LDH) è stata misurata secondo le istruzioni del produttore (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Il surnatante LDH è stato diluito 1:50 in tampone LDH. La percentuale di uccisione è stata misurata utilizzando la seguente formula: percentuale di uccisione = percentuale di correzione / tasso massimo di uccisione x 100%, dove percentuale di correzione = co-coltura - solo cellule T e tasso massimo di uccisione = controllo positivo - controllo negativo.
Come descritto nel testo o nella sezione Materiali e Metodi, per l'analisi statistica si utilizzano GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0. Se vengono raccolti più campioni dallo stesso paziente (ad esempio, ascite e tumore), utilizziamo un test t per dati appaiati o includiamo il paziente come effetto casuale in un modello lineare o generalizzato, a seconda dei casi. Per l'analisi metabolomica, il test di importanza viene eseguito in triplicato.
Per materiali supplementari per questo articolo, vedere http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
L'MNA contribuisce alla soppressione immunitaria delle cellule T e rappresenta un potenziale bersaglio dell'immunoterapia per il trattamento del cancro umano.
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