L'acido propionico (PPA), un agente antifungino e comune additivo alimentare, ha dimostrato di causare uno sviluppo neurologico anomalo nei topi, accompagnato da disfunzioni gastrointestinali, che potrebbero essere dovute a disbiosi intestinale. È stato ipotizzato un legame tra l'esposizione alimentare al PPA e la disbiosi del microbiota intestinale, ma non è stato ancora studiato direttamente. In questo studio, abbiamo analizzato le modifiche nella composizione del microbiota intestinale associate al PPA che potrebbero portare alla disbiosi. I microbiomi intestinali di topi alimentati con una dieta non trattata (n=9) e con una dieta arricchita con PPA (n=13) sono stati sequenziati mediante sequenziamento metagenomico a lungo raggio per valutare le differenze nella composizione microbica e nelle vie metaboliche batteriche. Il PPA assunto con la dieta è risultato associato a un aumento dell'abbondanza di taxa significativi, tra cui diverse specie di Bacteroides, Prevotella e Ruminococcus, membri dei quali sono stati precedentemente implicati nella produzione di PPA. I microbiomi dei topi esposti al PPA presentavano anche un maggior numero di vie metaboliche correlate al metabolismo lipidico e alla biosintesi degli ormoni steroidei. I nostri risultati indicano che il PPA può alterare il microbiota intestinale e le relative vie metaboliche. Queste modifiche osservate evidenziano come i conservanti classificati come sicuri per il consumo possano influenzare la composizione del microbiota intestinale e, di conseguenza, la salute umana. Tra questi, P, G o S viene selezionato a seconda del livello di classificazione analizzato. Per minimizzare l'impatto delle classificazioni falsi positivi, è stata adottata una soglia minima di abbondanza relativa di 1e-4 (1/10.000 letture). Prima dell'analisi statistica, le abbondanze relative riportate da Bracken (fraction_total_reads) sono state trasformate utilizzando la trasformazione log-ratio centrata (CLR) (Aitchison, 1982). Il metodo CLR è stato scelto per la trasformazione dei dati perché è invariante di scala e sufficiente per dataset non sparsi (Gloor et al., 2017). La trasformazione CLR utilizza il logaritmo naturale. I dati di conteggio riportati da Bracken sono stati normalizzati utilizzando l'espressione logaritmica relativa (RLE) (Anders e Huber, 2010). Le figure sono state generate utilizzando una combinazione di matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 e logaritmi sequenziali (Gloor et al., 2017). 0.12.2 e stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Il rapporto Bacillus/Bacteroidetes è stato calcolato per ciascun campione utilizzando conteggi batterici normalizzati. I valori riportati nelle tabelle sono arrotondati a 4 cifre decimali. L'indice di diversità di Simpson è stato calcolato utilizzando lo script alpha_diversity.py fornito nel pacchetto KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Il report di Bracken è fornito nello script e l'indice di Simpson "Si" è fornito per il parametro -an. Differenze significative nell'abbondanza sono state definite come differenze medie CLR ≥ 1 o ≤ -1. Una differenza media CLR di ±1 indica un aumento di 2,7 volte nell'abbondanza di un tipo di campione. Il segno (+/-) indica se il taxon è più abbondante nel campione PPA e nel campione di controllo, rispettivamente. La significatività è stata determinata utilizzando il test U di Mann-Whitney (Virtanen et al., 2020). È stato utilizzato Statsmodels v. 0.14 (Benjamini e Hochberg, 1995; Seabold e Perktold, 2010) e la procedura di Benjamini-Hochberg è stata applicata per correggere i test multipli. Un valore p corretto ≤ 0,05 è stato utilizzato come soglia per determinare la significatività statistica.
Il microbioma umano è spesso definito "l'ultimo organo del corpo" e svolge un ruolo vitale per la salute umana (Baquero e Nombela, 2012). In particolare, il microbioma intestinale è riconosciuto per la sua influenza a livello sistemico e per il suo ruolo in molte funzioni essenziali. I batteri commensali sono abbondanti nell'intestino, occupano molteplici nicchie ecologiche, utilizzano i nutrienti e competono con potenziali agenti patogeni (Jandhyala et al., 2015). Diverse componenti batteriche del microbiota intestinale sono in grado di produrre nutrienti essenziali come le vitamine e di promuovere la digestione (Rowland et al., 2018). È stato inoltre dimostrato che i metaboliti batterici influenzano lo sviluppo dei tessuti e potenziano i processi metabolici e immunitari (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). La composizione del microbioma intestinale umano è estremamente diversificata e dipende da fattori genetici e ambientali come la dieta, il sesso, i farmaci e lo stato di salute (Kumbhare et al., 2019).
La dieta materna è una componente fondamentale dello sviluppo fetale e neonatale e una potenziale fonte di composti che possono influenzarlo (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Uno di questi composti di interesse è l'acido propionico (PPA), un acido grasso a catena corta, sottoprodotto della fermentazione batterica e additivo alimentare (den Besten et al., 2013). Il PPA possiede proprietà antibatteriche e antifungine ed è quindi utilizzato come conservante alimentare e in applicazioni industriali per inibire la crescita di muffe e batteri (Wemmenhove et al., 2016). Il PPA ha effetti diversi nei diversi tessuti. Nel fegato, il PPA ha effetti antinfiammatori influenzando l'espressione delle citochine nei macrofagi (Kawasoe et al., 2022). Questo effetto regolatore è stato osservato anche in altre cellule immunitarie, portando a una riduzione dell'infiammazione (Haase et al., 2021). Tuttavia, nel cervello è stato osservato l'effetto opposto. Precedenti studi hanno dimostrato che l'esposizione al PPA induce comportamenti simili all'autismo nei topi (El-Ansary et al., 2012). Altri studi hanno dimostrato che il PPA può indurre gliosi e attivare vie pro-infiammatorie nel cervello (Abdelli et al., 2019). Poiché il PPA è un acido debole, può diffondersi attraverso l'epitelio intestinale nel flusso sanguigno e quindi attraversare barriere restrittive come la barriera emato-encefalica e la placenta (Stinson et al., 2019), evidenziando l'importanza del PPA come metabolita regolatore prodotto dai batteri. Sebbene il potenziale ruolo del PPA come fattore di rischio per l'autismo sia attualmente oggetto di indagine, i suoi effetti sugli individui con autismo potrebbero estendersi oltre l'induzione della differenziazione neuronale.
Sintomi gastrointestinali come diarrea e stitichezza sono comuni nei pazienti con disturbi dello sviluppo neurologico (Cao et al., 2021). Studi precedenti hanno dimostrato che il microbioma dei pazienti con disturbi dello spettro autistico (ASD) differisce da quello degli individui sani, suggerendo la presenza di disbiosi del microbiota intestinale (Finegold et al., 2010). Allo stesso modo, le caratteristiche del microbioma dei pazienti con malattie infiammatorie intestinali, obesità, malattia di Alzheimer, ecc. differiscono anche da quelle degli individui sani (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Tuttavia, ad oggi, non è stata stabilita alcuna relazione causale tra il microbioma intestinale e le malattie o i sintomi neurologici (Yap et al., 2021), sebbene si ritenga che diverse specie batteriche svolgano un ruolo in alcune di queste patologie. Ad esempio, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio e altri generi sono più abbondanti nel microbiota dei pazienti con autismo (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). In particolare, è noto che alcune specie appartenenti a questi generi possiedono geni associati alla produzione di PPA (Reichardt et al., 2014; Yun e Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur e Dürre, 2023). Date le proprietà antimicrobiche del PPA, aumentarne l'abbondanza potrebbe essere vantaggioso per la crescita dei batteri produttori di PPA (Jacobson et al., 2018). Pertanto, un ambiente ricco di PFA può portare a cambiamenti nel microbiota intestinale, compresi i patogeni gastrointestinali, che potrebbero essere potenziali fattori scatenanti di sintomi gastrointestinali.
Una questione centrale nella ricerca sul microbioma è se le differenze nella composizione microbica siano una causa o un sintomo di patologie sottostanti. Il primo passo per chiarire la complessa relazione tra dieta, microbioma intestinale e malattie neurologiche consiste nel valutare gli effetti della dieta sulla composizione microbica. A tal fine, abbiamo utilizzato il sequenziamento metagenomico a lettura lunga per confrontare i microbiomi intestinali della prole di topi alimentati con una dieta ricca di PPA o con una dieta povera di PPA. La prole è stata alimentata con la stessa dieta delle madri. Abbiamo ipotizzato che una dieta ricca di PPA avrebbe determinato cambiamenti nella composizione microbica intestinale e nei percorsi funzionali microbici, in particolare quelli correlati al metabolismo e/o alla produzione di PPA.
Questo studio ha utilizzato topi transgenici FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) che sovraesprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore GFAP specifico per le cellule gliali, seguendo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida Centrale (UCF-IACUC) (Numero di autorizzazione all'uso degli animali: PROTO202000002). Dopo lo svezzamento, i topi sono stati alloggiati singolarmente in gabbie con 1-5 topi di ciascun sesso per gabbia. I topi sono stati alimentati ad libitum con una dieta di controllo purificata (dieta standard modificata in aperto, 16 kcal% di grassi) o una dieta integrata con propionato di sodio (dieta standard modificata in aperto, 16 kcal% di grassi, contenente 5.000 ppm di propionato di sodio). La quantità di propionato di sodio utilizzata era equivalente a 5.000 mg PFA/kg di peso totale del cibo. Questa è la più alta concentrazione di PPA approvata per l'uso come conservante alimentare. Per prepararsi a questo studio, i topi genitori sono stati alimentati con entrambe le diete per 4 settimane prima dell'accoppiamento e per tutta la durata della gravidanza della madre. I topi della prole [22 topi, 9 controlli (6 maschi, 3 femmine) e 13 PPA (4 maschi, 9 femmine)] sono stati svezzati e poi hanno continuato con la stessa dieta delle madri per 5 mesi. I topi della prole sono stati sacrificati a 5 mesi di età e il loro contenuto fecale intestinale è stato raccolto e inizialmente conservato in provette da microcentrifuga da 1,5 ml a -20 °C e poi trasferito in un congelatore a -80 °C fino all'esaurimento del DNA dell'ospite e all'estrazione degli acidi nucleici microbici.
Il DNA dell'ospite è stato rimosso secondo un protocollo modificato (Charalampous et al., 2019). In breve, il contenuto fecale è stato trasferito in 500 µl di InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) e conservato congelato. Elaborare un massimo di 1-2 pellet fecali per estrazione. Il contenuto fecale è stato quindi omogeneizzato meccanicamente utilizzando un pestello di plastica all'interno della provetta per formare una sospensione. Centrifugare i campioni a 10.000 RCF per 5 minuti o fino a quando i campioni non si sono sedimentati, quindi aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 250 µl di PBS 1×. Aggiungere 250 µl di soluzione di saponina al 4,4% (TCI, numero di prodotto S0019) al campione come detergente per allentare le membrane cellulari eucariotiche. I campioni sono stati mescolati delicatamente fino a ottenere un composto omogeneo e incubati a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, per rompere le cellule eucariotiche, sono stati aggiunti 350 μl di acqua priva di nucleasi al campione, incubato per 30 s, e poi sono stati aggiunti 12 μl di NaCl 5 M. I campioni sono stati quindi centrifugati a 6000 RCF per 5 min. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 100 μl di PBS 1X. Per rimuovere il DNA dell'ospite, aggiungere 100 μl di tampone HL-SAN (12,8568 g di NaCl, 4 ml di MgCl2 1 M, 36 ml di acqua priva di nucleasi) e 10 μl di enzima HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). I campioni sono stati miscelati accuratamente mediante pipettaggio e incubati a 37 °C per 30 minuti a 800 rpm su un Eppendorf™ ThermoMixer C. Dopo l'incubazione, sono stati centrifugati a 6000 RCF per 3 minuti e lavati due volte con 800 µl e 1000 µl di PBS 1X. Infine, il pellet è stato risospeso in 100 µl di PBS 1X.
Il DNA batterico totale è stato isolato utilizzando il kit di purificazione del DNA genomico Monarch di New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). La procedura operativa standard fornita con il kit è stata leggermente modificata. Incubare e mantenere acqua priva di nucleasi a 60 °C prima dell'operazione per l'eluizione finale. Aggiungere 10 µl di Proteinasi K e 3 µl di RNasi A a ciascun campione. Quindi aggiungere 100 µl di tampone di lisi cellulare e mescolare delicatamente. I campioni sono stati quindi incubati in un Eppendorf™ ThermoMixer C a 56 °C e 1400 rpm per almeno 1 ora e fino a 3 ore. I campioni incubati sono stati centrifugati a 12.000 RCF per 3 minuti e il surnatante di ciascun campione è stato trasferito in una provetta da microcentrifuga separata da 1,5 mL contenente 400 µL di soluzione legante. Le provette sono state quindi agitate con un vortex a impulsi per 5-10 secondi a intervalli di 1 secondo. Trasferire l'intero contenuto liquido di ciascun campione (circa 600-700 µL) in una cartuccia filtrante posta in una provetta di raccolta a flusso continuo. Le provette sono state centrifugate a 1.000 RCF per 3 minuti per consentire il legame iniziale del DNA e quindi centrifugate a 12.000 RCF per 1 minuto per rimuovere il liquido residuo. La colonna del campione è stata trasferita in una nuova provetta di raccolta e quindi lavata due volte. Per il primo lavaggio, aggiungere 500 µL di tampone di lavaggio a ciascuna provetta. Capovolgere la provetta 3-5 volte e quindi centrifugare a 12.000 RCF per 1 minuto. Eliminare il liquido dalla provetta di raccolta e riposizionare la cartuccia filtrante nella stessa provetta di raccolta. Per il secondo lavaggio, aggiungere 500 µL di tampone di lavaggio al filtro senza capovolgere. I campioni sono stati centrifugati a 12.000 RCF per 1 minuto. Trasferire il filtro in una provetta LoBind® da 1,5 mL e aggiungere 100 µL di acqua priva di nucleasi preriscaldata. I filtri sono stati incubati a temperatura ambiente per 1 minuto e quindi centrifugati a 12.000 RCF per 1 minuto. Il DNA eluito è stato conservato a -80 °C.
La concentrazione del DNA è stata quantificata utilizzando un fluorimetro Qubit™ 4.0. Il DNA è stato preparato utilizzando il kit Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity (Cod. Cat. Q33231) secondo le istruzioni del produttore. La distribuzione della lunghezza dei frammenti di DNA è stata misurata utilizzando un TapeStation Agilent™ 4150 o 4200. Il DNA è stato preparato utilizzando i reagenti Agilent™ Genomic DNA Reagents (Cod. Cat. 5067-5366) e Genomic DNA ScreenTape (Cod. Cat. 5067-5365). La preparazione della libreria è stata eseguita utilizzando il kit Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) secondo le istruzioni del produttore. Il DNA è stato sequenziato utilizzando un sequenziatore ONT GridION™ Mk1 con una flow cell Min106D (R 9.4.1). Le impostazioni di sequenziamento erano: chiamata di base ad alta precisione, valore q minimo di 9, impostazione del codice a barre e ritaglio del codice a barre. I campioni sono stati sequenziati per 72 ore, dopodiché i dati di chiamata di base sono stati inviati per ulteriore elaborazione e analisi.
L'elaborazione bioinformatica è stata eseguita utilizzando metodi precedentemente descritti (Greenman et al., 2024). I file FASTQ ottenuti dal sequenziamento sono stati suddivisi in directory per ciascun campione. Prima dell'analisi bioinformatica, i dati sono stati elaborati utilizzando la seguente pipeline: in primo luogo, i file FASTQ dei campioni sono stati uniti in un singolo file FASTQ. Quindi, le letture più corte di 1000 bp sono state filtrate utilizzando Filtlong v. 0.2.1, con l'unico parametro modificato –min_length 1000 (Wick, 2024). Prima di un ulteriore filtraggio, la qualità delle letture è stata controllata utilizzando NanoPlot v. 1.41.3 con i seguenti parametri: –fastq –plots dot –N50 -o
Per la classificazione tassonomica, le letture e i contig assemblati sono stati classificati utilizzando Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Genera report e file di output rispettivamente per le letture e gli assemblaggi. Utilizza l'opzione –use-names per analizzare letture e assemblaggi. Le opzioni –gzip-compressed e –paired sono specificate per i segmenti di lettura. L'abbondanza relativa dei taxa nei metagenomi è stata stimata utilizzando Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Abbiamo prima creato un database k-mer contenente 1000 basi utilizzando bracken-build con i seguenti parametri: -d
L'annotazione genica e la stima dell'abbondanza relativa sono state eseguite utilizzando una versione modificata del protocollo descritto da Maranga et al. (Maranga et al., 2023). In primo luogo, i contig più corti di 500 bp sono stati rimossi da tutti gli assemblaggi utilizzando SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Gli assemblaggi selezionati sono stati quindi combinati in un pan-metagenoma. I frame di lettura aperti (ORF) sono stati identificati utilizzando Prodigal v. 1.0.1 (una versione parallela di Prodigal v. 2.6.3) con i seguenti parametri: -d
I geni sono stati inizialmente raggruppati in base agli identificatori di ortologhi (KO) della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) assegnati da eggNOG per confrontare l'abbondanza dei percorsi genici. I geni senza knockout o con knockout multipli sono stati rimossi prima dell'analisi. È stata quindi calcolata l'abbondanza media di ciascun KO per campione ed è stata eseguita l'analisi statistica. I geni del metabolismo del PPA sono stati definiti come qualsiasi gene a cui è stata assegnata la riga ko00640 nella colonna KEGG_Pathway, indicando un ruolo nel metabolismo del propionato secondo KEGG. I geni identificati come associati alla produzione di PPA sono elencati nella Tabella supplementare 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Sono stati eseguiti test di permutazione per identificare i geni del metabolismo e della produzione di PPA che erano significativamente più abbondanti in ciascun tipo di campione. Sono state eseguite mille permutazioni per ciascun gene analizzato. Un valore p di 0,05 è stato utilizzato come soglia per determinare la significatività statistica. Le annotazioni funzionali sono state assegnate ai singoli geni all'interno di un cluster sulla base delle annotazioni dei geni rappresentativi all'interno del cluster stesso. I taxa associati al metabolismo e/o alla produzione di PPA sono stati identificati confrontando gli ID dei contig nei file di output di Kraken2 con gli stessi ID dei contig mantenuti durante l'annotazione funzionale tramite eggNOG. Il test di significatività è stato eseguito utilizzando il test U di Mann-Whitney descritto in precedenza. La correzione per test multipli è stata eseguita utilizzando la procedura di Benjamini-Hochberg. Un valore p ≤ 0,05 è stato utilizzato come soglia per determinare la significatività statistica.
La diversità del microbioma intestinale dei topi è stata valutata utilizzando l'indice di diversità di Simpson. Non sono state osservate differenze significative tra i campioni di controllo e quelli PPA in termini di diversità di genere e specie (valore p per il genere: 0,18, valore p per la specie: 0,16) (Figura 1). La composizione microbica è stata quindi confrontata utilizzando l'analisi delle componenti principali (PCA). La Figura 2 mostra il raggruppamento dei campioni in base ai loro phyla, indicando che vi erano differenze nella composizione delle specie dei microbiomi tra i campioni PPA e quelli di controllo. Questo raggruppamento era meno pronunciato a livello di genere, suggerendo che il PPA influisce su alcuni batteri (Figura supplementare 1).
Figura 1. Diversità alfa di generi e composizione di specie del microbioma intestinale del topo. Box plot che mostrano gli indici di diversità di Simpson di generi (A) e specie (B) in campioni PPA e di controllo. La significatività è stata determinata utilizzando il test U di Mann-Whitney e la correzione multipla è stata eseguita utilizzando la procedura di Benjamini-Hochberg. ns, il valore p non era significativo (p>0,05).
Figura 2. Risultati dell'analisi delle componenti principali della composizione del microbioma intestinale del topo a livello di specie. Il grafico dell'analisi delle componenti principali mostra la distribuzione dei campioni in base alle prime due componenti principali. I colori indicano il tipo di campione: i topi esposti a PPA sono viola e i topi di controllo sono gialli. Le componenti principali 1 e 2 sono rappresentate rispettivamente sull'asse x e sull'asse y e sono espresse come rapporto di varianza spiegata.
Utilizzando i dati di conteggio trasformati RLE, è stata osservata una diminuzione significativa del rapporto mediano Bacteroidetes/Bacilli nei topi di controllo e PPA (controllo: 9,66, PPA: 3,02; p-value = 0,0011). Questa differenza era dovuta a una maggiore abbondanza di Bacteroidetes nei topi PPA rispetto ai controlli, sebbene la differenza non fosse significativa (CLR medio di controllo: 5,51, CLR medio PPA: 6,62; p-value = 0,054), mentre l'abbondanza di Bacteroidetes era simile (CLR medio di controllo: 7,76, CLR medio PPA: 7,60; p-value = 0,18).
L'analisi dell'abbondanza dei membri tassonomici del microbioma intestinale ha rivelato che 1 phylum e 77 specie differivano significativamente tra i campioni PPA e i campioni di controllo (Tabella supplementare 2). L'abbondanza di 59 specie nei campioni PPA era significativamente più alta rispetto a quella nei campioni di controllo, mentre l'abbondanza di sole 16 specie nei campioni di controllo era più alta rispetto a quella nei campioni PPA (Figura 3).
Figura 3. Abbondanza differenziale dei taxa nel microbioma intestinale di topi PPA e di controllo. I grafici a vulcano mostrano le differenze nell'abbondanza di generi (A) o specie (B) tra campioni PPA e di controllo. I punti grigi indicano l'assenza di differenze significative nell'abbondanza dei taxa. I punti colorati indicano differenze significative nell'abbondanza (valore p ≤ 0,05). I 20 taxa con le maggiori differenze di abbondanza tra i tipi di campione sono mostrati in rosso e azzurro (campioni di controllo e PPA), rispettivamente. I punti gialli e viola erano almeno 2,7 volte più abbondanti nei campioni di controllo o PPA rispetto ai controlli. I punti neri rappresentano taxa con abbondanze significativamente diverse, con differenze medie CLR comprese tra -1 e 1. I valori p sono stati calcolati utilizzando il test U di Mann-Whitney e corretti per test multipli utilizzando la procedura di Benjamini-Hochberg. Le differenze medie CLR in grassetto indicano differenze significative nell'abbondanza.
Dopo aver analizzato la composizione microbica intestinale, abbiamo eseguito un'annotazione funzionale del microbioma. Dopo aver filtrato i geni di bassa qualità, sono stati identificati un totale di 378.355 geni unici in tutti i campioni. L'abbondanza trasformata di questi geni è stata utilizzata per l'analisi delle componenti principali (PCA) e i risultati hanno mostrato un alto grado di raggruppamento dei tipi di campioni in base ai loro profili funzionali (Figura 4).
Figura 4. Risultati dell'analisi delle componenti principali (PCA) utilizzando il profilo funzionale del microbioma intestinale del topo. Il grafico PCA mostra la distribuzione dei campioni in base alle prime due componenti principali. I colori indicano il tipo di campione: i topi esposti a PPA sono rappresentati in viola e i topi di controllo in giallo. Le componenti principali 1 e 2 sono riportate rispettivamente sull'asse x e sull'asse y e sono espresse come rapporto di varianza spiegata.
Abbiamo quindi esaminato l'abbondanza di knockout KEGG in diversi tipi di campioni. Sono stati identificati un totale di 3648 knockout unici, di cui 196 erano significativamente più abbondanti nei campioni di controllo e 106 erano più abbondanti nei campioni PPA (Figura 5). Un totale di 145 geni sono stati rilevati nei campioni di controllo e 61 geni nei campioni PPA, con abbondanze significativamente diverse. I percorsi correlati al metabolismo dei lipidi e degli amminozuccheri erano significativamente più arricchiti nei campioni PPA (Tabella supplementare 3). I percorsi correlati al metabolismo dell'azoto e ai sistemi di trasferimento dello zolfo erano significativamente più arricchiti nei campioni di controllo (Tabella supplementare 3). L'abbondanza di geni correlati al metabolismo degli amminozuccheri/nucleotidi (ko:K21279) e al metabolismo dell'inositolo fosfato (ko:K07291) era significativamente più alta nei campioni PPA (Figura 5). I campioni di controllo presentavano un numero significativamente maggiore di geni correlati al metabolismo del benzoato (ko:K22270), al metabolismo dell'azoto (ko:K00368) e alla glicolisi/gluconeogenesi (ko:K00131) (Figura 5).
Figura 5. Abbondanza differenziale di KO nel microbioma intestinale di topi PPA e di controllo. Il grafico a vulcano illustra le differenze nell'abbondanza dei gruppi funzionali (KO). I punti grigi indicano i KO la cui abbondanza non era significativamente diversa tra i tipi di campione (valore p > 0,05). I punti colorati indicano differenze significative nell'abbondanza (valore p ≤ 0,05). I 20 KO con le maggiori differenze di abbondanza tra i tipi di campione sono mostrati in rosso e azzurro, corrispondenti rispettivamente ai campioni di controllo e PPA. I punti gialli e viola indicano i KO che erano almeno 2,7 volte più abbondanti nei campioni di controllo e PPA, rispettivamente. I punti neri indicano i KO con abbondanze significativamente diverse, con differenze medie di CLR comprese tra -1 e 1. I valori p sono stati calcolati utilizzando il test U di Mann-Whitney e corretti per confronti multipli utilizzando la procedura di Benjamini-Hochberg. NaN indica che il KO non appartiene a un pathway in KEGG. I valori medi di differenza CLR in grassetto indicano differenze significative nell'abbondanza. Per informazioni dettagliate sui percorsi a cui appartengono i KO elencati, consultare la Tabella supplementare 3.
Tra i geni annotati, 1601 geni presentavano abbondanze significativamente diverse tra i tipi di campione (p ≤ 0,05), con ciascun gene almeno 2,7 volte più abbondante. Di questi geni, 4 geni erano più abbondanti nei campioni di controllo e 1597 geni erano più abbondanti nei campioni di PPA. Poiché il PPA ha proprietà antimicrobiche, abbiamo esaminato l'abbondanza dei geni coinvolti nel metabolismo e nella produzione del PPA tra i tipi di campione. Tra i 1332 geni correlati al metabolismo del PPA, 27 geni erano significativamente più abbondanti nei campioni di controllo e 12 geni erano più abbondanti nei campioni di PPA. Tra i 223 geni correlati alla produzione di PPA, 1 gene era significativamente più abbondante nei campioni di PPA. La Figura 6A dimostra ulteriormente la maggiore abbondanza di geni coinvolti nel metabolismo del PPA, con un'abbondanza significativamente maggiore nei campioni di controllo e grandi dimensioni dell'effetto, mentre la Figura 6B evidenzia i singoli geni con un'abbondanza significativamente maggiore osservata nei campioni di PPA.
Figura 6. Abbondanza differenziale dei geni correlati al PPA nel microbioma intestinale del topo. I grafici a vulcano mostrano le differenze nell'abbondanza dei geni associati al metabolismo del PPA (A) e alla produzione di PPA (B). I punti grigi indicano i geni la cui abbondanza non era significativamente diversa tra i tipi di campione (valore p > 0,05). I punti colorati indicano differenze significative nell'abbondanza (valore p ≤ 0,05). I 20 geni con le maggiori differenze di abbondanza sono mostrati in rosso e azzurro (campioni di controllo e PPA), rispettivamente. L'abbondanza dei punti gialli e viola era almeno 2,7 volte maggiore nei campioni di controllo e PPA rispetto ai campioni di controllo. I punti neri rappresentano geni con abbondanze significativamente diverse, con differenze CLR medie comprese tra -1 e 1. I valori p sono stati calcolati utilizzando il test U di Mann-Whitney e corretti per confronti multipli utilizzando la procedura di Benjamini-Hochberg. I geni corrispondono a geni rappresentativi nel catalogo genico non ridondante. I nomi dei geni sono costituiti dal simbolo KEGG che indica un gene KO. Le differenze medie CLR in grassetto indicano abbondanze significativamente diverse. Un trattino (-) indica che non esiste un simbolo per il gene nel database KEGG.
I taxa con geni correlati al metabolismo e/o alla produzione di PPA sono stati identificati confrontando l'identità tassonomica dei contig con l'ID del contig del gene. A livello di genere, sono stati trovati 130 generi con geni correlati al metabolismo di PPA e 61 generi con geni correlati alla produzione di PPA (Tabella supplementare 4). Tuttavia, nessun genere ha mostrato differenze significative nell'abbondanza (p > 0,05).
A livello di specie, sono state individuate 144 specie batteriche con geni associati al metabolismo del PPA e 68 specie batteriche con geni associati alla produzione di PPA (Tabella supplementare 5). Tra i metabolizzatori di PPA, otto batteri hanno mostrato aumenti significativi di abbondanza tra i tipi di campione e tutti hanno mostrato cambiamenti significativi nell'effetto (Tabella supplementare 6). Tutti i metabolizzatori di PPA identificati con differenze significative di abbondanza erano più abbondanti nei campioni di PPA. La classificazione a livello di specie ha rivelato rappresentanti di generi che non differivano significativamente tra i tipi di campione, tra cui diverse specie di Bacteroides e Ruminococcus, nonché Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus e Alcaligenes polymorpha. Tra i batteri produttori di PPA, quattro batteri hanno mostrato differenze significative di abbondanza tra i tipi di campione. Le specie con differenze significative di abbondanza includevano Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis e Ruminococcus bovis.
In questo studio, abbiamo esaminato gli effetti dell'esposizione al PPA sul microbiota intestinale dei topi. Il PPA può indurre risposte diverse nei batteri perché è prodotto da alcune specie, utilizzato come fonte di nutrimento da altre o ha effetti antimicrobici. Pertanto, la sua aggiunta all'ambiente intestinale tramite integrazione alimentare può avere effetti diversi a seconda della tolleranza, della suscettibilità e della capacità di utilizzarlo come fonte di nutrienti. Le specie batteriche sensibili possono essere eliminate e sostituite da quelle più resistenti al PPA o in grado di utilizzarlo come fonte di nutrimento, portando a cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale. I nostri risultati hanno rivelato differenze significative nella composizione microbica, ma nessun effetto sulla diversità microbica complessiva. Gli effetti maggiori sono stati osservati a livello di specie, con oltre 70 taxa significativamente diversi in abbondanza tra i campioni esposti al PPA e quelli di controllo (Tabella supplementare 2). Un'ulteriore valutazione della composizione dei campioni esposti al PPA ha rivelato una maggiore eterogeneità delle specie microbiche rispetto ai campioni non esposti, suggerendo che il PPA potrebbe migliorare le caratteristiche di crescita batterica e limitare le popolazioni batteriche in grado di sopravvivere in ambienti ricchi di PPA. Pertanto, il PPA potrebbe indurre selettivamente cambiamenti piuttosto che causare una diffusa alterazione della diversità del microbiota intestinale.
È stato precedentemente dimostrato che i conservanti alimentari come il PPA alterano l'abbondanza dei componenti del microbiota intestinale senza influenzarne la diversità complessiva (Nagpal et al., 2021). In questo studio, abbiamo osservato le differenze più evidenti tra le specie di Bacteroidetes all'interno del phylum Bacteroidetes (precedentemente noto come Bacteroidetes), che risultavano significativamente arricchite nei topi esposti al PPA. L'aumento dell'abbondanza di specie di Bacteroides è associato a una maggiore degradazione del muco, che può aumentare il rischio di infezione e promuovere l'infiammazione (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Uno studio ha rilevato che i topi maschi neonati trattati con Bacteroides fragilis mostravano comportamenti sociali che ricordavano il disturbo dello spettro autistico (ASD) (Carmel et al., 2023), e altri studi hanno dimostrato che le specie di Bacteroides possono alterare l'attività immunitaria e portare a cardiomiopatia infiammatoria autoimmune (Gil-Cruz et al., 2019). Anche le specie appartenenti ai generi Ruminococcus, Prevotella e Parabacteroides sono risultate significativamente aumentate nei topi esposti a PPA (Coretti et al., 2018). Alcune specie di Ruminococcus sono associate a malattie come il morbo di Crohn attraverso la produzione di citochine proinfiammatorie (Henke et al., 2019), mentre le specie di Prevotella, come Prevotella humani, sono associate a malattie metaboliche come l'ipertensione e l'insulino-resistenza (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Infine, abbiamo scoperto che il rapporto tra Bacteroidetes (precedentemente noti come Firmicutes) e Bacteroidetes era significativamente inferiore nei topi esposti a PPA rispetto ai topi di controllo, a causa di una maggiore abbondanza totale di specie di Bacteroidetes. È stato precedentemente dimostrato che questo rapporto è un importante indicatore dell'omeostasi intestinale e le alterazioni di questo rapporto sono state associate a diverse patologie (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), comprese le malattie infiammatorie croniche intestinali (Stojanov et al., 2020). Nel complesso, le specie del phylum Bacteroidetes sembrano essere maggiormente influenzate da un'elevata assunzione di PPA con la dieta. Ciò potrebbe essere dovuto a una maggiore tolleranza al PPA o alla capacità di utilizzare il PPA come fonte di energia, come dimostrato per almeno una specie, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). In alternativa, l'esposizione materna al PPA potrebbe favorire lo sviluppo fetale rendendo l'intestino della prole di topo più suscettibile alla colonizzazione da parte dei Bacteroidetes; tuttavia, il disegno del nostro studio non ha consentito tale valutazione.
La valutazione del contenuto metagenomico ha rivelato differenze significative nell'abbondanza di geni associati al metabolismo e alla produzione di PPA, con i topi esposti a PPA che mostravano una maggiore abbondanza di geni responsabili della produzione di PPA, mentre i topi non esposti a PPA mostravano una maggiore abbondanza di geni responsabili del metabolismo di PAA (Figura 6). Questi risultati suggeriscono che l'effetto del PPA sulla composizione microbica potrebbe non essere dovuto esclusivamente al suo utilizzo, altrimenti l'abbondanza di geni associati al metabolismo del PPA avrebbe dovuto mostrare una maggiore abbondanza nel microbioma intestinale dei topi esposti a PPA. Una possibile spiegazione è che il PPA influenzi l'abbondanza batterica principalmente attraverso i suoi effetti antimicrobici piuttosto che attraverso il suo utilizzo da parte dei batteri come nutriente. Studi precedenti hanno dimostrato che il PPA inibisce la crescita di Salmonella Typhimurium in modo dose-dipendente (Jacobson et al., 2018). L'esposizione a concentrazioni più elevate di PPA potrebbe selezionare batteri resistenti alle sue proprietà antimicrobiche e che potrebbero non essere necessariamente in grado di metabolizzarlo o produrlo. Ad esempio, diverse specie di Parabacteroides hanno mostrato un'abbondanza significativamente maggiore nei campioni di PPA, ma non sono stati rilevati geni correlati al metabolismo o alla produzione di PPA (Tabelle supplementari 2, 4 e 5). Inoltre, la produzione di PPA come sottoprodotto della fermentazione è ampiamente diffusa tra vari batteri (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Una maggiore diversità batterica potrebbe essere la ragione della maggiore abbondanza di geni correlati al metabolismo del PPA nei campioni di controllo (Averina et al., 2020). Inoltre, solo 27 (2,14%) dei 1332 geni sono stati previsti come geni associati esclusivamente al metabolismo del PPA. Molti geni associati al metabolismo del PPA sono anche coinvolti in altre vie metaboliche. Ciò dimostra ulteriormente che l'abbondanza di geni coinvolti nel metabolismo del PPA era maggiore nei campioni di controllo; questi geni potrebbero funzionare in vie metaboliche che non portano all'utilizzo o alla formazione di PPA come sottoprodotto. In questo caso, solo un gene associato alla generazione di PPA ha mostrato differenze significative di abbondanza tra i tipi di campione. A differenza dei geni associati al metabolismo del PPA, sono stati selezionati geni marker per la produzione di PPA perché direttamente coinvolti nel percorso batterico di produzione del PPA. Nei topi esposti al PPA, tutte le specie hanno mostrato un aumento significativo dell'abbondanza e della capacità di produrre PPA. Ciò supporta l'ipotesi che il PPA selezioni i produttori di PPA e, di conseguenza, che la capacità di produzione di PPA aumenti. Tuttavia, l'abbondanza genica non è necessariamente correlata all'espressione genica; pertanto, sebbene l'abbondanza di geni associati al metabolismo del PPA sia maggiore nei campioni di controllo, il tasso di espressione potrebbe essere diverso (Shi et al., 2014). Per confermare la relazione tra la prevalenza dei geni che producono PPA e la produzione di PPA, sono necessari studi sull'espressione dei geni coinvolti nella produzione di PPA.
L'annotazione funzionale dei metagenomi PPA e di controllo ha rivelato alcune differenze. L'analisi PCA del contenuto genico ha rivelato cluster discreti tra i campioni PPA e di controllo (Figura 5). Il clustering all'interno del campione ha rivelato che il contenuto genico di controllo era più diversificato, mentre i campioni PPA si raggruppavano insieme. Il clustering per contenuto genico era paragonabile al clustering per composizione delle specie. Pertanto, le differenze nell'abbondanza dei pathway sono coerenti con i cambiamenti nell'abbondanza di specie e ceppi specifici al loro interno. Nei campioni PPA, due pathway con un'abbondanza significativamente maggiore erano correlati al metabolismo degli amminozuccheri/nucleotidi zuccherini (ko:K21279) e a molteplici pathway del metabolismo lipidico (ko:K00647, ko:K03801; Tabella supplementare 3). I geni associati a ko:K21279 sono noti per essere associati al genere Bacteroides, uno dei generi con un numero significativamente maggiore di specie nei campioni PPA. Questo enzima può eludere la risposta immunitaria esprimendo polisaccaridi capsulari (Wang et al., 2008). Questo potrebbe spiegare l'aumento di Bacteroidetes osservato nei topi esposti a PPA. Ciò si aggiunge all'aumento della sintesi di acidi grassi osservato nel microbioma PPA. I batteri utilizzano la via FASIIko:K00647 (fabB) per produrre acidi grassi, che possono influenzare le vie metaboliche dell'ospite (Yao e Rock, 2015; Johnson et al., 2020), e le modifiche nel metabolismo lipidico possono svolgere un ruolo nello sviluppo neurologico (Yu et al., 2020). Un'altra via metabolica che ha mostrato un aumento di abbondanza nei campioni PPA è stata la biosintesi degli ormoni steroidei (ko:K12343). Vi sono sempre più prove che esista una relazione inversa tra la capacità del microbiota intestinale di influenzare i livelli ormonali e di essere influenzato dagli ormoni, in modo tale che livelli elevati di steroidi possano avere conseguenze a valle sulla salute (Tetel et al., 2018).
Questo studio presenta alcune limitazioni e considerazioni. Una distinzione importante è che non abbiamo effettuato valutazioni fisiologiche sugli animali. Pertanto, non è possibile concludere direttamente se le modifiche del microbioma siano associate a qualche malattia. Un'altra considerazione è che i topi in questo studio sono stati alimentati con la stessa dieta delle loro madri. Studi futuri potrebbero determinare se il passaggio da una dieta ricca di PPA a una dieta priva di PPA migliori i suoi effetti sul microbioma. Una limitazione del nostro studio, come di molti altri, è la dimensione limitata del campione. Sebbene si possano trarre conclusioni valide, un campione più ampio fornirebbe una maggiore potenza statistica nell'analisi dei risultati. Siamo inoltre cauti nel trarre conclusioni su un'associazione tra le modifiche del microbioma intestinale e qualsiasi malattia (Yap et al., 2021). Fattori confondenti come età, sesso e dieta possono influenzare significativamente la composizione dei microrganismi. Questi fattori possono spiegare le incongruenze osservate in letteratura riguardo all'associazione del microbioma intestinale con malattie complesse (Johnson et al., 2019; Lagod e Naser, 2023). Ad esempio, è stato dimostrato che i membri del genere Bacteroidetes sono aumentati o diminuiti in animali e umani con ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Allo stesso modo, studi sulla composizione intestinale in pazienti con malattie infiammatorie croniche intestinali hanno riscontrato sia aumenti che diminuzioni negli stessi taxa (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Per limitare l'impatto del bias di genere, abbiamo cercato di garantire una rappresentazione equa dei sessi in modo che le differenze fossero più probabilmente determinate dalla dieta. Una sfida dell'annotazione funzionale è la rimozione delle sequenze geniche ridondanti. Il nostro metodo di clustering genico richiede un'identità di sequenza del 95% e una similarità di lunghezza dell'85%, nonché una copertura di allineamento del 90% per eliminare i cluster falsi. Tuttavia, in alcuni casi, abbiamo osservato COG con le stesse annotazioni (ad esempio, MUT) (Fig. 6). Sono necessari ulteriori studi per determinare se questi ortologhi siano distinti, associati a generi specifici o se si tratti di una limitazione dell'approccio di clustering genico. Un'altra limitazione dell'annotazione funzionale è la potenziale errata classificazione; il gene batterico mmdA è un enzima noto coinvolto nella sintesi del propionato, ma KEGG non lo associa al percorso metabolico del propionato. Al contrario, gli ortologhi scpB e mmcD sono correlati. L'elevato numero di geni senza knockout designati può comportare l'impossibilità di identificare i geni correlati alla PPA quando si valuta l'abbondanza genica. Studi futuri trarranno beneficio dall'analisi del metatrascrittoma, che può fornire una comprensione più approfondita delle caratteristiche funzionali del microbiota intestinale e collegare l'espressione genica a potenziali effetti a valle. Per gli studi che coinvolgono specifici disturbi dello sviluppo neurologico o malattie infiammatorie intestinali, sono necessarie valutazioni fisiologiche e comportamentali degli animali per collegare le modifiche nella composizione del microbiota a tali disturbi. Sarebbero inoltre utili ulteriori studi che prevedano il trapianto del microbiota intestinale in topi privi di germi, al fine di determinare se il microbiota sia un fattore scatenante o una caratteristica della malattia.
In sintesi, abbiamo dimostrato che l'assunzione di PPA con la dieta agisce come fattore di alterazione della composizione del microbiota intestinale. Il PPA è un conservante approvato dalla FDA, ampiamente presente in diversi alimenti, che, in caso di esposizione prolungata, può portare a una perturbazione della normale flora intestinale. Abbiamo riscontrato cambiamenti nell'abbondanza di diversi batteri, suggerendo che il PPA può influenzare la composizione del microbiota intestinale. Le alterazioni del microbiota possono portare a cambiamenti nei livelli di determinate vie metaboliche, che a loro volta possono causare cambiamenti fisiologici rilevanti per la salute dell'ospite. Sono necessari ulteriori studi per determinare se gli effetti del PPA assunto con la dieta sulla composizione microbica possano portare a disbiosi o ad altre patologie. Questo studio pone le basi per future ricerche su come gli effetti del PPA sulla composizione intestinale possano influenzare la salute umana.
I set di dati presentati in questo studio sono disponibili in repository online. Il nome del repository e il numero di accesso sono: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Questo studio sugli animali è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida Centrale (UCF-IACUC) (Numero di autorizzazione all'uso degli animali: PROTO202000002). Questo studio è conforme alle leggi, ai regolamenti e ai requisiti istituzionali locali.
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Data di pubblicazione: 18 aprile 2025