È stato dimostrato che l'acido propionico (PPA), un agente antimicotico e comune additivo alimentare, causa uno sviluppo neurologico anomalo nei topi, accompagnato da disfunzioni gastrointestinali, che potrebbero essere causate da disbiosi intestinale. È stato suggerito un legame tra l'esposizione alimentare a PPA e la disbiosi del microbiota intestinale, ma non è stato studiato direttamente. In questo studio, abbiamo studiato i cambiamenti associati al PPA nella composizione del microbiota intestinale che potrebbero portare alla disbiosi. I microbiomi intestinali di topi alimentati con una dieta non trattata (n=9) e con una dieta arricchita con PPA (n=13) sono stati sequenziati utilizzando il sequenziamento metagenomico a lungo raggio per valutare le differenze nella composizione microbica e nelle vie metaboliche batteriche. Il PPA alimentare è stato associato a un aumento dell'abbondanza di taxa significativi, tra cui diverse specie di Bacteroides, Prevotella e Ruminococcus, i cui membri sono stati precedentemente implicati nella produzione di PPA. I microbiomi dei topi esposti a PPA presentavano anche più vie correlate al metabolismo lipidico e alla biosintesi degli ormoni steroidei. I nostri risultati indicano che il PPA può alterare il microbiota intestinale e le vie metaboliche ad esso associate. Questi cambiamenti osservati evidenziano che i conservanti classificati come sicuri per il consumo possono influenzare la composizione del microbiota intestinale e, di conseguenza, la salute umana. Tra questi, P, G o S viene selezionato a seconda del livello di classificazione analizzato. Per minimizzare l'impatto delle classificazioni false positive, è stata adottata una soglia minima di abbondanza relativa di 1e-4 (1/10.000 letture). Prima dell'analisi statistica, le abbondanze relative riportate da Bracken (fraction_total_reads) sono state trasformate utilizzando la trasformazione del rapporto logaritmico centrato (CLR) (Aitchison, 1982). Il metodo CLR è stato scelto per la trasformazione dei dati perché è invariante di scala e sufficiente per dataset non sparsi (Gloor et al., 2017). La trasformazione CLR utilizza il logaritmo naturale. I dati di conteggio riportati da Bracken sono stati normalizzati utilizzando l'espressione logaritmica relativa (RLE) (Anders e Huber, 2010). I dati sono stati generati utilizzando una combinazione di matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 e logaritmi sequenziali (Gloor et al., 2017). 0.12.2 e stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Il rapporto Bacillus/Bacteroidetes è stato calcolato per ciascun campione utilizzando conte batteriche normalizzate. I valori riportati nelle tabelle sono arrotondati a 4 cifre decimali. L'indice di diversità di Simpson è stato calcolato utilizzando lo script alpha_diversity.py fornito nel pacchetto KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Il report Bracken è fornito nello script e l'indice di Simpson "Si" è fornito per il parametro -an. Le differenze significative nell'abbondanza sono state definite come differenze medie CLR ≥ 1 o ≤ -1. Una differenza media del CLR di ±1 indica un aumento di 2,7 volte dell'abbondanza di un tipo di campione. Il segno (+/-) indica se il taxon è più abbondante rispettivamente nel campione PPA e nel campione di controllo. La significatività è stata determinata utilizzando il test U di Mann-Whitney (Virtanen et al., 2020). È stato utilizzato Statsmodels v. 0.14 (Benjamini e Hochberg, 1995; Seabold e Perktold, 2010) e la procedura di Benjamini-Hochberg è stata applicata per correggere i test multipli. Un valore p aggiustato ≤ 0,05 è stato utilizzato come soglia per determinare la significatività statistica.
Il microbioma umano è spesso definito "l'ultimo organo del corpo" e svolge un ruolo vitale per la salute umana (Baquero e Nombela, 2012). In particolare, il microbioma intestinale è riconosciuto per la sua influenza a livello sistemico e per il suo ruolo in molte funzioni essenziali. I batteri commensali sono abbondanti nell'intestino, occupando molteplici nicchie ecologiche, utilizzando i nutrienti e competendo con potenziali patogeni (Jandhyala et al., 2015). Diverse componenti batteriche del microbiota intestinale sono in grado di produrre nutrienti essenziali come le vitamine e di promuovere la digestione (Rowland et al., 2018). È stato anche dimostrato che i metaboliti batterici influenzano lo sviluppo dei tessuti e migliorano i percorsi metabolici e immunitari (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). La composizione del microbioma intestinale umano è estremamente varia e dipende da fattori genetici e ambientali quali dieta, sesso, farmaci e stato di salute (Kumbhare et al., 2019).
La dieta materna è una componente fondamentale dello sviluppo fetale e neonatale e una potenziale fonte di composti che possono influenzare lo sviluppo (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Uno di questi composti di interesse è l'acido propionico (PPA), un acido grasso a catena corta derivato dalla fermentazione batterica e utilizzato come additivo alimentare (den Besten et al., 2013). Il PPA ha proprietà antibatteriche e antimicotiche ed è quindi utilizzato come conservante alimentare e in applicazioni industriali per inibire la crescita di muffe e batteri (Wemmenhove et al., 2016). Il PPA ha effetti diversi nei diversi tessuti. Nel fegato, il PPA ha effetti antinfiammatori influenzando l'espressione delle citochine nei macrofagi (Kawasoe et al., 2022). Questo effetto regolatore è stato osservato anche in altre cellule immunitarie, portando a una downregulation dell'infiammazione (Haase et al., 2021). Tuttavia, l'effetto opposto è stato osservato nel cervello. Studi precedenti hanno dimostrato che l'esposizione al PPA induce comportamenti simili all'autismo nei topi (El-Ansary et al., 2012). Altri studi hanno dimostrato che il PPA può indurre gliosi e attivare vie pro-infiammatorie nel cervello (Abdelli et al., 2019). Poiché il PPA è un acido debole, può diffondersi attraverso l'epitelio intestinale nel flusso sanguigno e quindi attraversare barriere restrittive, tra cui la barriera emato-encefalica e la placenta (Stinson et al., 2019), evidenziando l'importanza del PPA come metabolita regolatore prodotto dai batteri. Sebbene il potenziale ruolo del PPA come fattore di rischio per l'autismo sia attualmente in fase di studio, i suoi effetti sugli individui con autismo potrebbero estendersi oltre l'induzione della differenziazione neurale.
Sintomi gastrointestinali come diarrea e stitichezza sono comuni nei pazienti con disturbi dello sviluppo neurologico (Cao et al., 2021). Studi precedenti hanno dimostrato che il microbioma dei pazienti con disturbi dello spettro autistico (ASD) differisce da quello degli individui sani, suggerendo la presenza di disbiosi del microbiota intestinale (Finegold et al., 2010). Analogamente, anche le caratteristiche del microbioma dei pazienti con malattie infiammatorie intestinali, obesità, morbo di Alzheimer, ecc. differiscono da quelle degli individui sani (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Tuttavia, ad oggi, non è stata stabilita alcuna relazione causale tra il microbioma intestinale e malattie o sintomi neurologici (Yap et al., 2021), sebbene si ritenga che diverse specie batteriche svolgano un ruolo in alcune di queste patologie. Ad esempio, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio e altri generi sono più abbondanti nel microbiota dei pazienti con autismo (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). In particolare, è noto che alcune specie appartenenti a questi generi possiedono geni associati alla produzione di PPA (Reichardt et al., 2014; Yun e Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur e Dürre, 2023). Date le proprietà antimicrobiche del PPA, aumentarne l'abbondanza potrebbe essere utile per la crescita dei batteri che lo producono (Jacobson et al., 2018). Pertanto, un ambiente ricco di PFA può portare a cambiamenti nel microbiota intestinale, compresi i patogeni gastrointestinali, che potrebbero essere potenziali fattori che portano a sintomi gastrointestinali.
Una questione centrale nella ricerca sul microbioma è se le differenze nella composizione microbica siano causa o sintomo di malattie sottostanti. Il primo passo per chiarire la complessa relazione tra dieta, microbioma intestinale e malattie neurologiche è valutare gli effetti della dieta sulla composizione microbica. A tal fine, abbiamo utilizzato il sequenziamento metagenomico a lettura lunga per confrontare i microbiomi intestinali della prole di topi alimentati con una dieta ricca di PPA o povera di PPA. La prole è stata alimentata con la stessa dieta delle loro madri. Abbiamo ipotizzato che una dieta ricca di PPA avrebbe comportato cambiamenti nella composizione microbica intestinale e nei percorsi funzionali microbici, in particolare quelli correlati al metabolismo e/o alla produzione di PPA.
Questo studio ha utilizzato topi transgenici FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) che sovraesprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore GFAP specifico per la glia, seguendo le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) dell'Università della Florida Centrale (Numero di permesso per l'uso animale: PROTO202000002). Dopo lo svezzamento, i topi sono stati alloggiati individualmente in gabbie con 1-5 topi di ciascun sesso per gabbia. I topi sono stati alimentati a volontà con una dieta di controllo purificata (dieta standard modificata in aperto, 16 kcal% di grassi) o una dieta integrata con propionato di sodio (dieta standard modificata in aperto, 16 kcal% di grassi, contenente 5.000 ppm di propionato di sodio). La quantità di propionato di sodio utilizzata era equivalente a 5.000 mg di PFA/kg di peso totale dell'alimento. Questa è la più alta concentrazione di PPA approvata per l'uso come conservante alimentare. Per preparare questo studio, i topi genitori sono stati alimentati con entrambe le diete per 4 settimane prima dell'accoppiamento e hanno continuato per tutta la gravidanza della madre. I topi nati [22 topi, 9 controlli (6 maschi, 3 femmine) e 13 PPA (4 maschi, 9 femmine)] sono stati svezzati e hanno poi continuato con la stessa dieta delle madri per 5 mesi. I topi nati sono stati sacrificati all'età di 5 mesi e il loro contenuto fecale intestinale è stato raccolto e inizialmente conservato in provette da microcentrifuga da 1,5 ml a -20 °C e poi trasferito in un congelatore a -80 °C fino all'esaurimento del DNA ospite e all'estrazione degli acidi nucleici microbici.
Il DNA ospite è stato rimosso secondo un protocollo modificato (Charalampous et al., 2019). In breve, il contenuto fecale è stato trasferito in 500 µl di InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) e conservato congelato. Processare un massimo di 1-2 pellet fecali per estrazione. Il contenuto fecale è stato quindi omogeneizzato meccanicamente utilizzando un pestello di plastica all'interno della provetta per formare una sospensione. Centrifugare i campioni a 10.000 RCF per 5 minuti o fino a quando i campioni non si sono pellettati, quindi aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 250 µl di PBS 1×. Aggiungere 250 µl di soluzione di saponina al 4,4% (TCI, codice prodotto S0019) al campione come detergente per allentare le membrane delle cellule eucariotiche. I campioni sono stati miscelati delicatamente fino a ottenere una consistenza liscia e incubati a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, per disgregare le cellule eucariotiche, sono stati aggiunti al campione 350 μl di acqua priva di nucleasi, incubati per 30 secondi e quindi aggiunti 12 μl di NaCl 5 M. I campioni sono stati quindi centrifugati a 6000 RCF per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μl di PBS 1X. Per rimuovere il DNA ospite, aggiungere 100 μl di tampone HL-SAN (12,8568 g di NaCl, 4 ml di MgCl2 1M, 36 ml di acqua priva di nucleasi) e 10 μl di enzima HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). I campioni sono stati miscelati accuratamente mediante pipettaggio e incubati a 37 °C per 30 minuti a 800 rpm su un Eppendorf™ ThermoMixer C. Dopo l'incubazione, centrifugati a 6000 RCF per 3 minuti e lavati due volte con 800 µl e 1000 µl di PBS 1X. Infine, risospendere il pellet in 100 µl di PBS 1X.
Il DNA batterico totale è stato isolato utilizzando il kit di purificazione del DNA genomico Monarch di New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat. n. T3010L). La procedura operativa standard fornita con il kit è leggermente modificata. Incubare e mantenere l'acqua priva di nucleasi a 60 °C prima dell'operazione per l'eluizione finale. Aggiungere 10 µl di Proteinasi K e 3 µl di RNasi A a ciascun campione. Quindi aggiungere 100 µl di tampone di lisi cellulare e mescolare delicatamente. I campioni sono stati quindi incubati in un Eppendorf™ ThermoMixer C a 56 °C e 1400 rpm per almeno 1 ora e fino a 3 ore. I campioni incubati sono stati centrifugati a 12.000 RCF per 3 minuti e il surnatante di ciascun campione è stato trasferito in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL separata contenente 400 µL di soluzione legante. Le provette sono state quindi agitate con vortex a impulsi per 5-10 secondi a intervalli di 1 secondo. Trasferire l'intero contenuto liquido di ciascun campione (circa 600-700 µL) in una cartuccia filtrante inserita in una provetta di raccolta a flusso continuo. Le provette sono state centrifugate a 1.000 RCF per 3 minuti per consentire il legame iniziale del DNA e quindi centrifugate a 12.000 RCF per 1 minuto per rimuovere il liquido residuo. La colonna del campione è stata trasferita in una nuova provetta di raccolta e quindi lavata due volte. Per il primo lavaggio, aggiungere 500 µL di tampone di lavaggio a ciascuna provetta. Capovolgere la provetta 3-5 volte e quindi centrifugare a 12.000 RCF per 1 minuto. Eliminare il liquido dalla provetta di raccolta e riposizionare la cartuccia filtrante nella stessa provetta di raccolta. Per il secondo lavaggio, aggiungere 500 µL di tampone di lavaggio al filtro senza capovolgere. I campioni sono stati centrifugati a 12.000 RCF per 1 minuto. Trasferire il filtro in una provetta LoBind® da 1,5 mL e aggiungere 100 µL di acqua priva di nucleasi preriscaldata. I filtri sono stati incubati a temperatura ambiente per 1 minuto e quindi centrifugati a 12.000 RCF per 1 minuto. Il DNA eluito è stato conservato a -80 °C.
La concentrazione di DNA è stata quantificata utilizzando un fluorimetro Qubit™ 4.0. Il DNA è stato preparato utilizzando il kit Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity (codice articolo Q33231) secondo le istruzioni del produttore. La distribuzione della lunghezza dei frammenti di DNA è stata misurata utilizzando una TapeStation Aglient™ 4150 o 4200. Il DNA è stato preparato utilizzando i reagenti Agilent™ Genomic DNA (codice articolo 5067-5366) e Genomic DNA ScreenTape (codice articolo 5067-5365). La preparazione della libreria è stata eseguita utilizzando il kit Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding (SQK-RPB004) secondo le istruzioni del produttore. Il DNA è stato sequenziato utilizzando un sequenziatore ONT GridION™ Mk1 con una cella a flusso Min106D (R 9.4.1). Le impostazioni di sequenziamento erano: identificazione delle basi ad alta precisione, valore q minimo di 9, impostazione del codice a barre e ottimizzazione del codice a barre. I campioni sono stati sequenziati per 72 ore, dopodiché i dati relativi all'identificazione delle basi sono stati inviati per ulteriore elaborazione e analisi.
L'elaborazione bioinformatica è stata eseguita utilizzando i metodi precedentemente descritti (Greenman et al., 2024). I file FASTQ ottenuti dal sequenziamento sono stati suddivisi in directory per ciascun campione. Prima dell'analisi bioinformatica, i dati sono stati elaborati utilizzando la seguente pipeline: innanzitutto, i file FASTQ dei campioni sono stati uniti in un unico file FASTQ. Quindi, le letture più corte di 1000 bp sono state filtrate utilizzando Filtlong v. 0.2.1, con l'unico parametro modificato –min_length 1000 (Wick, 2024). Prima di ulteriori filtraggi, la qualità delle letture è stata controllata utilizzando NanoPlot v. 1.41.3 con i seguenti parametri: –fastq –plots dot –N50 -o
Per la classificazione tassonomica, le letture e i contig assemblati sono stati classificati utilizzando Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Generare report e file di output rispettivamente per le letture e gli assemblaggi. Utilizzare l'opzione –use-names per analizzare le letture e gli assemblaggi. Le opzioni –gzip-compressed e –paired sono specificate per i segmenti di lettura. L'abbondanza relativa dei taxa nei metagenomi è stata stimata utilizzando Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Abbiamo inizialmente creato un database kmer contenente 1000 basi utilizzando bracken-build con i seguenti parametri: -d
L'annotazione genica e la stima dell'abbondanza relativa sono state eseguite utilizzando una versione modificata del protocollo descritto da Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Innanzitutto, i contig più corti di 500 bp sono stati rimossi da tutti gli assemblaggi utilizzando SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Gli assemblaggi selezionati sono stati quindi combinati in un pan-metagenoma. Gli open reading frame (ORF) sono stati identificati utilizzando Prodigal v. 1.0.1 (una versione parallela di Prodigal v. 2.6.3) con i seguenti parametri: -d
I geni sono stati inizialmente raggruppati in base agli identificatori di ortologhi (KO) della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) assegnati da eggNOG per confrontare l'abbondanza dei pathway genici. I geni senza knockout o con più knockout sono stati rimossi prima dell'analisi. È stata quindi calcolata l'abbondanza media di ciascun KO per campione ed è stata eseguita l'analisi statistica. I geni del metabolismo del PPA sono stati definiti come qualsiasi gene a cui è stata assegnata la riga ko00640 nella colonna KEGG_Pathway, indicando un ruolo nel metabolismo del propionato secondo KEGG. I geni identificati come associati alla produzione di PPA sono elencati nella Tabella Supplementare 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Sono stati eseguiti test di permutazione per identificare i geni del metabolismo e della produzione di PPA che erano significativamente più abbondanti in ciascun tipo di campione. Sono state eseguite mille permutazioni per ciascun gene analizzato. Un valore p di 0,05 è stato utilizzato come cutoff per determinare la significatività statistica. Le annotazioni funzionali sono state assegnate ai singoli geni all'interno di un cluster in base alle annotazioni dei geni rappresentativi all'interno del cluster. I taxa associati al metabolismo e/o alla produzione di PPA potevano essere identificati confrontando gli ID contig nei file di output di Kraken2 con gli stessi ID contig mantenuti durante l'annotazione funzionale utilizzando eggNOG. Il test di significatività è stato eseguito utilizzando il test U di Mann-Whitney descritto in precedenza. La correzione per i test multipli è stata eseguita utilizzando la procedura di Benjamini-Hochberg. Un valore p ≤ 0,05 è stato utilizzato come cutoff per determinare la significatività statistica.
La diversità del microbioma intestinale dei topi è stata valutata utilizzando l'indice di diversità di Simpson. Non sono state osservate differenze significative tra i campioni di controllo e quelli di PPA in termini di diversità di genere e specie (valore p per genere: 0,18, valore p per specie: 0,16) (Figura 1). La composizione microbica è stata quindi confrontata utilizzando l'analisi delle componenti principali (PCA). La Figura 2 mostra il clustering dei campioni in base ai loro phyla, indicando che c'erano differenze nella composizione delle specie dei microbiomi tra i campioni di PPA e quelli di controllo. Questo clustering era meno pronunciato a livello di genere, suggerendo che il PPA colpisce alcuni batteri (Figura 1 supplementare).
Figura 1. Diversità alfa di generi e composizione di specie del microbioma intestinale del topo. Box plot che mostrano gli indici di diversità di Simpson di generi (A) e specie (B) nei campioni PPA e di controllo. La significatività è stata determinata utilizzando il test U di Mann-Whitney e la correzione multipla è stata eseguita utilizzando la procedura di Benjamini-Hochberg. ns, il valore p non era significativo (p>0,05).
Figura 2. Risultati dell'analisi delle componenti principali della composizione del microbioma intestinale del topo a livello di specie. Il grafico dell'analisi delle componenti principali mostra la distribuzione dei campioni tra le prime due componenti principali. I colori indicano il tipo di campione: i topi esposti a PPA sono viola e i topi di controllo sono gialli. Le componenti principali 1 e 2 sono rappresentate rispettivamente sull'asse x e sull'asse y e sono espresse come rapporto di varianza spiegata.
Utilizzando i dati di conteggio trasformati con RLE, è stata osservata una significativa diminuzione del rapporto Bacteroidetes/Bacilli mediano nei topi di controllo e PPA (controllo: 9,66, PPA: 3,02; valore p = 0,0011). Questa differenza era dovuta alla maggiore abbondanza di Bacteroidetes nei topi PPA rispetto ai controlli, sebbene la differenza non fosse significativa (CLR medio del controllo: 5,51, CLR medio del PPA: 6,62; valore p = 0,054), mentre l'abbondanza di Bacteroidetes era simile (CLR medio del controllo: 7,76, CLR medio del PPA: 7,60; valore p = 0,18).
L'analisi dell'abbondanza dei membri tassonomici del microbioma intestinale ha rivelato che 1 phylum e 77 specie differivano significativamente tra i campioni PPA e quelli di controllo (Tabella supplementare 2). L'abbondanza di 59 specie nei campioni PPA era significativamente superiore a quella nei campioni di controllo, mentre l'abbondanza di sole 16 specie nei campioni di controllo era superiore a quella nei campioni PPA (Figura 3).
Figura 3. Abbondanza differenziale di taxa nel microbioma intestinale di topi PPA e di controllo. I diagrammi a vulcano mostrano differenze nell'abbondanza di generi (A) o specie (B) tra campioni PPA e di controllo. I punti grigi non indicano differenze significative nell'abbondanza di taxa. I punti colorati indicano differenze significative nell'abbondanza (valore p ≤ 0,05). I 20 taxa con le maggiori differenze di abbondanza tra i tipi di campione sono mostrati in rosso e azzurro (campioni di controllo e PPA), rispettivamente. I punti gialli e viola erano almeno 2,7 volte più abbondanti nei campioni di controllo o PPA rispetto ai controlli. I punti neri rappresentano taxa con abbondanze significativamente diverse, con differenze medie di CLR comprese tra -1 e 1. I valori p sono stati calcolati utilizzando il test U di Mann-Whitney e corretti per test multipli utilizzando la procedura di Benjamini-Hochberg. Le differenze medie di CLR in grassetto indicano differenze significative nell'abbondanza.
Dopo aver analizzato la composizione microbica intestinale, abbiamo eseguito un'annotazione funzionale del microbioma. Dopo aver filtrato i geni di bassa qualità, sono stati identificati 378.355 geni univoci in tutti i campioni. L'abbondanza trasformata di questi geni è stata utilizzata per l'analisi delle componenti principali (PCA) e i risultati hanno mostrato un elevato grado di clustering dei tipi di campione in base ai loro profili funzionali (Figura 4).
Figura 4. Risultati dell'analisi PCA utilizzando il profilo funzionale del microbioma intestinale del topo. Il grafico PCA mostra la distribuzione dei campioni tra i loro primi due componenti principali. I colori indicano il tipo di campione: i topi esposti a PPA sono viola e i topi di controllo sono gialli. I componenti principali 1 e 2 sono rappresentati rispettivamente sull'asse x e sull'asse y e sono espressi come rapporto di varianza spiegata.
Abbiamo poi esaminato l'abbondanza di geni knockout KEGG in diversi tipi di campioni. Sono stati identificati 3648 geni knockout unici, di cui 196 significativamente più abbondanti nei campioni di controllo e 106 nei campioni PPA (Figura 5). Sono stati rilevati 145 geni nei campioni di controllo e 61 geni nei campioni PPA, con abbondanze significativamente diverse. Le vie metaboliche correlate al metabolismo dei lipidi e degli aminoacidi erano significativamente più ricche nei campioni PPA (Tabella supplementare 3). Le vie metaboliche correlate al metabolismo dell'azoto e ai sistemi di ritrasmissione dello zolfo erano significativamente più ricche nei campioni di controllo (Tabella supplementare 3). L'abbondanza di geni correlati al metabolismo degli aminoacidi/nucleotidi (ko:K21279) e al metabolismo dell'inositolo fosfato (ko:K07291) era significativamente maggiore nei campioni PPA (Figura 5). I campioni di controllo presentavano un numero significativamente maggiore di geni correlati al metabolismo del benzoato (ko:K22270), al metabolismo dell'azoto (ko:K00368) e alla glicolisi/gluconeogenesi (ko:K00131) ( Figura 5 ).
Fig. 5. Abbondanza differenziale di KO nel microbioma intestinale di topi PPA e di controllo. Il grafico a vulcano mostra le differenze nell'abbondanza dei gruppi funzionali (KO). I punti grigi indicano i KO la cui abbondanza non era significativamente diversa tra i tipi di campione (valore p > 0,05). I punti colorati indicano differenze significative nell'abbondanza (valore p ≤ 0,05). I 20 KO con le maggiori differenze di abbondanza tra i tipi di campione sono mostrati in rosso e azzurro, corrispondenti rispettivamente ai campioni di controllo e PPA. I punti gialli e viola indicano i KO che erano almeno 2,7 volte più abbondanti nei campioni di controllo e PPA, rispettivamente. I punti neri indicano i KO con abbondanze significativamente diverse, con differenze medie di CLR comprese tra -1 e 1. I valori di p sono stati calcolati utilizzando il test U di Mann-Whitney e aggiustati per confronti multipli utilizzando la procedura di Benjamini-Hochberg. NaN indica che il KO non appartiene a un pathway in KEGG. I valori medi di differenza di CLR in grassetto indicano differenze significative nell'abbondanza. Per informazioni dettagliate sui percorsi a cui appartengono i KO elencati, vedere la Tabella supplementare 3.
Tra i geni annotati, 1601 geni presentavano abbondanze significativamente diverse tra i tipi di campione (p ≤ 0,05), con ciascun gene almeno 2,7 volte più abbondante. Di questi geni, 4 geni erano più abbondanti nei campioni di controllo e 1597 geni erano più abbondanti nei campioni di PPA. Poiché il PPA ha proprietà antimicrobiche, abbiamo esaminato l'abbondanza dei geni coinvolti nel metabolismo e nella produzione di PPA tra i tipi di campione. Tra i 1332 geni correlati al metabolismo di PPA, 27 geni erano significativamente più abbondanti nei campioni di controllo e 12 geni erano più abbondanti nei campioni di PPA. Tra i 223 geni correlati alla produzione di PPA, 1 gene era significativamente più abbondante nei campioni di PPA. La Figura 6A dimostra ulteriormente la maggiore abbondanza di geni coinvolti nel metabolismo di PPA, con un'abbondanza significativamente maggiore nei campioni di controllo e ampie dimensioni dell'effetto, mentre la Figura 6B evidenzia i singoli geni con un'abbondanza significativamente maggiore osservata nei campioni di PPA.
Fig. 6. Abbondanza differenziale di geni correlati a PPA nel microbioma intestinale del topo. I grafici a vulcano mostrano le differenze nell'abbondanza di geni associati al metabolismo di PPA (A) e alla produzione di PPA (B). I punti grigi indicano geni la cui abbondanza non era significativamente diversa tra i tipi di campione (valore p > 0,05). I punti colorati indicano differenze significative nell'abbondanza (valore p ≤ 0,05). I 20 geni con le maggiori differenze di abbondanza sono mostrati in rosso e azzurro (campioni di controllo e PPA), rispettivamente. L'abbondanza di punti gialli e viola era almeno 2,7 volte maggiore nei campioni di controllo e PPA rispetto ai campioni di controllo. I punti neri rappresentano geni con abbondanze significativamente diverse, con differenze medie di CLR comprese tra -1 e 1. I valori p sono stati calcolati utilizzando il test U di Mann-Whitney e corretti per confronti multipli utilizzando la procedura di Benjamini-Hochberg. I geni corrispondono a geni rappresentativi nel catalogo genico non ridondante. I nomi dei geni sono costituiti dal simbolo KEGG che indica un gene KO. Le differenze medie CLR in grassetto indicano abbondanze significativamente diverse. Un trattino (-) indica che non esiste alcun simbolo per il gene nel database KEGG.
I taxa con geni correlati al metabolismo e/o alla produzione di PPA sono stati identificati confrontando l'identità tassonomica dei contig con l'ID contig del gene. A livello di genere, 130 generi hanno geni correlati al metabolismo di PPA e 61 generi hanno geni correlati alla produzione di PPA (Tabella supplementare 4). Tuttavia, nessun genere ha mostrato differenze significative in termini di abbondanza (p > 0,05).
A livello di specie, 144 specie batteriche hanno geni associati al metabolismo del PPA e 68 specie batteriche hanno geni associati alla produzione di PPA (Tabella supplementare 5). Tra i metabolizzatori del PPA, otto batteri hanno mostrato aumenti significativi di abbondanza tra i tipi di campione e tutti hanno mostrato cambiamenti significativi nell'effetto (Tabella supplementare 6). Tutti i metabolizzatori del PPA identificati con differenze significative di abbondanza erano più abbondanti nei campioni di PPA. La classificazione a livello di specie ha rivelato rappresentanti di generi che non differivano significativamente tra i tipi di campione, tra cui diverse specie di Bacteroides e Ruminococcus, nonché Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus e Alcaligenes polymorpha. Tra i batteri produttori di PPA, quattro batteri hanno mostrato differenze significative di abbondanza tra i tipi di campione. Le specie con differenze significative di abbondanza includevano Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis e Ruminococcus bovis.
In questo studio, abbiamo esaminato gli effetti dell'esposizione al PPA sul microbiota intestinale dei topi. Il PPA può suscitare risposte diverse nei batteri perché è prodotto da alcune specie, utilizzato come fonte di cibo da altre specie o ha effetti antimicrobici. Pertanto, la sua aggiunta all'ambiente intestinale tramite integrazione alimentare può avere effetti diversi a seconda della tolleranza, della suscettibilità e della capacità di utilizzarlo come fonte di nutrienti. Le specie batteriche sensibili possono essere eliminate e sostituite da quelle più resistenti al PPA o in grado di utilizzarlo come fonte di cibo, con conseguenti cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale. I nostri risultati hanno rivelato differenze significative nella composizione microbica, ma nessun effetto sulla diversità microbica complessiva. Gli effetti più significativi sono stati osservati a livello di specie, con oltre 70 taxa significativamente diversi in abbondanza tra i campioni di PPA e quelli di controllo (Tabella supplementare 2). Un'ulteriore valutazione della composizione dei campioni esposti a PPA ha rivelato una maggiore eterogeneità delle specie microbiche rispetto ai campioni non esposti, suggerendo che il PPA possa migliorare le caratteristiche di crescita batterica e limitare le popolazioni batteriche che possono sopravvivere in ambienti ricchi di PPA. Pertanto, il PPA potrebbe indurre selettivamente cambiamenti, piuttosto che causare un'alterazione diffusa, della diversità del microbiota intestinale.
È stato precedentemente dimostrato che conservanti alimentari come il PPA alterano l'abbondanza dei componenti del microbioma intestinale senza comprometterne la diversità complessiva (Nagpal et al., 2021). In questo studio, abbiamo osservato le differenze più evidenti tra le specie di Bacteroidetes all'interno del phylum Bacteroidetes (precedentemente noto come Bacteroidetes), che risultavano significativamente più ricche nei topi esposti al PPA. Una maggiore abbondanza di specie di Bacteroides è associata a una maggiore degradazione del muco, che può aumentare il rischio di infezione e promuovere l'infiammazione (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Uno studio ha rilevato che topi maschi neonati trattati con Bacteroides fragilis mostravano comportamenti sociali che ricordavano il disturbo dello spettro autistico (ASD) (Carmel et al., 2023), e altri studi hanno dimostrato che le specie di Bacteroides possono alterare l'attività immunitaria e portare a cardiomiopatia infiammatoria autoimmune (Gil-Cruz et al., 2019). Anche le specie appartenenti ai generi Ruminococcus, Prevotella e Parabacteroides sono risultate significativamente aumentate nei topi esposti a PPA (Coretti et al., 2018). Alcune specie di Ruminococcus sono associate a malattie come il morbo di Crohn attraverso la produzione di citochine proinfiammatorie (Henke et al., 2019), mentre specie di Prevotella come Prevotella humani sono associate a malattie metaboliche come ipertensione e sensibilità all'insulina (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Infine, abbiamo scoperto che il rapporto tra Bacteroidetes (precedentemente noto come Firmicutes) e Bacteroidetes era significativamente inferiore nei topi esposti a PPA rispetto ai topi di controllo, a causa di una maggiore abbondanza totale di specie di Bacteroidetes. È stato precedentemente dimostrato che questo rapporto è un importante indicatore dell'omeostasi intestinale e alterazioni di questo rapporto sono state associate a vari stati patologici (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), tra cui le malattie infiammatorie intestinali (Stojanov et al., 2020). Nel complesso, le specie del phylum Bacteroidetes sembrano essere maggiormente influenzate da un elevato apporto dietetico di PPA. Ciò potrebbe essere dovuto a una maggiore tolleranza al PPA o alla capacità di utilizzare il PPA come fonte di energia, cosa che si è dimostrata vera per almeno una specie, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). In alternativa, l'esposizione materna al PPA potrebbe migliorare lo sviluppo fetale rendendo l'intestino della prole di topi più suscettibile alla colonizzazione da parte di Bacteroidetes; tuttavia, il nostro studio non ha consentito tale valutazione.
La valutazione del contenuto metagenomico ha rivelato differenze significative nell'abbondanza di geni associati al metabolismo e alla produzione di PPA: i topi esposti a PPA mostravano una maggiore abbondanza di geni responsabili della produzione di PPA, mentre i topi non esposti a PPA mostravano una maggiore abbondanza di geni responsabili del metabolismo di PAA (Figura 6). Questi risultati suggeriscono che l'effetto del PPA sulla composizione microbica potrebbe non essere dovuto esclusivamente al suo utilizzo, altrimenti l'abbondanza di geni associati al metabolismo del PPA avrebbe dovuto essere maggiore nel microbioma intestinale dei topi esposti a PPA. Una spiegazione è che il PPA media l'abbondanza batterica principalmente attraverso i suoi effetti antimicrobici piuttosto che attraverso il suo utilizzo da parte dei batteri come nutriente. Studi precedenti hanno dimostrato che il PPA inibisce la crescita di Salmonella Typhimurium in modo dose-dipendente (Jacobson et al., 2018). L'esposizione a concentrazioni più elevate di PPA può selezionare batteri resistenti alle sue proprietà antimicrobiche e che potrebbero non essere necessariamente in grado di metabolizzarlo o produrlo. Ad esempio, diverse specie di Parabacteroides hanno mostrato un'abbondanza significativamente maggiore nei campioni di PPA, ma non sono stati rilevati geni correlati al metabolismo o alla produzione di PPA (Tabelle Supplementari 2, 4 e 5). Inoltre, la produzione di PPA come sottoprodotto della fermentazione è ampiamente distribuita tra vari batteri (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Una maggiore diversità batterica potrebbe essere la ragione della maggiore abbondanza di geni correlati al metabolismo di PPA nei campioni di controllo (Averina et al., 2020). Inoltre, si prevedeva che solo 27 (2,14%) dei 1332 geni fossero geni associati esclusivamente al metabolismo di PPA. Molti geni associati al metabolismo di PPA sono coinvolti anche in altre vie metaboliche. Ciò dimostra ulteriormente che l'abbondanza di geni coinvolti nel metabolismo di PPA era maggiore nei campioni di controllo; questi geni potrebbero funzionare in vie che non comportano l'utilizzo o la formazione di PPA come sottoprodotto. In questo caso, solo un gene associato alla generazione di PPA ha mostrato differenze significative di abbondanza tra i tipi di campione. A differenza dei geni associati al metabolismo del PPA, i geni marcatori per la produzione di PPA sono stati selezionati perché direttamente coinvolti nel percorso batterico per la produzione di PPA. Nei topi esposti a PPA, tutte le specie hanno mostrato un'abbondanza e una capacità di produzione di PPA significativamente aumentate. Ciò supporta la previsione che i PPA selezionerebbero i produttori di PPA e quindi predirebbero un aumento della capacità di produzione di PPA. Tuttavia, l'abbondanza genica non è necessariamente correlata all'espressione genica; pertanto, sebbene l'abbondanza di geni associati al metabolismo del PPA sia maggiore nei campioni di controllo, il tasso di espressione potrebbe essere diverso (Shi et al., 2014). Per confermare la relazione tra la prevalenza dei geni produttori di PPA e la produzione di PPA, sono necessari studi sull'espressione dei geni coinvolti nella produzione di PPA.
L'annotazione funzionale dei metagenomi PPA e di controllo ha rivelato alcune differenze. L'analisi PCA del contenuto genico ha rivelato cluster discreti tra i campioni PPA e di controllo (Figura 5). Il clustering all'interno del campione ha rivelato che il contenuto genico di controllo era più diversificato, mentre i campioni PPA si raggruppavano insieme. Il clustering per contenuto genico era paragonabile al clustering per composizione in specie. Pertanto, le differenze nell'abbondanza dei pathway sono coerenti con i cambiamenti nell'abbondanza di specie e ceppi specifici al loro interno. Nei campioni PPA, due pathway con abbondanza significativamente maggiore erano correlati al metabolismo degli amminoacidi/nucleotidi (ko:K21279) e a molteplici pathway del metabolismo lipidico (ko:K00647, ko:K03801; Tabella supplementare 3). È noto che i geni associati a ko:K21279 sono associati al genere Bacteroides, uno dei generi con un numero significativamente maggiore di specie nei campioni PPA. Questo enzima può eludere la risposta immunitaria esprimendo polisaccaridi capsulari (Wang et al., 2008). Ciò potrebbe spiegare l'aumento di Bacteroidetes osservato nei topi esposti a PPA. Ciò integra l'aumento della sintesi di acidi grassi osservato nel microbioma PPA. I batteri utilizzano la via FASIIko:K00647 (fabB) per produrre acidi grassi, che possono influenzare le vie metaboliche dell'ospite (Yao e Rock, 2015; Johnson et al., 2020), e i cambiamenti nel metabolismo lipidico possono svolgere un ruolo nel neurosviluppo (Yu et al., 2020). Un'altra via che mostra una maggiore abbondanza nei campioni di PPA è la biosintesi degli ormoni steroidei (ko:K12343). Vi sono crescenti prove che esista una relazione inversa tra la capacità del microbiota intestinale di influenzare i livelli ormonali e di essere influenzato dagli ormoni, tanto che livelli elevati di steroidi possono avere conseguenze a valle sulla salute (Tetel et al., 2018).
Questo studio non è privo di limitazioni e considerazioni. Una distinzione importante è che non abbiamo eseguito valutazioni fisiologiche degli animali. Pertanto, non è possibile concludere direttamente se i cambiamenti nel microbioma siano associati a qualche malattia. Un'altra considerazione è che i topi in questo studio sono stati alimentati con la stessa dieta delle loro madri. Studi futuri potrebbero determinare se il passaggio da una dieta ricca di PPA a una dieta priva di PPA ne migliori gli effetti sul microbioma. Una limitazione del nostro studio, come di molti altri, è la dimensione limitata del campione. Sebbene si possano trarre conclusioni valide, una dimensione del campione più ampia fornirebbe una maggiore potenza statistica nell'analisi dei risultati. Siamo inoltre cauti nel trarre conclusioni su un'associazione tra cambiamenti nel microbioma intestinale e qualsiasi malattia (Yap et al., 2021). Fattori confondenti come età, sesso e dieta possono influenzare significativamente la composizione dei microrganismi. Questi fattori potrebbero spiegare le incongruenze osservate in letteratura riguardo all'associazione del microbioma intestinale con malattie complesse (Johnson et al., 2019; Lagod e Naser, 2023). Ad esempio, è stato dimostrato che i membri del genere Bacteroidetes sono aumentati o diminuiti negli animali e negli esseri umani con DSA (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Analogamente, studi sulla composizione intestinale in pazienti con malattie infiammatorie intestinali hanno riscontrato sia aumenti che diminuzioni negli stessi taxa (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Per limitare l'impatto del pregiudizio di genere, abbiamo cercato di garantire un'equa rappresentanza dei sessi, in modo che le differenze fossero molto probabilmente determinate dalla dieta. Una sfida dell'annotazione funzionale è la rimozione delle sequenze geniche ridondanti. Il nostro metodo di clustering genico richiede il 95% di identità di sequenza e l'85% di similarità di lunghezza, nonché una copertura di allineamento del 90% per eliminare falsi cluster. Tuttavia, in alcuni casi, abbiamo osservato COG con le stesse annotazioni (ad esempio, MUT) (Fig. 6). Sono necessari ulteriori studi per determinare se questi ortologhi siano distinti, associati a generi specifici o se ciò rappresenti una limitazione dell'approccio di clustering genico. Un'altra limitazione dell'annotazione funzionale è la potenziale classificazione errata; il gene batterico mmdA è un enzima noto coinvolto nella sintesi del propionato, ma KEGG non lo associa alla via metabolica del propionato. Al contrario, gli ortologhi scpB e mmcD sono correlati. L'elevato numero di geni senza knockout designati potrebbe comportare l'impossibilità di identificare i geni correlati a PPA nella valutazione dell'abbondanza genica. Studi futuri trarranno beneficio dall'analisi del metatrascrittoma, che può fornire una comprensione più approfondita delle caratteristiche funzionali del microbiota intestinale e collegare l'espressione genica a potenziali effetti a valle. Per studi che coinvolgono specifici disturbi dello sviluppo neurologico o malattie infiammatorie intestinali, sono necessarie valutazioni fisiologiche e comportamentali degli animali per collegare i cambiamenti nella composizione del microbioma a questi disturbi. Ulteriori studi sul trapianto del microbioma intestinale in topi germ-free sarebbero utili anche per determinare se il microbioma sia un fattore scatenante o una caratteristica della malattia.
In sintesi, abbiamo dimostrato che il PPA alimentare agisce come un fattore di alterazione della composizione del microbiota intestinale. Il PPA è un conservante approvato dalla FDA, ampiamente presente in vari alimenti, che, in caso di esposizione prolungata, può portare a un'alterazione della normale flora intestinale. Abbiamo riscontrato alterazioni nell'abbondanza di diversi batteri, suggerendo che il PPA può influenzare la composizione del microbiota intestinale. Le alterazioni del microbiota possono portare a variazioni nei livelli di alcune vie metaboliche, che a loro volta possono indurre cambiamenti fisiologici rilevanti per la salute dell'ospite. Sono necessari ulteriori studi per determinare se gli effetti del PPA alimentare sulla composizione microbica possano portare a disbiosi o altre patologie. Questo studio getta le basi per studi futuri su come gli effetti del PPA sulla composizione intestinale possano influire sulla salute umana.
I set di dati presentati in questo studio sono disponibili in repository online. Il nome del repository e il numero di accesso sono: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Questo studio sugli animali è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università della Florida Centrale (UCF-IACUC) (Numero di Permesso per l'Uso degli Animali: PROTO202000002). Questo studio è conforme alle leggi, ai regolamenti e ai requisiti istituzionali locali.
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Data di pubblicazione: 18-04-2025