I metaboliti immunomodulatori sono una caratteristica chiave del microambiente tumorale (TME), ma, con poche eccezioni, la loro identità rimane in gran parte sconosciuta. In questo studio, abbiamo analizzato tumori e cellule T provenienti da tumori e liquido ascitico di pazienti affetti da carcinoma sieroso di alto grado (HGSC) per svelare il metaboloma di questi diversi compartimenti del TME. Il liquido ascitico e le cellule tumorali presentano ampie differenze metaboliche. Rispetto al liquido ascitico, le cellule T infiltranti il ​​tumore sono significativamente arricchite di 1-metilnicotinamide (MNA). Sebbene il livello di MNA nelle cellule T sia elevato, l'espressione della nicotinamide N-metiltransferasi (un enzima che catalizza il trasferimento di gruppi metilici dalla S-adenosilmetionina alla nicotinamide) è limitata ai fibroblasti e alle cellule tumorali. Funzionalmente, l'MNA induce le cellule T a secernere il fattore di necrosi tumorale alfa, una citochina che promuove la crescita tumorale. Pertanto, l'MNA derivato dal TME contribuisce alla regolazione immunitaria delle cellule T e rappresenta un potenziale bersaglio immunoterapico per il trattamento dei tumori umani.
I metaboliti derivati ​​dal tumore possono avere un profondo effetto inibitorio sull'immunità antitumorale, e sempre più prove dimostrano che possono anche fungere da forza trainante chiave per la progressione della malattia (1). Oltre all'effetto Warburg, recenti studi hanno iniziato a caratterizzare lo stato metabolico delle cellule tumorali e la sua relazione con lo stato immunitario del microambiente tumorale (TME). Studi su modelli murini e cellule T umane hanno dimostrato che il metabolismo della glutammina (2), il metabolismo ossidativo (3) e il metabolismo del glucosio (4) possono agire indipendentemente su vari sottogruppi di cellule immunitarie. Diversi metaboliti in queste vie metaboliche inibiscono la funzione antitumorale delle cellule T. È stato dimostrato che il blocco del coenzima tetraidrobiopterina (BH4) può danneggiare la proliferazione delle cellule T e che l'aumento di BH4 nell'organismo può potenziare la risposta immunitaria antitumorale mediata da CD4 e CD8. Inoltre, l'effetto immunosoppressivo della chinurenina può essere contrastato dalla somministrazione di BH4 (5). Nel glioblastoma mutante dell'isocitrato deidrogenasi (IDH), la secrezione dell'enantiometabolico (R)-2-idrossiglutarato (R-2-HG) inibisce l'attivazione, la proliferazione e l'attività citolitica delle cellule T (6). Recentemente, è stato dimostrato che il metilgliossale, un sottoprodotto della glicolisi, è prodotto dalle cellule soppressorie di origine mieloide e che il trasferimento di metilgliossale alle cellule T può inibire la funzione delle cellule T effettrici. Nel trattamento, la neutralizzazione del metilgliossale può superare l'attività delle cellule soppressorie di derivazione mieloide (MDSC) e potenziare sinergicamente la terapia di blocco del checkpoint nei modelli murini (7). Questi studi sottolineano collettivamente il ruolo chiave dei metaboliti derivati ​​dal TME nella regolazione della funzione e dell'attività delle cellule T.
La disfunzione delle cellule T è stata ampiamente segnalata nel cancro ovarico (8). Ciò è in parte dovuto alle caratteristiche metaboliche intrinseche all'ipossia e alla vascolarizzazione tumorale anomala (9), che determina la conversione di glucosio e triptofano in sottoprodotti come acido lattico e chinurenina. L'eccesso di lattato extracellulare riduce la produzione di interferone-γ (IFN-γ) e favorisce la differenziazione di sottogruppi mielosoppressivi (10, 11). Il consumo di triptofano inibisce direttamente la proliferazione delle cellule T e la segnalazione del recettore delle cellule T (12-14). Nonostante queste osservazioni, molti studi sul metabolismo immunitario sono stati condotti in colture di cellule T in vitro utilizzando terreni di coltura ottimizzati, oppure limitati a modelli murini omologhi in vivo, nessuno dei quali riflette pienamente l'eterogeneità dei tumori umani e del macro e microambiente fisiologico.
Una caratteristica comune del cancro ovarico è la diffusione peritoneale e la comparsa di ascite. L'accumulo di liquido cellulare nell'ascite è associato a malattia avanzata e prognosi infausta (15). Secondo quanto riportato, questo compartimento unico è ipossico, presenta alti livelli di fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e indoleamina 2,3-diossigenasi (IDO) ed è infiltrato da cellule T regolatorie e cellule mieloidi inibitorie (15-18). L'ambiente metabolico dell'ascite può essere diverso da quello del tumore stesso, quindi la riprogrammazione delle cellule T nello spazio peritoneale non è chiara. Inoltre, le differenze chiave e l'eterogeneità tra l'ascite e i metaboliti presenti nell'ambiente tumorale possono ostacolare l'infiltrazione delle cellule immunitarie e la loro funzione sui tumori, e sono necessarie ulteriori ricerche.
Per risolvere questi problemi, abbiamo progettato un metodo sensibile di separazione cellulare e cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per studiare diversi tipi di cellule (incluse le cellule T CD4+ e CD8+) e i loro metaboliti all'interno e tra le cellule tumorali, sia nel liquido ascitico che nell'ambiente tumorale del paziente. Utilizziamo questo metodo in combinazione con la citometria a flusso ad alta dimensionalità e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) per fornire un quadro altamente risolto dello stato metabolico di queste popolazioni chiave. Questo metodo ha rivelato un aumento significativo del livello di 1-metilnicotinamide (MNA) nelle cellule T tumorali e gli esperimenti in vitro hanno dimostrato che l'effetto immunomodulatore dell'MNA sulla funzione delle cellule T era precedentemente sconosciuto. In generale, questo metodo rivela le interazioni metaboliche reciproche tra tumori e cellule immunitarie e fornisce informazioni uniche sui metaboliti della regolazione immunitaria, che potrebbero essere utili per le opportunità di trattamento dell'immunoterapia del cancro ovarico basata sulle cellule T.
Abbiamo utilizzato la citometria a flusso ad alta dimensionalità per quantificare simultaneamente l'assorbimento di glucosio [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)ammino)-2-deossiglucosio (2-NBDG) e l'attività mitocondriale [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) sono marcatori tipici affiancati che distinguono le popolazioni di cellule immunitarie e di cellule tumorali (Tabella S2 e Figura S1A). Questa analisi ha mostrato che rispetto alle cellule T, le cellule ascitiche e tumorali hanno livelli di assorbimento di glucosio più elevati, ma hanno differenze minori nell'attività mitocondriale. L'assorbimento medio di glucosio delle cellule tumorali [CD45-EpCAM (EpCAM)+] è da tre a quattro volte quello delle cellule T, e l'assorbimento medio di glucosio delle cellule T CD4+ è 1,2 volte quello delle cellule T CD8+, il che indica che i linfociti infiltranti il ​​tumore (TIL) hanno esigenze metaboliche diverse anche nello stesso TME (Figura 1A). Al contrario, l'attività mitocondriale nelle cellule tumorali è simile a quella delle cellule T CD4+, e l'attività mitocondriale di entrambi i tipi cellulari è superiore a quella delle cellule T CD8+ (Figura 1B). In generale, questi risultati rivelano il livello metabolico. L'attività metabolica delle cellule tumorali è superiore a quella delle cellule T CD4+, e l'attività metabolica delle cellule T CD4+ è superiore a quella delle cellule T CD8+. Nonostante questi effetti tra i diversi tipi cellulari, non vi è alcuna differenza consistente nello stato metabolico delle cellule T CD4+ e CD8+ o nelle loro proporzioni relative nell'ascite rispetto ai tumori (Figura 1C). Al contrario, nella frazione cellulare CD45-, la proporzione di cellule EpCAM+ nel tumore è aumentata rispetto all'ascite (Figura 1D). Abbiamo anche osservato una chiara differenza metabolica tra le componenti cellulari EpCAM+ ed EpCAM-. Le cellule EpCAM+ (tumorali) presentano un assorbimento di glucosio e un'attività mitocondriale maggiori rispetto alle cellule EpCAM-, che sono molto più elevati dell'attività metabolica dei fibroblasti nelle cellule tumorali nel TME (Figura 1, E e F).
(A e B) Intensità di fluorescenza mediana (MFI) dell'assorbimento di glucosio (2-NBDG) (A) e attività mitocondriale delle cellule T CD4+ (MitoTracker rosso scuro) (B) Grafici rappresentativi (a sinistra) e dati tabulati (a destra), cellule T CD8+ e cellule tumorali EpCAM+ CD45- da ascite e tumore. (C) Il rapporto tra cellule CD4+ e CD8+ (delle cellule T CD3+) in ascite e tumore. (D) Proporzione di cellule tumorali EpCAM+ in ascite e tumore (CD45−). (E e F) Assorbimento di glucosio (2-NBDG) da parte di cellule tumorali EpCAM+ CD45- e cellule della matrice EpCAM-CD45- (E) e attività mitocondriale (MitoTracker rosso scuro) (F) grafici rappresentativi (a sinistra) e dati tabulati (a destra) Ascite e cellule tumorali. (G) Grafici rappresentativi dell'espressione di CD25, CD137 e PD1 mediante citometria a flusso. (H e I) Espressione di CD25, CD137 e PD1 su cellule T CD4+ (H) e cellule T CD8+ (I). (J e K) Fenotipi naive, di memoria centrale (Tcm), effettori (Teff) e di memoria effettori (Tem) basati sull'espressione di CCR7 e CD45RO. Immagini rappresentative (a sinistra) e dati tabellari (a destra) di cellule T CD4+ (J) e cellule T CD8+ (K) in ascite e tumori. Valori P determinati mediante t-test appaiato (*P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). La linea rappresenta pazienti appaiati (n = 6). FMO, fluorescenza meno uno; MFI, intensità di fluorescenza mediana.
Ulteriori analisi hanno rivelato altre differenze significative tra lo stato fenotipico delle cellule T altamente risolte. Le cellule attivate (Figura 1, da G a I) e le cellule della memoria effettrici (Figura 1, J e K) nei tumori sono molto più frequenti rispetto all'ascite (proporzione di cellule T CD3+). Allo stesso modo, l'analisi del fenotipo mediante l'espressione di marcatori di attivazione (CD25 e CD137) e marcatori di deplezione [proteina 1 della morte cellulare programmata (PD1)] ha mostrato che, sebbene le caratteristiche metaboliche di queste popolazioni siano diverse (Figura S1, da B a E), non sono state osservate differenze metaboliche significative in modo coerente tra i sottogruppi naive, effettori o della memoria (Figura S1, da F a I). ​​Questi risultati sono stati confermati utilizzando metodi di apprendimento automatico per assegnare automaticamente i fenotipi cellulari (21), che hanno ulteriormente rivelato la presenza di un gran numero di cellule del midollo osseo (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) nell'ascite del paziente (Figura S2A). Tra tutti i tipi cellulari identificati, questa popolazione di cellule mieloidi ha mostrato il più alto assorbimento di glucosio e attività mitocondriale (Figura S2, da B a G). Questi risultati evidenziano le forti differenze metaboliche tra i molteplici tipi cellulari riscontrati nell'ascite e nei tumori delle pazienti affette da HGSC.
La principale difficoltà nella comprensione delle caratteristiche metabolomiche dei TIL risiede nella necessità di isolare campioni di cellule T di sufficiente purezza, qualità e quantità dai tumori. Studi recenti hanno dimostrato che i metodi di selezione e arricchimento con microsfere basati sulla citometria a flusso possono portare a cambiamenti nei profili metabolici cellulari (22-24). Per superare questo problema, abbiamo ottimizzato il metodo di arricchimento con microsfere per isolare i TIL da tumori ovarici umani resecati chirurgicamente prima dell'analisi mediante LC-MS/MS (vedere Materiali e Metodi; Figura 2A). Al fine di valutare l'impatto complessivo di questo protocollo sui cambiamenti metabolici, abbiamo confrontato i profili metabolici delle cellule T attivate da donatori sani dopo la suddetta fase di separazione con microsfere con quelli delle cellule non separate con microsfere ma mantenute in ghiaccio. Questa analisi di controllo qualità ha rilevato un'elevata correlazione tra le due condizioni (r = 0,77) e un'elevata ripetibilità tecnica del gruppo di 86 metaboliti (Figura 2B). Pertanto, questi metodi possono eseguire un'analisi accurata dei metaboliti nelle cellule sottoposte ad arricchimento del tipo cellulare, fornendo così la prima piattaforma ad alta risoluzione per l'identificazione di metaboliti specifici nell'HGSC, consentendo in tal modo di acquisire una comprensione più approfondita del programma metabolico sessuale specifico delle cellule.
(A) Schema dell'arricchimento con microsfere magnetiche. Prima dell'analisi mediante LC-MS/MS, le cellule vengono sottoposte a tre cicli consecutivi di arricchimento con microsfere magnetiche o rimangono in ghiaccio. (B) Effetto del tipo di arricchimento sull'abbondanza dei metaboliti. Media di tre misurazioni per ciascun tipo di arricchimento ± errore standard. La linea grigia rappresenta una relazione 1:1. La correlazione intraclasse (ICC) delle misurazioni ripetute è mostrata nell'etichetta dell'asse. NAD, nicotinamide adenina dinucleotide. (C) Schema del flusso di lavoro per l'analisi dei metaboliti dei pazienti. Il liquido ascitico o i tumori vengono raccolti dai pazienti e crioconservati. Una piccola porzione di ciascun campione è stata analizzata mediante citometria a flusso, mentre i campioni rimanenti sono stati sottoposti a tre cicli di arricchimento per le cellule CD4+, CD8+ e CD45-. Queste frazioni cellulari sono state analizzate mediante LC-MS/MS. (D) Mappa di calore dell'abbondanza standardizzata dei metaboliti. Il dendrogramma rappresenta il clustering di Ward delle distanze euclidee tra i campioni. (E) Analisi delle componenti principali (PCA) della mappa dei metaboliti del campione, che mostra tre repliche di ciascun campione; i campioni dello stesso paziente sono collegati da una linea. (F) PCA del profilo metabolico del campione condizionato al paziente (ovvero, utilizzando la ridondanza parziale); il tipo di campione è limitato dall'inviluppo convesso. PC1, componente principale 1; PC2, componente principale 2.
Successivamente, abbiamo applicato questo metodo di arricchimento per analizzare 99 metaboliti nelle frazioni cellulari CD4+, CD8+ e CD45- nell'ascite primaria e nei tumori di sei pazienti con HGSC (Figura 2C, Figura S3A e Tabelle S3 e S4). La popolazione di interesse rappresenta dal 2% al 70% del campione originale di grandi dimensioni di cellule viventi e la proporzione di cellule varia notevolmente tra i pazienti. Dopo la separazione delle microsfere, la frazione arricchita di interesse (CD4+, CD8+ o CD45-) rappresenta in media oltre l'85% di tutte le cellule viventi nel campione. Questo metodo di arricchimento ci consente di analizzare le popolazioni cellulari del metabolismo del tessuto tumorale umano, cosa impossibile da fare con campioni di grandi dimensioni. Utilizzando questo protocollo, abbiamo determinato che la l-chinurenina e l'adenosina, questi due metaboliti immunosoppressivi ben caratterizzati, erano elevati nelle cellule T tumorali o nelle cellule tumorali (Figura S3, B e C). Pertanto, questi risultati dimostrano l'affidabilità e la capacità della nostra tecnologia di separazione cellulare e spettrometria di massa di individuare metaboliti biologicamente importanti nei tessuti dei pazienti.
La nostra analisi ha inoltre rivelato una forte separazione metabolica dei tipi cellulari all'interno e tra i pazienti (Figura 2D e Figura S4A). In particolare, rispetto agli altri pazienti, il paziente 70 ha mostrato caratteristiche metaboliche diverse (Figura 2E e Figura S4B), indicando che potrebbe esserci una sostanziale eterogeneità metabolica tra i pazienti. Vale la pena notare che, rispetto agli altri pazienti (da 1,2 a 2 litri; Tabella S1), la quantità totale di ascite raccolta nel paziente 70 (80 ml) era inferiore. Il controllo dell'eterogeneità inter-paziente durante l'analisi delle componenti principali (ad esempio, utilizzando l'analisi di ridondanza parziale) mostra cambiamenti coerenti tra i tipi cellulari, e i tipi cellulari e/o il microambiente sono chiaramente aggregati in base al profilo metabolico (Figura 2F). L'analisi dei singoli metaboliti ha enfatizzato questi effetti e ha rivelato differenze significative tra i tipi cellulari e il microambiente. È opportuno notare che la differenza più estrema osservata riguarda l'MNA, che è solitamente arricchito nelle cellule CD45- e nelle cellule CD4+ e CD8+ che infiltrano il tumore (Figura 3A). Per le cellule CD4+, questo effetto è più evidente, e anche l'MNA nelle cellule CD8+ sembra essere fortemente influenzato dall'ambiente. Tuttavia, questo non è rilevante, poiché solo tre dei sei pazienti possono essere valutati per i punteggi CD8+ del tumore. Oltre all'MNA, in diversi tipi di cellule nell'ascite e nei tumori, anche altri metaboliti poco caratterizzati nei TIL sono arricchiti in modo differenziale (Figure S3 e S4). Pertanto, questi dati rivelano un insieme promettente di metaboliti immunomodulatori per ulteriori ricerche.
(A) Contenuto normalizzato di MNA nelle cellule CD4+, CD8+ e CD45- provenienti da ascite e tumore. Il box plot mostra la mediana (linea), l'intervallo interquartile (cerniera del riquadro) e l'intervallo dei dati, fino a 1,5 volte l'intervallo interquartile (baffi del riquadro). Come descritto in Materiali e Metodi per i Pazienti, utilizzare il valore limma del paziente per determinare il valore P (*P<0,05 e **P<0,01). (B) Diagramma schematico del metabolismo dell'MNA (60). Metaboliti: S-adenosil-1-metionina; SAH, S-adenosina-1-omocisteina; NA, nicotinamide; MNA, 1-metilnicotinamide; 2-PY, 1-metil-2-piridone-5-carbossammide; 4-PY, 1-metil-4-piridone-5-carbossammide; NR, nicotinamide ribosio; NMN, nicotinamide mononucleotide. Enzimi (verde): NNMT, nicotinamide N-metiltransferasi; SIRT, sirtuine; NAMPT, nicotinamide fosforibosil transferasi; AOX1, aldeide ossidasi 1; NRK, nicotinamide riboside chinasi; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenilato transferasi; Pnp1, purina nucleoside fosforilasi. (C) t-SNE di scRNA-seq di ascite (grigio) e tumore (rosso; n = 3 pazienti). (D) Espressione di NNMT in diverse popolazioni cellulari identificate mediante scRNA-seq. (E) Espressione di NNMT e AOX1 in SK-OV-3, cellule renali embrionali umane (HEK) 293T, cellule T e cellule T trattate con MNA. L'espressione ripiegata è mostrata rispetto a SK-OV-3. Il modello di espressione con SEM è mostrato (n = 6 donatori sani). I valori Ct superiori a 35 sono considerati non rilevabili (UD). (F) Espressione di SLC22A1 e SLC22A2 in cellule SK-OV-3, HEK293T, cellule T e cellule T trattate con 8 mM di MNA. L'espressione ripiegata è mostrata rispetto a SK-OV-3. Viene mostrato il pattern di espressione con SEM (n = 6 donatori sani). I valori Ct superiori a 35 sono considerati non rilevabili (UD). (G) Contenuto di MNA nelle cellule T attivate di donatori sani dopo 72 ore di incubazione con MNA. Viene mostrato il pattern di espressione con SEM (n = 4 donatori sani).
L'MNA viene prodotto trasferendo il gruppo metilico dalla S-adenosil-1-metionina (SAM) alla nicotinamide (NA) tramite la nicotinamide N-metiltransferasi (NNMT; Figura 3B). La NNMT è sovraespressa in diversi tumori umani ed è associata a proliferazione, invasione e metastasi (25-27). Per comprendere meglio l'origine dell'MNA nelle cellule T nel TME, abbiamo utilizzato la scRNA-seq per caratterizzare l'espressione della NNMT nei diversi tipi cellulari presenti nel liquido ascitico e nei tumori di tre pazienti con HGSC (Tabella S5). L'analisi di circa 6.500 cellule ha mostrato che, sia nel liquido ascitico che negli ambienti tumorali, l'espressione della NNMT era limitata alle presunte popolazioni di fibroblasti e cellule tumorali (Figura 3, C e D). Vale la pena notare che non c'è un'espressione evidente di NNMT in nessuna popolazione che esprime PTPRC (CD45 +) (Figura 3D e Figura S5A), il che indica che l'MNA rilevato nello spettro dei metaboliti è stato introdotto nelle cellule T. L'espressione dell'aldeide ossidasi 1 (AOX1) converte l'MNA in 1-metil-2-piridone-5-carbossammide (2-PYR) o 1-metil-4-piridone-5-carbossammide (4-PYR); Figura 3B) è anche limitata alla popolazione di fibroblasti che esprimono COL1A1 (Figura S5A), il che insieme indica che le cellule T non hanno la capacità di metabolismo convenzionale dell'MNA. Il modello di espressione di questi geni correlati all'MNA è stato verificato utilizzando un secondo set di dati cellulari indipendenti da ascite di pazienti con HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Inoltre, l'analisi quantitativa mediante reazione a catena della polimerasi (qPCR) delle cellule T di donatori sani trattate con MNA ha mostrato che, rispetto alle cellule tumorali ovariche di controllo SK-OV-3, NNMT o AOX1 non erano quasi per nulla espressi (Figura 3E). Questi risultati inattesi indicano che MNA potrebbe essere secreto dai fibroblasti o dai tumori nelle cellule T adiacenti nel microambiente tumorale.
Sebbene i candidati includano la famiglia dei trasportatori di cationi organici da 1 a 3 (OCT1, OCT2 e OCT3) codificati dalla famiglia del trasportatore solubile 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 e SLC22A3), i potenziali trasportatori di MNA sono ancora indefiniti (28). La qPCR dell'mRNA delle cellule T di donatori sani ha mostrato bassi livelli di espressione di SLC22A1 ma livelli non rilevabili di SLC22A2, il che ha confermato quanto precedentemente riportato in letteratura (Figura 3F) (29). Al contrario, la linea cellulare tumorale ovarica SK-OV-3 ha espresso alti livelli di entrambi i trasportatori (Figura 3F).
Per verificare la possibilità che le cellule T siano in grado di assorbire MNA estraneo, le cellule T di donatori sani sono state coltivate per 72 ore in presenza di diverse concentrazioni di MNA. In assenza di MNA esogeno, il contenuto cellulare di MNA non è rilevabile (Figura 3G). Tuttavia, le cellule T attivate e trattate con MNA esogeno hanno mostrato un aumento dose-dipendente del contenuto di MNA nelle cellule, fino a 6 mM di MNA (Figura 3G). Questo risultato indica che, nonostante il basso livello di espressione del trasportatore e la mancanza del principale enzima responsabile del metabolismo intracellulare dell'MNA, i TIL possono comunque assorbire MNA.
Lo spettro dei metaboliti nelle cellule T dei pazienti e gli esperimenti di assorbimento di MNA in vitro aumentano la possibilità che i fibroblasti associati al cancro (CAF) secernano MNA e che le cellule tumorali possano regolare il fenotipo e la funzione dei TIL. Per determinare l'effetto dell'MNA sulle cellule T, le cellule T di donatori sani sono state attivate in vitro in presenza o assenza di MNA e ne sono state valutate la proliferazione e la produzione di citochine. Dopo 7 giorni di aggiunta di MNA alla dose più alta, il numero di duplicazione della popolazione è risultato moderatamente ridotto, mentre il vigore è stato mantenuto a tutte le dosi (Figura 4A). Inoltre, il trattamento con MNA esogeno ha determinato un aumento della proporzione di cellule T CD4+ e CD8+ che esprimono il fattore di necrosi tumorale-α (TNFα; Figura 4B). Al contrario, la produzione intracellulare di IFN-γ è risultata significativamente ridotta nelle cellule T CD4+, ma non nelle cellule T CD8+, e non vi è stata alcuna variazione significativa nell'interleuchina 2 (IL-2; Figura 4, C e D). Pertanto, il test immunoenzimatico (ELISA) dei supernatanti di queste colture di cellule T trattate con MNA ha mostrato un aumento significativo di TNFα, una diminuzione di IFN-γ e nessun cambiamento in IL-2 (Figura 4, da E a G). La diminuzione di IFN-γ indica che MNA potrebbe svolgere un ruolo nell'inibire l'attività antitumorale delle cellule T. Al fine di simulare l'effetto di MNA sulla citotossicità mediata dalle cellule T, le cellule T con recettore chimerico per l'antigene (FRα-CAR-T) che prendono di mira il recettore del folato α e le cellule CAR-T (GFP) regolate dalla proteina fluorescente verde (GFP) -CAR-T) sono prodotte da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di donatori sani. Le cellule CAR-T sono state coltivate per 24 ore in presenza di MNA e quindi co-coltivate con cellule tumorali ovariche umane SK-OV-3 che esprimono il recettore del folato α a un rapporto effettore-bersaglio di 10:1. Il trattamento con MNA ha determinato una significativa diminuzione dell'attività citotossica delle cellule FRα-CAR-T, simile a quella delle cellule FRα-CAR-T trattate con adenosina (Figura 4H).
(A) Conteggio totale delle cellule vitali e raddoppio della popolazione (PD) direttamente dalla coltura al giorno 7. Il grafico a barre rappresenta la media ± SEM di sei donatori sani. Rappresenta i dati di almeno n = 3 esperimenti indipendenti. (B-D) CD3/CD28 e IL-2 sono stati utilizzati per attivare le cellule T alle rispettive concentrazioni MNA per 7 giorni. Prima dell'analisi, le cellule sono state stimolate con PMA/ionomicina con GolgiStop per 4 ore. Espressione di TNFα (B) nelle cellule T. Immagine di esempio (a sinistra) e dati tabellari (a destra) dell'espressione di TNFα in cellule viventi. Espressione di IFN-γ (C) e IL-2 (D) nelle cellule T. L'espressione delle citochine è stata misurata mediante citometria a flusso. Il grafico a barre rappresenta la media (n = 6 donatori sani) ± SEM. Utilizzare l'analisi della varianza a una via e misure ripetute (*P<0,05 e **P<0,01) per determinare il valore P. Rappresenta i dati di almeno n = 3 esperimenti indipendenti. (Da E a G) CD3/CD28 e IL-2 sono stati utilizzati per attivare le cellule T alle rispettive concentrazioni di MNA per 7 giorni. Il mezzo è stato raccolto prima e dopo 4 ore di stimolazione con PMA/ionomicina. Le concentrazioni di TNFα (E), IFN-γ (F) e IL-2 (G) sono state misurate mediante ELISA. Il grafico a barre rappresenta la media (n = 5 donatori sani) + SEM. Il valore P è stato determinato utilizzando l'analisi della varianza a una via e le misurazioni ripetute (*P < 0,05). La linea tratteggiata indica il limite di rilevamento. (H) Saggio di lisi cellulare. Le cellule FRα-CAR-T o GFP-CAR-T sono state trattate con adenosina (250 μM) o MNA (10 mM) per 24 ore, oppure lasciate non trattate (Ctrl). È stata misurata la percentuale di uccisione delle cellule SK-OV-3. Valore P determinato mediante test t di Welch (*P<0,5 e **P<0,01).
Al fine di ottenere una comprensione meccanicistica della regolazione dell'espressione di TNFα dipendente da MNA, sono state valutate le modifiche nell'mRNA di TNFα delle cellule T trattate con MNA (Figura 5A). Le cellule T di donatori sani trattate con MNA hanno mostrato un aumento di due volte nei livelli di trascrizione di TNFα, indicando che MNA è dipendente dalla regolazione trascrizionale di TNFα. Per studiare questo possibile meccanismo regolatorio, sono stati valutati due fattori di trascrizione noti che regolano TNFα, ovvero il fattore nucleare delle cellule T attivato (NFAT) e la proteina specifica 1 (Sp1), in risposta al legame di MNA al promotore prossimale di TNFα (30). Il promotore di TNFα contiene 6 siti di legame NFAT identificati e 2 siti di legame Sp1, sovrapposti in un sito [-55 paia di basi (bp) dal cappuccio 5'] (30). L'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) ha mostrato che, quando trattato con MNA, il legame di Sp1 al promotore di TNFα è aumentato di tre volte. L'incorporazione di NFAT è aumentata e ha assunto un'importanza crescente (Figura 5B). Questi dati indicano che MNA regola l'espressione di TNFα attraverso la trascrizione di Sp1 e, in misura minore, l'espressione di NFAT.
(A) Rispetto alle cellule T coltivate senza MNA, la variazione di espressione di TNFα nelle cellule T trattate con MNA. Viene mostrato il pattern di espressione con SEM (n = 5 donatori sani). Rappresenta i dati di almeno n = 3 esperimenti indipendenti. (B) Il promotore di TNFα delle cellule T trattate con o senza 8 mM di MNA dopo che NFAT e Sp1 sono stati combinati con (Ctrl) e stimolazione con PMA/ionomicina per 4 ore. L'immunoglobulina G (IgG) e H3 sono state utilizzate rispettivamente come controlli negativo e positivo per l'immunoprecipitazione. La quantificazione di ChIP ha mostrato che il legame di Sp1 e NFAT al promotore di TNFα nelle cellule trattate con MNA è aumentato di diverse volte rispetto al controllo. Rappresenta i dati di almeno n = 3 esperimenti indipendenti. Valore P determinato da test t multipli (*** P <0,01). (C) Rispetto all'ascite dell'HGSC, le cellule T (non citotossiche) hanno mostrato un'espressione aumentata di TNF nel tumore. I colori rappresentano pazienti diversi. Le cellule visualizzate sono state campionate casualmente a 300 e jitterate per limitare il disegno eccessivo (** Padj = 0,0076). (D) Modello proposto di MNA per il cancro ovarico. L'MNA è prodotto nelle cellule tumorali e nei fibroblasti nel TME e viene assorbito dalle cellule T. L'MNA aumenta il legame di Sp1 al promotore del TNFα, portando a un aumento della trascrizione del TNFα e della produzione della citochina TNFα. L'MNA causa anche una diminuzione dell'IFN-γ. L'inibizione della funzione delle cellule T porta a una ridotta capacità di uccisione e a una crescita tumorale accelerata.
Secondo quanto riportato, il TNFα ha effetti antitumorali dipendenti sia dalla direzione anteriore che posteriore, ma ha un ruolo ben noto nel promuovere la crescita e la metastasi del cancro ovarico (31-33). Secondo quanto riportato, la concentrazione di TNFα nell'ascite e nei tessuti tumorali di pazienti con cancro ovarico è più alta rispetto a quella nei tessuti benigni (34-36). In termini di meccanismo, il TNFα può regolare l'attivazione, la funzione e la proliferazione dei globuli bianchi e modificare il fenotipo delle cellule tumorali (37, 38). In linea con questi risultati, l'analisi dell'espressione genica differenziale ha mostrato che il TNF era significativamente sovraregolato nelle cellule T nei tessuti tumorali rispetto all'ascite (Figura 5C). L'aumento dell'espressione di TNF era evidente solo nelle popolazioni di cellule T con un fenotipo non citotossico (Figura S5A). In sintesi, questi dati supportano l'idea che l'MNA abbia un duplice effetto immunosoppressivo e di promozione tumorale nell'HGSC.
La marcatura fluorescente basata sulla citometria a flusso è diventata il metodo principale per studiare il metabolismo dei TIL. Questi studi hanno dimostrato che, rispetto ai linfociti del sangue periferico o alle cellule T provenienti da organi linfoidi secondari, i TIL murini e umani hanno una maggiore tendenza ad assorbire glucosio (4, 39) e una graduale perdita della funzione mitocondriale (19, 40). Sebbene in questo studio abbiamo osservato risultati simili, lo sviluppo chiave consiste nel confrontare il metabolismo delle cellule tumorali e dei TIL provenienti dallo stesso tessuto tumorale resecato. In linea con alcuni di questi precedenti studi, le cellule tumorali (CD45-EpCAM+) provenienti da ascite e tumori presentano un assorbimento di glucosio maggiore rispetto alle cellule T CD8+ e CD4+, a supporto del fatto che l'elevato assorbimento di glucosio delle cellule tumorali può essere paragonato a quello delle cellule T. Il concetto di competizione delle cellule T. TME. Tuttavia, l'attività mitocondriale delle cellule tumorali è superiore a quella delle cellule T CD8+, ma è simile a quella delle cellule T CD4+. Questi risultati rafforzano il tema emergente secondo cui il metabolismo ossidativo è importante per le cellule tumorali (41, 42). Suggeriscono inoltre che le cellule T CD8+ potrebbero essere più suscettibili alla disfunzione ossidativa rispetto alle cellule T CD4+, o che le cellule T CD4+ potrebbero utilizzare fonti di carbonio diverse dal glucosio per mantenere l'attività mitocondriale (43, 44). Va notato che non abbiamo osservato alcuna differenza nell'assorbimento di glucosio o nell'attività mitocondriale tra cellule T effettrici CD4+, cellule T della memoria effettrici e cellule T della memoria centrale nell'ascite. Allo stesso modo, lo stato di differenziazione delle cellule T CD8+ nei tumori non ha nulla a che fare con i cambiamenti nell'assorbimento di glucosio, evidenziando la differenza significativa tra le cellule T coltivate in vitro e i TIL umani in vivo (22). Queste osservazioni sono state confermate anche dall'uso di un'allocazione automatica imparziale della popolazione cellulare, che ha ulteriormente rivelato che le cellule CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ con un assorbimento di glucosio e un'attività mitocondriale superiori rispetto alle cellule tumorali sono prevalenti ma hanno una popolazione cellulare metabolicamente attiva. Questa popolazione potrebbe rappresentare la presunta sottopopolazione di cellule soppressorie mieloidi o cellule dendritiche plasmocitoidi identificate nell'analisi scRNA-seq. Sebbene entrambe siano state segnalate nei tumori ovarici umani [45], è ancora necessario ulteriore lavoro per descrivere questa sottopopolazione mieloide.
Sebbene i metodi basati sulla citometria a flusso possano chiarire le differenze generali nel metabolismo del glucosio e ossidativo tra i tipi cellulari, i metaboliti precisi prodotti dal glucosio o da altre fonti di carbonio per il metabolismo mitocondriale nel microambiente tumorale non sono ancora stati determinati. L'assegnazione della presenza o assenza di metaboliti a un dato sottogruppo di TIL richiede la purificazione della popolazione cellulare dal tessuto escisso. Pertanto, il nostro metodo di arricchimento cellulare combinato con la spettrometria di massa può fornire informazioni sui metaboliti che sono arricchiti in modo differenziale nelle cellule T e nelle popolazioni di cellule tumorali in campioni di pazienti corrispondenti. Sebbene questo metodo abbia vantaggi rispetto alla citometria a flusso, alcune librerie di metaboliti possono essere influenzate a causa della stabilità intrinseca e/o del rapido tasso di ricambio (22). Tuttavia, il nostro metodo è stato in grado di identificare due metaboliti immunosoppressivi riconosciuti, adenosina e chinurenina, poiché variano notevolmente tra i tipi di campione.
La nostra analisi metabolomica dei tumori e dei sottotipi di TIL fornisce ulteriori informazioni sul ruolo dei metaboliti nel microambiente tumorale ovarico. In primo luogo, mediante citometria a flusso, abbiamo determinato che non vi erano differenze nell'attività mitocondriale tra tumori e cellule T CD4+. Tuttavia, l'analisi LC-MS/MS ha rivelato cambiamenti significativi nell'abbondanza di metaboliti tra queste popolazioni, indicando che le conclusioni sul metabolismo dei TIL e sulla sua attività metabolica complessiva richiedono un'attenta interpretazione. In secondo luogo, l'MNA è il metabolita con la maggiore differenza tra le cellule CD45- e le cellule T nell'ascite, non nei tumori. Pertanto, la compartimentalizzazione e la localizzazione del tumore possono avere effetti diversi sul metabolismo dei TIL, il che evidenzia la possibile eterogeneità in un dato microambiente. In terzo luogo, l'espressione dell'enzima NNMT, responsabile della produzione di MNA, è principalmente limitata ai CAF, che sono in misura minore cellule tumorali, ma livelli rilevabili di MNA sono stati osservati nelle cellule T derivate dal tumore. La sovraespressione di NNMT nei CAF ovarici ha un noto effetto di promozione del cancro, in parte dovuto alla promozione del metabolismo dei CAF, dell'invasione tumorale e delle metastasi (27). Sebbene il livello complessivo di TIL sia moderato, l'espressione di NNMT nei CAF è strettamente correlata al sottotipo mesenchimale del Cancer Genome Atlas (TCGA), che è associato a una prognosi sfavorevole (27, 46, 47). Infine, l'espressione dell'enzima AOX1 responsabile della degradazione di MNA è limitata anche alla popolazione di CAF, il che indica che le cellule T non sono in grado di metabolizzare MNA. Questi risultati supportano l'idea che, sebbene siano necessari ulteriori studi per verificare questa scoperta, alti livelli di MNA nelle cellule T possano indicare la presenza di un microambiente CAF immunosoppressivo.
Dato il basso livello di espressione dei trasportatori di MNA e i livelli non rilevabili delle proteine ​​chiave coinvolte nel metabolismo dell'MNA, la presenza di MNA nelle cellule T è inaspettata. Né NNMT né AOX1 sono stati rilevati mediante analisi scRNA-seq e qPCR mirata in due coorti indipendenti. Questi risultati indicano che l'MNA non viene sintetizzato dalle cellule T, ma assorbito dal microambiente tumorale circostante. Esperimenti in vitro mostrano che le cellule T tendono ad accumulare MNA esogeno.
I nostri studi in vitro hanno dimostrato che l'MNA esogeno induce l'espressione di TNFα nelle cellule T e potenzia il legame di Sp1 al promotore del TNFα. Sebbene il TNFα abbia funzioni sia antitumorali che antitumorali, nel cancro ovarico può promuovere la crescita del tumore (31-33). La neutralizzazione del TNFα nelle colture di cellule tumorali ovariche o l'eliminazione del segnale del TNFα nei modelli murini può migliorare la produzione di citochine infiammatorie mediata dal TNFα e inibire la crescita del tumore (32, 35). Pertanto, in questo caso, l'MNA derivato dal TME può agire come metabolita pro-infiammatorio attraverso un meccanismo dipendente dal TNFα tramite il ciclo autocrino, promuovendo così l'insorgenza e la diffusione del cancro ovarico (31). Sulla base di questa possibilità, il blocco del TNFα è oggetto di studio come potenziale agente terapeutico per il cancro ovarico (37, 48, 49). Inoltre, l'MNA compromette la citotossicità delle cellule CAR-T verso le cellule tumorali ovariche, fornendo ulteriore prova dell'immunosoppressione mediata dall'MNA. Nel complesso, questi risultati suggeriscono un modello in cui i tumori e le cellule CAF secernono MNA nel microambiente tumorale extracellulare. Attraverso (i) la stimolazione della crescita del cancro ovarico indotta dal TNF e (ii) l'inibizione dell'attività citotossica delle cellule T indotta dall'MNA, ciò potrebbe avere un duplice effetto sul tumore (Figura 5D).
In conclusione, applicando una combinazione di arricchimento cellulare rapido, sequenziamento a singola cellula e profilazione metabolica, questo studio ha rivelato le enormi differenze immunometabolomiche tra cellule tumorali e cellule ascitiche in pazienti con HGSC. Questa analisi completa ha mostrato che esistono differenze nell'assorbimento di glucosio e nell'attività mitocondriale tra le cellule T e ha identificato MNA come un metabolita immunoregolatore non autonomo a livello cellulare. Questi dati hanno un impatto su come il microambiente tumorale influisce sul metabolismo delle cellule T nei tumori umani. Sebbene sia stata riportata una competizione diretta per i nutrienti tra cellule T e cellule tumorali, i metaboliti possono anche agire come regolatori indiretti per promuovere la progressione del tumore e possibilmente sopprimere le risposte immunitarie endogene. Un'ulteriore descrizione del ruolo funzionale di questi metaboliti regolatori potrebbe aprire la strada a strategie alternative per potenziare la risposta immunitaria antitumorale.
I campioni dei pazienti e i dati clinici sono stati ottenuti tramite la biobanca di tessuti tumorali della Columbia Britannica, certificata dal Canadian Tissue Repository Network. In conformità con il protocollo approvato dal BC Cancer Research Ethics Committee e dall'Università della British Columbia (H07-00463), per tutti i campioni e i dati clinici dei pazienti è stato ottenuto il consenso informato scritto o la rinuncia formale al consenso. I campioni sono conservati nella Biobanca certificata (BRC-00290). Le caratteristiche dettagliate dei pazienti sono riportate nelle Tabelle S1 e S5. Per la crioconservazione, si utilizza un bisturi per decomporre meccanicamente il campione tumorale del paziente e quindi lo si fa passare attraverso un filtro da 100 micron per ottenere una sospensione di cellule singole. Il liquido ascitico del paziente è stato centrifugato a 1500 giri/min per 10 minuti a 4 °C per sedimentare le cellule e rimuovere il surnatante. Le cellule ottenute dal tumore e dal liquido ascitico sono state crioconservate in una soluzione composta al 50% da siero umano AB inattivato termicamente (Sigma-Aldrich), al 40% da RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) e al 10% da dimetilsolfossido. Queste sospensioni di cellule singole, una volta crioconservate, sono state scongelate e utilizzate per le analisi metabolomiche e la determinazione dei metaboliti descritte di seguito.
Il terreno di coltura completo è costituito da RPMI 1640:AimV filtrato a 0,22 μm e supplementato in rapporto 50:50. RPMI 1640 + 2,05 mM di l-glutammina (Thermo Fisher Scientific) supplementato con 10% di siero umano AB inattivato termicamente (Sigma-Aldrich), 12,5 mM di Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM di l-glutammina (Thermo Fisher Scientific), 1 x soluzione di penicillina-streptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) e 50 μM di mercaptoetanolo. AimV (Invitrogen) è supplementato con 20 mM di Hepes (Thermo Fisher Scientific) e 2 mM di l-glutammina (Thermo Fisher Scientific). Il tampone di colorazione per citometria a flusso era costituito da soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; Invitrogen) filtrata a 0,22 μm e integrata con il 3% di siero umano AB inattivato termicamente (Sigma). Il tampone di arricchimento cellulare era composto da PBS filtrato a 0,22 μm e integrato con lo 0,5% di siero umano AB inattivato termicamente (Sigma-Aldrich).
In terreno di coltura completo a 37°C, le cellule sono state colorate con 10 nM di MT DR e 100 μM di 2-NBDG per 30 minuti. Successivamente, le cellule sono state colorate con il colorante di vitalità eF506 a 4°C per 15 minuti. Risospendere le cellule in FC Block (eBioscience) e Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluire in tampone di colorazione per citometria a flusso (secondo le istruzioni del produttore) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Colorare le cellule con una serie di anticorpi (Tabella S2) in tampone di colorazione per citometria a flusso a 4°C per 20 minuti. Risospendere le cellule in tampone di colorazione per citometria a flusso (Cytek Aurora; configurazione 3L-16V-14B-8R) prima dell'analisi. Utilizzare SpectroFlo e FlowJo V10 per analizzare i dati di conteggio cellulare e GraphPad Prism 8 per creare i dati. L'intensità di fluorescenza mediana (MFI) di 2-NBDG e MT DR è stata normalizzata in scala logaritmica, quindi è stato utilizzato un test t appaiato per l'analisi statistica al fine di tenere conto dei pazienti abbinati. Rimuovere dall'analisi tutte le popolazioni con meno di 40 eventi; inserire un valore MFI pari a 1 per eventuali valori negativi prima di eseguire l'analisi statistica e la visualizzazione dei dati.
Al fine di integrare la strategia di gating manuale del pannello di processo sopra descritto, abbiamo utilizzato l'annotazione completa tramite l'albero di restrizione della forma (FAUST) (21) per assegnare automaticamente le cellule alla popolazione dopo aver eliminato le cellule morte in FlowJo. Gestiamo manualmente l'output per unire le popolazioni che sembrano essere allocate in modo errato (combinando cellule tumorali PD1+ con cellule tumorali PD1-) e le popolazioni mantenute. Ogni campione contiene in media più del 2% di cellule, per un totale di 11 popolazioni.
La centrifugazione a gradiente di densità di Ficoll è stata utilizzata per separare le PBMC dai prodotti di separazione dei leucociti (STEMCELL Technologies). Le cellule T CD8+ sono state isolate dalle PBMC utilizzando CD8 MicroBeads (Miltenyi) ed espanse in terreno completo utilizzando TransAct (Miltenyi) per 2 settimane secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state lasciate a riposo per 5 giorni in terreno completo contenente IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) e quindi ristimolate con TransAct. Al giorno 7, secondo le istruzioni del produttore, sono state utilizzate microsfere CD45 umane (Miltenyi) per arricchire le cellule in tre cicli consecutivi. Le cellule sono state aliquote per l'analisi mediante citometria a flusso (come descritto sopra) e un milione di cellule sono state aliquote tre volte per l'analisi LC-MS/MS. I campioni sono stati processati mediante LC-MS/MS come descritto di seguito. Abbiamo stimato il valore del metabolita mancante con un numero di ioni pari a 1.000. Ciascun campione viene normalizzato in base al numero totale di ioni (TIC), convertito logaritmicamente e normalizzato automaticamente in MetaboAnalystR prima dell'analisi.
La sospensione di cellule singole di ciascun paziente è stata scongelata e filtrata attraverso un filtro da 40 μm in terreno di coltura completo (come descritto in precedenza). Secondo il protocollo del produttore, sono stati utilizzati tre cicli consecutivi di selezione positiva mediante separazione con microsfere magnetiche utilizzando MicroBeads (Miltenyi) per arricchire i campioni di cellule CD8+, CD4+ e CD45- (mantenuti in ghiaccio). In breve, le cellule vengono risospese in tampone di arricchimento cellulare (come descritto in precedenza) e contate. Le cellule sono state incubate con microsfere CD8 umane, microsfere CD4 umane o microsfere CD45 umane (Miltenyi) a 4°C per 15 minuti, quindi lavate con tampone di arricchimento cellulare. Il campione viene fatto passare attraverso la colonna LS (Miltenyi) e vengono raccolte le frazioni positive e negative. Al fine di ridurre la durata e massimizzare la fase di recupero cellulare, la frazione CD8- viene quindi utilizzata per il secondo ciclo di arricchimento CD4+ e la frazione CD4 viene utilizzata per il successivo arricchimento CD45-. Durante tutto il processo di separazione, mantenere la soluzione in ghiaccio.
Per preparare i campioni per l'analisi dei metaboliti, le cellule sono state lavate una volta con una soluzione salina ghiacciata e a ciascun campione è stato aggiunto 1 ml di metanolo all'80%, quindi agitato con un vortex e congelato rapidamente in azoto liquido. I campioni sono stati sottoposti a tre cicli di congelamento-scongelamento e centrifugati a 14.000 rpm per 15 minuti a 4°C. Il surnatante contenente i metaboliti è stato fatto evaporare fino a completa essiccazione. I metaboliti sono stati ridisciolti in 50 μl di acido formico allo 0,03%, agitati con un vortex per miscelare e quindi centrifugati per rimuovere i detriti.
Estrarre i metaboliti come descritto sopra. Trasferire il supernatante in una bottiglia per cromatografia liquida ad alte prestazioni per la ricerca metabolomica. Utilizzare un protocollo di trattamento casuale per trattare ciascun campione con un numero simile di cellule per prevenire effetti batch. Abbiamo eseguito una valutazione qualitativa dei metaboliti globali precedentemente pubblicata sullo spettrometro di massa a triplo quadrupolo AB SCIEX QTRAP 5500 (50). L'analisi cromatografica e l'integrazione dell'area del picco sono state eseguite utilizzando il software MultiQuant versione 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
È stato utilizzato un conteggio ionico di 1000 per stimare il valore del metabolita mancante e il TIC di ciascun campione è stato utilizzato per calcolare l'area del picco normalizzata di ciascun metabolita rilevato per correggere le modifiche introdotte dall'analisi strumentale dalla lavorazione del campione. Dopo la normalizzazione del TIC, MetaboAnalystR(51) (parametro predefinito) viene utilizzato per la conversione logaritmica e la scalatura automatica della linea di normalizzazione. Abbiamo utilizzato la PCA con il pacchetto vegan R per eseguire l'analisi esplorativa delle differenze del metaboloma tra i tipi di campione e abbiamo utilizzato l'analisi di ridondanza parziale per analizzare i pazienti. Abbiamo utilizzato il metodo di Ward per costruire un dendrogramma della mappa di calore per raggruppare la distanza euclidea tra i campioni. Abbiamo utilizzato limma (52) sull'abbondanza standardizzata dei metaboliti per identificare i metaboliti differenzialmente abbondanti nell'intero tipo di cellula e microambiente. Al fine di semplificare la spiegazione, utilizziamo il parametro della media di gruppo per specificare il modello e consideriamo i tipi di cellula nel microambiente come ciascun gruppo (n = 6 gruppi); Per il test di significatività, abbiamo eseguito tre misurazioni ripetute per ciascun metabolita. Al fine di evitare false replicazioni, il paziente è stato incluso come ostacolo nel disegno limma. Per verificare le differenze nei metaboliti tra pazienti diversi, abbiamo adattato il modello limma includendo i pazienti in modo fisso. Riportiamo la significatività del contrasto pre-specificato tra il tipo di cellula e il microambiente di Padj <0,05 (correzione di Benjamini-Hochberg).
Dopo l'arricchimento del vigore utilizzando il kit di rimozione delle cellule morte Miltenyi (>80% di vitalità), è stato eseguito il sequenziamento del trascrittoma a singola cellula sui campioni totali di ascite congelata viva e di tumore utilizzando un protocollo di espressione genica 5′ 10x. Sono stati analizzati cinque casi con tumori e ascite corrispondenti, sebbene la bassa vitalità di un campione tumorale ne abbia impedito l'inclusione. Al fine di ottenere selezioni multiple di pazienti, abbiamo combinato i campioni di ciascun paziente nelle corsie del controller al cromo 10x e analizzato separatamente i siti di ascite e tumore. Dopo il sequenziamento [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genoma del Quebec; una media di 73.488 e 41.378 letture per cellula rispettivamente per tumore e ascite]], abbiamo utilizzato CellSNP e Vireo (53) (basato su CellSNP come Il comune SNP umano (VCF) fornito da GRCh38 è assegnato un'identità del donatore. Utilizziamo SNPRelate per inferire l'identità più vicina (IBS) dello stato del genotipo del paziente (IBS), escludendo le cellule non assegnate e le cellule identificate come duplex e i donatori corrispondenti tra campioni di ascite e tumore (54). Sulla base di questo compito, abbiamo mantenuto tre casi con abbondante rappresentazione cellulare nel tumore e nell'ascite per l'analisi successiva. Dopo aver eseguito una fase di filtrazione di massa nel packaging BioConductor scater (55) e scran (56), questo ha prodotto 6975 cellule (2792 e 4183 cellule rispettivamente da tumore e ascite) per l'analisi. Utilizziamo il clustering di Louvain di igraph (57) della rete del vicino più prossimo condiviso (SNN) basato su Distanza di Jaccard per raggruppare le cellule in base all'espressione. I cluster sono stati annotati manualmente in tipi cellulari putativi in ​​base all'espressione del gene marker e visualizzati con t-SNE. Le cellule T citotossiche sono definite dall'espressione di CD8A e GZMA, escludendo i sottocluster con bassa espressione di proteine ​​ribosomiali. Abbiamo avuto accesso ai dati pubblicati da Izar et al. (16), incluso il loro embedding t-SNE, che può controllare la sovrapposizione dell'espressione tra i marcatori delle cellule immunitarie e l'espressione di NNMT.
Le PBMC sono state separate dai prodotti di separazione dei leucociti (STEMCELL Technologies) mediante centrifugazione su gradiente di densità di Ficoll. Le cellule CD3+ sono state isolate dalle PBMC utilizzando microsfere di CD3 (Miltenyi). In presenza o assenza di MNA, le cellule CD3+ sono state attivate con CD3 immobilizzato su piastra (5 μg/ml), CD28 solubile (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin). L'ultimo giorno di espansione, la vitalità (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) e la proliferazione (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) sono state valutate mediante citometria a flusso. Valutare la funzione effettore stimolando le cellule con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) con GolgiStop per 4 ore e monitorare CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) e TNFα-isotiocianato di fluoresceina (FITC) (MAb11, BD). Stimolare le cellule per qPCR e ChIP con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) per 4 ore. Il supernatante ELISA è stato raccolto prima e dopo la stimolazione con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) per 4 ore.
Seguire il protocollo del produttore per isolare l'RNA utilizzando il kit RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Utilizzare QIAshredder (QIAGEN) per omogeneizzare il campione. Utilizzare il kit High-Capacity RNA to cDNA (Thermo Fisher Scientific) per sintetizzare il DNA complementare (cDNA). Utilizzare il TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) per quantificare l'espressione genica (secondo il protocollo del produttore) con le seguenti sonde: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldeide-3-fosfato di idrogeno (GAPDH)] e Hs01010726_m1 (SLC22A2). I campioni sono stati analizzati con il sistema PCR in tempo reale StepOnePlus (Applied Biosystems) utilizzando la piastra di reazione MicroAmp fast optical a 96 pozzetti (Applied Biosystems) con pellicola ottica MicroAmp. Qualsiasi valore Ct superiore a 35 è considerato al di sopra della soglia di rilevamento e viene indicato come non rilevabile.
Eseguire ChIP come precedentemente descritto (58). In breve, le cellule sono state trattate con formaldeide (concentrazione finale 1,42%) e incubate a temperatura ambiente per 10 minuti. Utilizzare tampone di rigonfiamento supplementato (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl e 0,1% NP-40) su ghiaccio per 10 minuti, quindi risospendere in tampone di immunoprecipitazione come descritto (58). Il campione è stato quindi sonicato con i seguenti cicli: 10 cicli (20 impulsi di 1 secondo) e un tempo statico di 40 secondi. Incubare immunoglobulina G di grado ChIP (Cell Signaling Technology; 1 μl), istone H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) e anticorpi SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) con il campione a 4 °C agitando per tutta la notte. Incubare le microsfere di proteina A (Thermo Fisher Scientific) con il campione a 4°C con delicata agitazione per 1 ora, quindi utilizzare le microsfere di Chelex (Bio-Rad) per arricchire il DNA e utilizzare la proteinasi K (Thermo Fisher) per la digestione delle proteine. Il promotore del TNFα è stato rilevato mediante PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; inverso, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (prodotto di 207 bp). Le immagini sono state prodotte da Image Lab (Bio-Rad) e quantificate utilizzando il software ImageJ.
Il surnatante della coltura cellulare è stato raccolto come descritto in precedenza. La determinazione è stata effettuata secondo le procedure del produttore del kit ELISA per TNFα umano (Invitrogen), del kit ELISA per IL-2 umano (Invitrogen) e del kit ELISA per IFN-γ umano (Abcam). Secondo il protocollo del produttore, il surnatante è stato diluito 1:100 per rilevare TNFα e IL-2 e 1:3 per rilevare IFN-γ. Utilizzare il lettore multilabel EnVision 2104 (PerkinElmer) per misurare l'assorbanza a 450 nm.
Le PBMC sono state separate dai prodotti di separazione dei leucociti (STEMCELL Technologies) mediante centrifugazione su gradiente di densità di Ficoll. Le cellule CD3+ sono state isolate dalle PBMC utilizzando microsfere di CD3 (Miltenyi). In presenza o assenza di MNA, le cellule CD3+ sono state attivate con CD3 immobilizzato su piastra (5 μg/ml), CD28 solubile (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin) per 3 giorni. Dopo 3 giorni, le cellule sono state raccolte e lavate con soluzione fisiologica allo 0,9%, e il pellet è stato congelato rapidamente. Il conteggio cellulare è stato eseguito mediante citometria a flusso (Cytek Aurora; configurazione 3L-16V-14B-8R) utilizzando microsfere eBeads a 123 conteggi.
Estrarre i metaboliti come descritto in precedenza. L'estratto essiccato è stato ricostituito a una concentrazione di 4000 equivalenti cellulari/μl. Analizzare il campione mediante cromatografia in fase inversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e colonna CORTECS T3 (2,1×150 mm, dimensione delle particelle 1,6 μm, dimensione dei pori 120 Å; #186008500, Waters). Spettrometro di massa polare (6470, Agilent), in cui l'ionizzazione elettrospray opera in modalità positiva. La fase mobile A è acido formico allo 0,1% (in H2O), la fase mobile B è acetonitrile al 90%, acido formico allo 0,1%. Il gradiente LC è da 0 a 2 minuti per il 100% A, da 2 a 7,1 minuti per il 99% B e da 7,1 a 8 minuti per il 99% B. Quindi riequilibrare la colonna con la fase mobile A a una velocità di flusso di 0,6 ml/min per 3 minuti. La velocità di flusso è di 0,4 ml/min e la camera della colonna è riscaldata a 50 °C. Utilizzare lo standard chimico puro MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) per stabilire il tempo di ritenzione (RT) e la trasformazione (RT = 0,882 minuti, trasformazione 1 = 137→94,1, trasformazione 2 = 137→92, conversione 3 = 137→78). Quando tutte e tre le transizioni si verificano al tempo di ritenzione corretto, la transizione 1 viene utilizzata per la quantificazione per garantire la specificità. La curva standard di MNA (Toronto Research Chemical Company) è stata generata mediante sei diluizioni seriali della soluzione madre (1 mg/ml) per ottenere standard di 0,1, 1,0, 10 e 100 ng/ml e 1,0 e 10 μg/ml rispettivamente in fase liquida. Il limite di rilevamento è di 1 ng/ml e la risposta lineare è compresa tra 10 ng/ml e 10 μg/ml. Ogni iniezione di due microlitri di campione e standard viene utilizzata per l'analisi LC/MS e un campione di controllo qualità misto viene analizzato ogni otto iniezioni per garantire la stabilità della piattaforma analitica. Le risposte di MNA di tutti i campioni cellulari trattati con MNA rientravano nell'intervallo lineare del test. L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il software di analisi quantitativa MassHunter (v9.0, Agilent).
Il costrutto αFR-CAR di seconda generazione è stato preso da Song et al. (59). In breve, il costrutto contiene i seguenti elementi: sequenza leader CD8a, frammento variabile a catena singola specifico per αFR umano, regione cerniera e transmembrana CD8a, dominio intracellulare CD27 e dominio intracellulare CD3z. La sequenza CAR completa è stata sintetizzata da GenScript e quindi clonata nel vettore di espressione lentivirale di seconda generazione a monte della cassetta di espressione GFP utilizzata per valutare l'efficienza di trasduzione.
Il lentivirus è prodotto mediante transfezione di cellule HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); coltivate in terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle Medium contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di PenStrep, e sono stati utilizzati il ​​vettore CAR-GFP e i plasmidi di confezionamento (psPAX2 e pMD2.G, Addgene) utilizzando la lipofezione ammina (Sigma-Aldrich). Il supernatante contenente il virus è stato raccolto 48 e 72 ore dopo la transfezione, filtrato e concentrato mediante ultracentrifugazione. Conservare il supernatante virale concentrato a -80°C fino alla transduzione.
Le PBMC vengono separate dai prodotti di separazione dei leucociti di donatori sani (STEMCELL Technologies) mediante centrifugazione in gradiente di densità di Ficoll. Utilizzare microsfere CD8 a selezione positiva (Miltenyi) per isolare le cellule CD8+ dalle PBMC. Stimolare le cellule T con TransAct (Miltenyi) e in terreno TexMACS [Miltenyi; supplementato con siero umano inattivato termicamente al 3%, PenStrep all'1% e IL-2 (300 U/ml)]. Ventiquattro ore dopo la stimolazione, le cellule T vengono trasdotte con lentivirus (10 μl di supernatante virale concentrato per 10⁶ cellule). Da 1 a 3 giorni dopo la trasduzione su Cytek Aurora (su FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), valutare l'espressione di GFP delle cellule per dimostrare un'efficienza di trasduzione di almeno il 30%.
Le cellule CAR-T sono state coltivate per 24 ore in Immunocult (STEMCELL Technologies; supplementato con 1% di PenStrep) nelle seguenti condizioni: non trattate, trattate con 250 μM di adenosina o 10 mM di MNA. Dopo il pretrattamento, le cellule CAR-T sono state lavate con PBS e combinate con 20.000 cellule SK-OV-3 [ATCC; in terreno McCoy 5A (Sigma-Aldrich) supplementato con 10% di FBS e 1% di PenStrep a 10: Il rapporto effettore/bersaglio di 1 è stato amplificato in triplicato in terreno Immunocult supplementato. Le cellule SK-OV-3 e le cellule SK-OV-3 lisate con saponina digitale (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) sono state utilizzate rispettivamente come controlli negativo e positivo. Dopo 24 ore di co-coltura, il surnatante è stato raccolto e l'attività della lattato deidrogenasi (LDH) è stata misurata secondo le istruzioni del produttore (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Il surnatante contenente LDH è stato diluito 1:50 in tampone LDH. La percentuale di uccisione è stata calcolata utilizzando la seguente formula: percentuale di uccisione = percentuale di correzione / tasso di uccisione massimo x 100%, dove percentuale di correzione = co-coltura - solo cellule T e tasso di uccisione massimo = controllo positivo - controllo negativo.
Come descritto nel testo o nella sezione materiali e metodi, per l'analisi statistica si utilizzano GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0. Se vengono raccolti più campioni dallo stesso paziente (ad esempio, liquido ascitico e tessuto tumorale), si utilizza un test t per dati appaiati oppure si include il paziente come effetto casuale in un modello lineare o generalizzato, a seconda dei casi. Per l'analisi metabolomica, il test di importanza viene eseguito in triplice copia.
Per consultare il materiale supplementare relativo a questo articolo, visitare il sito http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA contribuisce all'immunosoppressione delle cellule T e rappresenta un potenziale bersaglio immunoterapico per il trattamento dei tumori umani.
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