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A differenza dei vertebrati, si ritiene che gli insetti siano privi di ormoni steroidei sessuali maschili. Nell'Anopheles gambiae, lo steroide ecdisone 20-idrossiecdisone (20E) sembra essersi evoluto per controllare lo sviluppo delle uova quando sintetizzato dalle femmine2 e per indurre un periodo refrattario all'accoppiamento quando trasferito sessualmente dai maschi3. Poiché lo sviluppo delle uova e l'accoppiamento sono tratti riproduttivi essenziali, comprendere come le zanzare femmine Anopheles integrano questi segnali ormonali potrebbe facilitare la progettazione di nuovi programmi di controllo della malaria. Qui, riveliamo che queste funzioni riproduttive sono regolate da distinti steroidi sessuali attraverso una complessa rete di enzimi che attivano/disattivano gli ecdisteroidi. Abbiamo identificato un ecdisone ossidato specifico del maschio, 3-deidro-20E (3D20E), che protegge la parentela disattivando la ricettività sessuale femminile in seguito al trasferimento sessuale e all'attivazione mediante defosforilazione. In particolare, il trasferimento 3D20E ha anche indotto l'espressione di geni riproduttivi che mantengono lo sviluppo delle uova durante l'infezione da Plasmodium, garantendo la salute delle femmine infette. Il 20E derivato dalle femmine non provoca una risposta sessuale, ma consente agli individui in fase di accoppiamento di deporre le uova dopo che le chinasi che inibiscono il 20E sono state inibite. L'identificazione di questo ormone steroideo degli insetti specifico del maschio e il suo ruolo nella regolazione della ricettività sessuale femminile, della fertilità e dell'interazione con il Plasmodium suggeriscono il potenziale di ridurre il successo riproduttivo delle zanzare che trasmettono la malaria.
I casi e i decessi per malaria sono di nuovo in aumento4 a causa della diffusa resistenza agli insetticidi delle zanzare Anopheles, l'unico vettore dei parassiti della malaria umana. La biologia dell'accoppiamento di queste zanzare è un obiettivo particolarmente interessante per nuovi interventi di controllo della malaria perché le femmine si accoppiano una sola volta5; rendere sterile questo singolo evento di accoppiamento avrebbe un grande potenziale per ridurre le popolazioni di zanzare sul campo.
Le donne diventano sessualmente incapaci dopo aver ricevuto ormoni steroidei ad alto titolo dagli uomini. Studi hanno dimostrato che il fattore scatenante della difficoltà nell'accoppiamento successivo è il 20-idrossiecdisone (20E), un ormone steroideo meglio noto come regolatore del ciclo di muta nella fase larvale. La capacità dei maschi di sintetizzare e trasferire il 20E si è evoluta specificamente nelle specie di Anopheles che fanno parte del sottogenere Cellia7, che è distribuito in Africa e include i vettori più pericolosi della malaria, tra cui Anopheles gambiae. Ciò è particolarmente degno di nota perché in queste specie le femmine producono anche 20E dopo ogni pasto di sangue e il 20E guida il ciclo dell'oogenesi (vedere rif. 8). Tuttavia, si sa poco sul modo in cui le femmine integrano i segnali da due diverse fonti di ecdisone (trasferimento maschile e induzione dell'alimentazione con il sangue) senza compromettere la propria capacità di accoppiarsi. Infatti, se il 20E prodotto dalle femmine innesca l'intolleranza sessuale, ciò porterà all'infertilità negli individui che allattano vergini, un comportamento molto comune in queste zanzare5.
Una possibile spiegazione è che i maschi di A. gambiae trasferiscano un ecdisone modificato specifico del maschio, che attiva una cascata di segnali nel tratto riproduttivo femminile, con conseguente instabilità nell'accoppiamento. Tuttavia, sebbene i vertebrati abbiano molteplici ormoni steroidei, come estrogeni e androgeni (rivisti nel rif. 9), a nostra conoscenza, non sono stati identificati steroidi androgeni negli insetti.
Ci siamo prefissati di determinare il repertorio di ormoni steroidei nella ghiandola accessoria maschile (MAG) di A. gambiae sessualmente matura alla ricerca di possibili steroidi modificatori. Utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa tandem (HPLC-MS/MS) anziché il metodo meno specifico precedentemente utilizzato, abbiamo rilevato ecdisone (E) e 20E in questo tessuto, confermando il risultato precedente. Tuttavia, il campione era dominato da steroidi fosforilati ossidati, coerenti con la formula 3-deidro-20E-22-fosfato (3D20E22P)12 (Figura 1). Altre forme includono 3-deidro-20E (3D20E) e 20E-22-fosfato (20E22P). L'intensità del segnale HPLC-MS/MS di 3D20E22P era due ordini di grandezza superiore alla sua forma defosforilata, 3D20E, e tre ordini di grandezza superiore rispetto a quello di E e 20E (Figura 1). Sebbene in altre parti del corpo e nel tratto riproduttivo inferiore (LRT; dati estesi Fig. 1a). Abbiamo anche analizzato gli ecdisteroidi nei maschi e nelle femmine appena chiusi (<1 giorno di età) e rilevato 3D20E e 3D20E22P solo in MAG; E, 20E e 20E22P erano presenti in entrambi i sessi (dati estesi Fig. 1b). Questi dati suggeriscono che i maschi adulti di A. gambiae producono titoli elevati di ormoni modificatori nei loro MAG che non vengono sintetizzati dalle femmine.
MAG e LRT femminile (inclusi atri, vescicole seminali e parovario) sono stati sezionati da maschi vergini di 4 giorni (4 giorni) e femmine vergini e accoppiate (0,5, 3 e 12 hpm). L'ecdisone in questi tessuti è stato analizzato tramite HPLC-MS/MS (media ± sem; t-test non accoppiato, bilaterale, tasso di falsi positivi (FDR) corretto; NS, non significativo; *P < 0,05, **P < 0,01 . 3D20E: 3 ore contro 0,5 ore, P = 0,035; 12 ore contro 3 ore, P = 0,0015; 12 ore contro 0,5 ore, P = 0,030. 3D20E22P: 3 ore contro 0,5 ore, P = 0,25; 12 ore rispetto a 3 ore, P = 0,0032; 12 ore rispetto a 0,5 ore, P = 0,015). I dati provengono da tre repliche biologiche. L'area di picco per ciascun ecdisone di interesse è stata calcolata e normalizzata in base al numero di zanzare. L'ecdisone è rappresentato dal colore come segue: E, verde; 20E, arancione; 20E22P, viola; 3D20E, blu; 3D20E22P, rosa. L'inserto aumenta la scala sull'asse y per mostrare livelli inferiori di ecdisone.
Per indagare se 3D20E22P e 3D20E vengono trasferiti durante l'accoppiamento, abbiamo sezionato le LRT femminili in vari momenti dopo l'accoppiamento. Sebbene l'ecdisone non sia stato trovato nelle vergini, abbiamo osservato quantità sostanziali di 3D20E22P nella LRT subito dopo l'accoppiamento (0,5 ore dopo l'accoppiamento, hpm), diminuendo nel tempo, mentre i livelli di 3D20E sono aumentati significativamente (Fig. 1). Utilizzando 3D20E sintetizzato chimicamente come standard, abbiamo determinato che i livelli di questo ormone steroideo nelle LRT in accoppiamento erano almeno 100 volte superiori a 20E (Tabella dati estesa 1). Pertanto, 3D20E22P è il principale ecdisone maschile che viene trasferito alla LRT femminile durante l'accoppiamento e la sua forma defosforilata, 3D20E, diventa molto abbondante subito dopo l'accoppiamento. Ciò suggerisce un ruolo importante per quest'ultimo ecdisone nelle femmine biologia post-accoppiamento.
Dopo aver generato un nuovo set di dati di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) (Fig. 2a), utilizzando una pipeline bioinformatica personalizzata, abbiamo cercato l'ecdisone chinasi (EcK), l'ecdisone ossidasi (EO) e il gene della fosfatasi modificata 20E che codifica per l'ecdisone. L'EPP) è espresso nei tessuti riproduttivi. Abbiamo identificato un gene EPP candidato e due potenziali geni EcK (EcK1 ed EcK2), ma non siamo riusciti a trovare un buon gene EO candidato. In particolare, i singoli geni EPP sono stati espressi ad alti livelli (98,9° percentile) nei MAG gambiani ma non negli LRT femminili (Fig. 2b), contrariamente alle nostre aspettative poiché la defosforilazione di 3D20E22P si è verificata in questo tessuto femminile. Pertanto, riteniamo che l'EPP maschile possa essere trasferito durante l'accoppiamento. Infatti, abbiamo utilizzato l'etichettatura con isotopi stabili in vivo per mascherare la proteina femminile dopo l'accoppiamento, un enzima identificato tramite MS nell'atrio femminile (Fig. 2c e Tabella supplementare 1). La presenza di EPP in MAG e LRT femminile accoppiata (ma non vergine) è stata confermata anche utilizzando anticorpi specifici (Fig. 2d).
a, Una pipeline bioinformatica personalizzata per cercare nei tessuti riproduttivi di ciascun sesso i geni che codificano EcK, EO ed EPP. I numeri accanto alle frecce indicano il numero di candidati maschi e femmine a ogni passaggio. Questa analisi ha identificato un gene EPP (EPP) e un gene EcK (EcK1) espressi nei maschi e un gene EcK (EcK2) espresso in entrambi i sessi ma che non produce un gene EO candidato. b, Mappa di calore che confronta l'espressione del gene candidato nei tessuti vergini (V) e in fase di accoppiamento (M) di Anopheles gambiae e Anopheles albicans. Spca, fecondazione; MAG, ghiandole accessorie nei maschi; altre parti del corpo, tra cui seni, ali, zampe, corpi grassi e organi interni in entrambi i sessi e ovaie nelle femmine. EcK2 è altamente espresso sia nel MAG che negli atri del Gambia, mentre EPP si trova solo nel MAG.c, Analisi proteomica della traslocazione del gruppo eiaculato maschile negli atri femminili a 3, 12 e 24 hpm, che mostra le 67 proteine ​​più abbondanti. Le femmine sono state allevate con una dieta contenente 15N per etichettare (e mascherare) tutte le proteine. I maschi non etichettati sono stati accoppiati con femmine etichettate e gli LRT femminili sono stati sezionati a 3, 12 e 24 hpm per l'analisi proteomica (vedere la Tabella supplementare 1 per un elenco completo delle proteine ​​eiaculatorie). Inserto, EPP, Eck1 ed EcK2 sono stati rilevati nel MAG dei maschi vergini mediante analisi proteomica di questi tessuti.d, EPP è stato rilevato mediante Western blot nel MAG e nell'LRT degli accoppiati femmine, ma non nelle femmine o nei maschi vergini o nel resto del corpo femminile. Le membrane sono state sondate simultaneamente con anticorpi anti-actina (controllo di caricamento) e anti-EPP. Tutti i maschi sono vergini. Vedere la Figura supplementare 1 per i dati sulla fonte del gel. I Western blot sono stati eseguiti due volte con risultati simili.
L'attività della fosfofosfatasi ecdisteroide dell'EPP è stata verificata dopo l'incubazione mediante HPLC-MS/MS con 3D20E22P isolato da MAG (dati estesi Fig. 2a). Inoltre, quando abbiamo silenziato l'EPP mediante interferenza mediata da RNA (RNAi), abbiamo rilevato una forte riduzione dell'attività fosfatasi nei tessuti riproduttivi di questi maschi (Fig. 3a) e le femmine accoppiate con maschi silenziati dall'EPP hanno mostrato una percentuale significativamente inferiore di 3D20E defosforilato (Fig. 3b) nonostante il silenziamento genico parziale (dati estesi Fig. 2b,c). Al contrario, non abbiamo rilevato cambiamenti significativi nel rapporto 20E22P/20E nelle stesse zanzare, il che potrebbe suggerire che l'enzima è specifico per 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Attività fosfatasica ridotta in MAG causata dal silenziamento dell'EPP utilizzando controlli di RNA EPP a doppio filamento (dsEPP) o RNA GFP a doppio filamento (dsGFP). Sono stati utilizzati venti pool di MAG in ogni replica (P = 0,0046, t-test accoppiato, bilaterale), rappresentati da punti separati. b, Le femmine accoppiate con maschi silenziati per EPP avevano una proporzione significativamente inferiore di 3D20E defosforilato a 3 hpm (P = 0,0043, t-test non accoppiato, bilaterale), mentre i livelli di 20E non erano interessati (P ​​= 0,063, non accoppiato). t-test, bilaterale). I dati sono presentati come media ± sem da tre pool di 13, 16 e 19 femmine ciascuno.c, Le femmine accoppiate con maschi silenziati dall'EPP avevano tassi significativamente più elevati di riaccoppiamento (P = 0,0002, test esatto di Fisher, bilaterale). Le femmine sono state prima costrette ad accoppiarsi per garantire il loro stato di accoppiamento; Due giorni dopo, sono stati contattati con altri maschi portatori di sperma transgenico per valutare i tassi di riaccoppiamento mediante rilevamento PCR quantitativo del transgene. Le femmine alimentate con sangue accoppiate con maschi silenziati con EPP avevano una fertilità significativamente ridotta (P < 0,0001; test di Mann-Whitney, bilaterale) e un numero di uova leggermente ridotto (P = 0,088, test di Mann-Whitney, bilaterale), mentre il tasso di deposizione delle uova non era influenzato (P = 0,94, test esatto di Fisher, bilaterale). In tutti i pannelli, n rappresenta il numero di campioni di zanzare biologicamente indipendenti. NS, non significativo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Successivamente, abbiamo valutato se la defosforilazione dell'ecdisone è importante per indurre la resistenza all'accoppiamento nelle femmine. In particolare, le femmine accoppiate con maschi con deplezione di EPP si sono accoppiate di nuovo con una frequenza molto più alta (44,9%) rispetto alle femmine di controllo (10,4%) quando esposte a maschi aggiuntivi (transgenici) (Fig. 3c). Abbiamo anche osservato una significativa diminuzione della fertilità (Fig. 3d, sinistra) e una leggera diminuzione del numero di uova deposte da queste femmine (Fig. 3d, centro), mentre la percentuale di uova deposte dalle femmine (un'altra risposta suscitata nelle femmine dall'accoppiamento)) non è stata influenzata (Fig. 3d, destra). Data la specificità osservata dell'EPP per 3D20E22P, questi risultati suggeriscono che l'attivazione di 3D20E da parte dell'EPP trasferita durante l'accoppiamento può avere un ruolo importante nel disattivare la recettività femminile a ulteriori accoppiamenti, un comportamento precedentemente attribuito al trasferimento sessuale di 20E. Pertanto, questo comportamento specifico del maschio L'ormone influisce notevolmente anche sulla fertilità femminile.
Successivamente, abbiamo confrontato le attività di 20E e 3D20E in esperimenti di iniezione in vergini sessualmente mature utilizzando 3D20E sintetizzato chimicamente (Fig. 4a–c) e 20E disponibile in commercio. Abbiamo osservato che 3D20E era significativamente più efficace di 20E nell'inibire la sensibilità femminile all'accoppiamento a entrambe le concentrazioni (Fig. 4d). In particolare, metà del livello fisiologico di 3D20E nell'LRT (1.066 pg post-iniezione contro 2.022 pg post-accoppiamento) ha indotto una percentuale di femmine refrattarie che era 20 volte superiore al livello fisiologico di 20E (361 pg post-iniezione) 24 ore dopo l'iniezione alla concentrazione più alta 18 pg post-accoppiamento; Tabella dati estesa 1). Questo risultato è coerente con l'idea che il trasferimento sessuale di 20E non causi periodi refrattari all'accoppiamento e indica inoltre 3D20E come un fattore importante nel garantire la relazione genitore-figlio. 3D20E è risultato anche significativamente più attivo di 20E nei test di deposizione delle uova nelle femmine vergini (Fig. 4e), suggerendo che il normale tasso di deposizione delle uova osservato dopo il silenziamento parziale dell'EPP era dovuto alla presenza di attività residua di 3D20E ancora prodotta da fattori femminili indotti dall'accoppiamento.
(a,b) 3D20E sintetizzato chimicamente da 20E (a) con conversione/efficienza molto elevata (dati presentati come media ± sem da tre reazioni di sintesi indipendenti) (b).c, Lo spettro di massa (metà inferiore) corrisponde esattamente all'ecdisone trovato nelle femmine accoppiate LRT (metà superiore).d, Rispetto a 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; test esatto di Fisher, bilaterale) e etanolo al 10% (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; test esatto di Fisher, bilaterale), mentre 20E era significativamente più alto del controllo solo a dosi più elevate (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; test esatto di Fisher, bilaterale).e, l'iniezione 3D20E ha indotto tassi di deposizione delle uova significativamente più elevati nelle femmine vergini rispetto ai controlli con etanolo al 10% (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; test esatto di Fisher, bilaterale), mentre 20E rispetto ai controlli solo a dosi più elevate (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; test esatto di Fisher, bilaterale).3D20E ha indotto tassi di deposizione delle uova significativamente più elevati rispetto a 20E a dosi più elevate (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; test esatto di Fisher, bilaterale).In tutti i pannelli, n rappresenta il numero di campioni di zanzare biologicamente indipendenti.NS, non significativo.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. I dati provengono da tre repliche.
In studi precedenti, abbiamo determinato che il trasferimento sessuale di ormoni steroidei induce l'espressione di MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), un gene riproduttivo femminile che protegge le femmine di A. gambiae dall'infezione da P. falciparum. Costi sanitari causati da 13, il parassita della malaria umana più mortale. Data l'importanza di MISO per l'idoneità riproduttiva di Anopheles nelle aree endemiche per la malaria, abbiamo deciso di determinare quale ormone 3D20E o 20E innesca l'espressione di questo gene. Abbiamo scoperto che mentre l'iniezione di 20E induceva specificamente o più potentemente alcuni recettori ormonali nucleari (HR), come HR3 e HR4, e tipici bersagli steroidei a valle, come i geni tuolcogeni Vg14, 15, 16, MISO era indotto più fortemente da 3D20E (dati estesi Fig. 3). Pertanto, il trasferimento sessuale di questo ormone steroideo androgeno sembra indurre meccanismi che proteggono femmine dai costi posti dall'infezione parassitaria. Inoltre, 3D20E colpisce in modo differenziale entrambe le isoforme del recettore E EcR, inducendo EcR-A e reprimendo EcR-B, e innescando più fortemente altri geni che inducono l'accoppiamento, tra cui HPX15, che influenza la fertilità femminile. Ciò potrebbe spiegare la significativa infertilità osservata nelle femmine accoppiate con maschi silenziati dall'EPP (dati estesi Fig. 3). Questi dati suggeriscono l'esistenza di percorsi a valle attivati ​​preferenzialmente da due ormoni ecdisone che potrebbero essere alla base della funzione sesso-specifica.
Successivamente, abbiamo testato la funzione dei due geni EcK identificati nella nostra pipeline bioinformatica. Il silenziamento di EcK1 o EcK2 ha provocato una mortalità significativa nei maschi (dati estesi Fig. 4a), suggerendo che la fosforilazione dell'ecdisone, e quindi l'inattivazione, è importante per la sopravvivenza. Poiché EcK2 era espresso a livelli più alti di EcK1 ed è stato rilevato nei MAG mediante proteomica (Fig. 2b, c e Tabella supplementare 2), abbiamo convalidato la sua attività di ecdisteroide chinasi incubandolo con 20E, che ha provocato la fosforilazione di 20E22P (dati estesi Figura 2).4b). Utilizzando 3D20E come substrato, non siamo stati in grado di rilevare il prodotto fosforilato 3D20E22P (dati estesi Fig. 4c), suggerendo che 20E piuttosto che 3D20E potrebbe essere il bersaglio preferito di EcK2.
Secondo la nostra analisi RNA-seq, EcK2 era anche altamente espresso nell'LRT delle femmine vergini, dove veniva disattivato dopo l'accoppiamento (Fig. 2b). Abbiamo confermato questi dati e determinato che l'espressione di EcK2 non era influenzata dall'alimentazione con sangue (dati estesi Fig. 5a). Estendendo i nostri esperimenti MS iniziali, abbiamo determinato che il picco di 20E22P era strettamente correlato al picco di 20E (22-26 ore dopo il pasto di sangue; dati estesi Fig. 5b). Il silenziamento di EcK2 nelle femmine vergini ha comportato un aumento di 3 volte del rapporto relativo tra 20E e 20E22P a 26 ore dopo il pasto di sangue (dati estesi Figure 2c e 5c), confermando che EcK2 fosforila anche 20E nelle femmine. In particolare, le vergini con deplezione di EcK2 hanno mantenuto la piena ricettività sessuale (dati estesi Fig. 5d, e), suggerendo ulteriormente che la produzione femminile di 20E non induce periodi refrattari all'accoppiamento. Tuttavia, queste femmine avevano tassi di deposizione delle uova significativamente aumentati rispetto ai controlli, con oltre il 30% delle vergini che deponevano uova (dati estesi Fig. 5f). Se le iniezioni di RNA Eck2 a doppio filamento (dsEcK2) venivano eseguite dopo l'alimentazione con sangue, la deposizione delle uova non si verificava, punto in cui il picco di 20E dovuto all'ingestione di sangue era diminuito. Nel complesso, questi risultati supportano un modello secondo cui il 20E prodotto dopo l'aspirazione del sangue può indurre la deposizione delle uova, ma solo quando il blocco della deposizione delle uova (EcK2 e possibilmente altri fattori) viene disattivato dall'accoppiamento. Né le iniezioni di 20E né quelle 3D20E hanno inibito l'espressione di EcK2 nelle vergini (dati estesi Fig. 5g), suggerendo che altri fattori mediano l'inibizione di questa chinasi. Tuttavia, i livelli di 20E dopo l'alimentazione con sangue non erano sufficienti a indurre disagio durante l'accoppiamento, ma erano effettivamente innescati da titoli elevati di sessualmente trasferito 3D20E.
I nostri risultati forniscono importanti informazioni sui meccanismi che regolano il successo riproduttivo di A. gambiae. È emerso un modello in cui i maschi si sono evoluti per sintetizzare alti titoli di 3D20E, un ecdisone modificato specifico per i maschi che assicura la parentela desensibilizzando le femmine a ulteriori accoppiamenti. Allo stesso tempo, questi vettori della malaria hanno anche sviluppato un sistema efficiente per attivare 3D20E nelle femmine in risposta al trasferimento sessuale di EPP specifico per i maschi. A nostra conoscenza, questo è il primo esempio di un sistema ormonale steroideo dominato da maschi e femmine che svolge una funzione unica e critica negli insetti. La funzione dell'ecdisone specifico per i maschi è stata postulata ma non definitivamente dimostrata. Ad esempio, un'ipotesi ampiamente smentita 18 è che queste funzioni possano essere svolte dal precursore 20E E1. È ben noto che in Drosophila, la monandria è innescata dal trasferimento sessuale di piccoli peptidi sessuali19,20 che interagiscono con i neuroni che innervano la femmina tratto riproduttivo attraverso specifici recettori peptidici sessuali21,22. Sono necessari ulteriori studi per determinare le cascate di segnalazione a valle controllate da 3D20E nelle femmine di A. gambiae e per determinare se queste cascate possono essere conservate tra zanzare e Drosophila.
Dato l'importante ruolo del 3D20E sulla fertilità e sul comportamento femminile identificato nel nostro studio, i percorsi che portano alla sintesi e all'attivazione del 3D20E offrono nuove opportunità per future strategie di controllo delle zanzare, come la generazione di maschi sterili competitivi nelle strategie tecnologiche degli insetti sterili. Utilizzare per il rilascio in natura o per imitare il 3D20E nel gioco delle vergini. La funzione specifica del 3D20E del maschio potrebbe essersi evoluta quando A. gambiae e altre specie di Cellia hanno acquisito la capacità di coagulare il loro sperma in tappi di accoppiamento, poiché ciò consente il trasferimento efficiente di un gran numero di ormoni ed enzimi che attivano gli ormoni. A sua volta, l'evoluzione del 3D20E che implementa la monandria fornisce un meccanismo per le femmine (attraverso un'elevata espressione di MISO) per favorire la loro idoneità riproduttiva in aree ad alta prevalenza di malaria, che contribuisce indirettamente alla trasmissione del Plasmodium. Dato che è stato dimostrato che il 20E femminile ha effetti profondi sulla sopravvivenza e la crescita di P. falciparum nelle zanzare Anopheles femmine,24 sia maschi che femmine I percorsi degli ormoni steroidei sono ora aspetti chiave delle interazioni tra zanzare e parassiti.
I ceppi A. gambiae G3 sono stati allevati in condizioni standard per gli insetti (26-28 °C, 65-80% di umidità relativa, fotoperiodo luce/buio 12:12 ore). Le larve sono state nutrite con cibo per pesci in polvere (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets e Tetra Pond Sticks in un rapporto di 7:7:2). Le zanzare adulte sono state alimentate ad libitum con una soluzione di destrosio al 10% e sangue umano settimanale (componenti del sangue in studio). Le zanzare vergini sono state ottenute separando i sessi allo stadio pupale dopo aver esaminato le estremità al microscopio. I maschi portatori del transgene DsRed sono stati descritti in precedenza.
Sono stati eseguiti esperimenti di accoppiamento forzato secondo protocolli precedentemente descritti. Per l'accoppiamento naturale, femmine vergini di 4 giorni sono state tenute in un rapporto 1:3 con maschi vergini sessualmente maturi per due notti. Per gli esperimenti in cui ai maschi è stato iniettato dsEPP, la co-gabbiatura è coincisa con i giorni 3-4 successivi all'iniezione, quando l'attività della fosfatasi era al massimo silenziata (dati estesi Fig. 2b).
I tessuti delle zanzare, i cadaveri rimanenti (resto del corpo) o il corpo intero sono stati sezionati in metanolo al 100% e omogeneizzati con un microgranulatore (sfere di vetro da 2 mm, 2.400 giri/min, 90 sec). Le quantità di tessuto e i volumi di metanolo erano i seguenti: resto del corpo, 50 in 1.000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT femminile, 25–50 80 µl. Il precipitato è stato sottoposto a una seconda estrazione di metanolo con lo stesso volume di metanolo. I detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione. Il metanolo di entrambe le estrazioni è stato combinato ed essiccato sotto flusso di azoto, quindi risospeso nei seguenti volumi di metanolo all'80% in acqua: resto del corpo, 50 µl; MAG e LRT femminile, 30 µl.
I campioni sono stati analizzati su uno spettrometro di massa (ID-X, Thermo Fisher) accoppiato a uno strumento LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl di campione sono stati iniettati su una colonna da 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) mantenuta a 25 °C. Le fasi mobili per la LC erano A (acqua, acido formico allo 0,1%) e B (acetonitrile, acido formico allo 0,1%). Il gradiente LC era il seguente: 5% B per 1 minuto, quindi aumentato al 100% B in 11 minuti. Dopo 8 minuti al 100%, riequilibrare la colonna al 5% B per 4 minuti. La portata era di 0,3 ml min-1. La ionizzazione nella sorgente MS viene ottenuta mediante ionizzazione elettrospray riscaldata in modalità positiva e negativa.
Lo spettrometro di massa misura i dati nell'intervallo m/z da 350 a 680 a una risoluzione di 60.000 in modalità MS completa. I dati MS/MS sono stati acquisiti su [M + H]+ (tutti i target), [M - H2O + H]+ (tutti i target) e [M - H]- (target fosforilati). I dati MS/MS sono stati utilizzati per confermare le proprietà dell'ecdisone dei target per i quali non era disponibile alcuno standard. Per identificare gli ecdisteroidi non target, sono stati analizzati i dati MS/MS per tutti i picchi HPLC con abbondanza relativa >15%. Quantificare utilizzando curve standard create da standard puri (20E, 3D20E) per calcolare quantità assolute o diluizioni di un campione specifico (tutti gli altri target) per calcolare la loro equivalenza alle quantità trovate in un maschio. Per 3D20E, la quantificazione è stata eseguita utilizzando la somma dei seguenti addotti: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. I dati sono stati estratti e quantificati utilizzando Tracefinder (versione 4.1). I dati MS/MS sono stati analizzati utilizzando Xcalibur (versione 4.4). Gli spettri MS di E, 20E e 3D20E sono stati confrontati con i rispettivi standard. 3D20E22P è stato analizzato mediante derivatizzazione con il reagente di Girard. 20E22P è stato analizzato mediante rapporto m/z.
3D20E22P è stato purificato da MAG. La purificazione è stata eseguita su scala analitica utilizzando un cromatografo liquido ad altissima prestazione (Acquity, Waters) con un rivelatore di massa a quadrupolo (QDa, Acquity, Waters) nelle stesse condizioni LC dell'analisi HPLC-MS/MS. La raccolta delle frazioni è stata attivata quando il rapporto m/z corrispondente a 3D20E22P è stato rilevato allo stesso tempo di ritenzione precedentemente determinato. La purezza dei composti estratti è stata quindi verificata mediante HPLC-MS/MS come descritto sopra.
L'RNA totale è stato estratto da 10-12 tessuti riproduttivi o altre parti del corpo (senza testa) utilizzando il reagente TRI (Thermo Fisher) seguendo le istruzioni del produttore. L'RNA è stato trattato con TURBO DNasi (Thermo Fisher). Il cDNA è stato sintetizzato utilizzando la trascrittasi inversa del virus della leucemia murina di Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) seguendo le istruzioni del produttore. I primer per la PCR quantitativa con trascrizione inversa (RT-qPCR; Tabella dati estesa 2) sono stati precedentemente pubblicati24 o progettati utilizzando Primer-BLAST26, con preferenza data a prodotti di dimensioni pari a 70-150 bp e che coprono giunzioni esone-esone o coppie di primer che separano gli esoni. I campioni di cDNA da tre a quattro repliche biologiche sono stati diluiti quattro volte in acqua per RT-qPCR. La quantificazione è stata eseguita in reazioni replicate da 15 µl contenenti 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primer e 5 µl di cDNA diluito. Le reazioni sono state eseguite su un sistema PCR in tempo reale QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) e i dati sono stati raccolti e analizzati utilizzando Design and Analysis (versione 2.4.3). Come dimostrato in questo studio, le quantità relative sono state normalizzate al gene ribosomiale RpL19 (AGAP004422), la cui espressione non è cambiata in modo significativo con l'alimentazione con sangue 27 o l'accoppiamento 3 .
La qualità dell'RNA è stata verificata utilizzando un Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Le librerie Illumina paired-end sono state preparate ed eseguite presso il Broad Institute del MIT e di Harvard. Le letture di sequenziamento sono state allineate al genoma di A. gambiae (ceppo PEST, versione 4.12) utilizzando HISAT2 (versione 2.0.5) con parametri predefiniti. Le letture con punteggi di qualità di mappatura (MAPQ) <30 sono state rimosse utilizzando Samtools (versione 1.3.1). Il numero di letture mappate sui geni è stato conteggiato utilizzando htseq-count (versione 0.9.1) con parametri predefiniti. I conteggi delle letture normalizzate sono stati calcolati e l'espressione genica differenziale è stata analizzata utilizzando il pacchetto DESeq2 (versione 1.28.1) in R (versione 4.0.3).
I candidati genici modificatori dell'ecdisone sono stati identificati eseguendo prima una ricerca nel genoma di A. gambiae utilizzando l'algoritmo PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), utilizzando i valori predefiniti Parametri con le seguenti sequenze proteiche di query: da Bombyx mori (numero di accesso NP_001038956.1), Musca domestica (numero di accesso XP_005182020.1, XP_005175332.1 e XP_011294434.1) e Microplitis demolitor (numero di accesso XP_008552646.1 e XP_008552645.1) EcK da B. mori (numero di accesso NP_001036900), Drosophila melanogaster (numero di accesso NP_651202), Apis mellifera (numero di accesso XP_394838) e Acyrthosiphon pisum (numero di accesso XP_001947166); ed EPP da B. mori (numero di accesso XP_001947166) NP_001177919.1 e NP_001243996.1) ed EO di D. melanogaster (numero di accesso NP_572986.1) (fase 1). Successivamente, filtrare i risultati in base all'elevata espressione di mRNA (>100 frammenti/esoni di kilobase per milione di letture mappate (FPKM) o >85%) nel tessuto riproduttivo (LRT o MAG femminile) in Gambia (fase 2). Per migliorare la specificità, abbiamo selezionato enzimi candidati che sono espressi anche nel tessuto riproduttivo di A. albimanus, una specie di anofele che non sintetizza né trasferisce ecdisone durante l'accoppiamento. I geni candidati sono stati filtrati in base alla bassa espressione (<100 FPKM o <85° percentile) nel tessuto riproduttivo di A. albimanus (fase 3). Come filtro finale (fase 4), i geni candidati devono soddisfare almeno uno dei seguenti requisiti: (1) significativamente sovraregolati dopo l'accoppiamento (P < 0,05) secondo l'analisi dei geni differenzialmente espressi e (2) nei tessuti non riproduttivi (< 85% o <100 FPKM).
Abbiamo modificato i metodi 28, 29, 30 precedentemente descritti per ottenere l'etichettatura isotopica dell'intero organismo. In breve, il Saccharomyces cerevisiae di tipo II (YSC2, Sigma) di tipo selvatico è stato testato in una base di azoto di lievito (BD Difco, DF0335) contenente (peso/volume) il 2% di glucosio (G7528, Sigma), l'1,7% di terreno di coltura privo di aminoacidi e solfato di ammonio e il 5% di solfato di ammonio 15N (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) come unica fonte di azoto. Il lievito è stato recuperato tramite centrifugazione e le larve di zanzara sono state alimentate ad libitum fino alla pupa. Integrazione con farina di pesce (0,5 mg ogni 300 larve) per prevenire la mortalità al quarto stadio. Solo le femmine sono state quindi utilizzate negli esperimenti di accoppiamento con maschi non marcati per analizzare il proteoma maschile trasferito durante l'accoppiamento.
Le femmine vergini marcate con 15N di 4-6 giorni sono state costrette ad accoppiarsi con maschi vergini non marcati della stessa età. L'accoppiamento riuscito è stato verificato rilevando i tappi di accoppiamento mediante microscopia a epifluorescenza. A 3, 12 e 24 hpm, gli atri di 45-55 femmine accoppiate sono stati sezionati in 50 µl di tampone di bicarbonato di ammonio (pH 7,8) e omogeneizzati con un pestello. L'omogeneizzato è stato centrifugato e il supernatante miscelato con 50 µl di RapiGest allo 0,1% (186001860, Waters) in 50 mM di bicarbonato di ammonio. Il supernatante e il pellet di ciascun campione sono stati congelati rapidamente su ghiaccio secco e spediti durante la notte al laboratorio MacCoss presso l'Università di Washington, dove è stata completata la preparazione del campione per LC-MS/MS. Risospendere il pellet in 50 µl di RapiGest allo 0,1% in bicarbonato di ammonio 50 mM e sonicato in un bagno d'acqua. La concentrazione proteica del pellet e del surnatante è stata misurata mediante il test BCA, i campioni sono stati ridotti con 5 mM ditiotreitolo (DTT; Sigma), alchilati con 15 mM di iodoacetamide (Sigma) e incubati a 37 °C (1:0 50) per 1 ora con tripsinizzazione: rapporto tripsina:substrato). RapiGest è stato lisato mediante l'aggiunta di 200 mM di HCl, seguito da incubazione a 37 °C per 45 minuti e centrifugazione a 14.000 rpm per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti. I campioni sono stati lavati mediante estrazione in fase solida a doppia modalità (cartucce Oasis MCX, Waters) e risospesi in acido formico allo 0,1% per una concentrazione proteica finale di 0,33 µg µl-1. I proteomi MAG non marcati sono stati analizzati in modo simile da maschi vergini. Per ciascun campione sono state analizzate due repliche analitiche. Successivamente, 1 µg di ciascuno è stato analizzato utilizzando una colonna di silice fusa da 25 cm e 75 μm con una trappola per frit Kasil1 (PQ) di silice fusa da 4 cm riempita con resina a fase inversa Jupiter C12 (Phenomenex) e cromatografia liquida da 180 minuti. Digesting dei campioni: MS/MS è stato eseguito su uno spettrometro di massa Q-Exactive HF (Thermo Fisher) con un sistema nanoACQUITY UPLC (Waters). I dati di acquisizione correlati ai dati generati per ogni esecuzione sono stati convertiti in formato mzML utilizzando Proteowizard (versione 3.0.20287) e utilizzando Comet31 (versione 3.2) rispetto al database FASTA contenente sequenze proteiche di Anopheles gambiae (VectorBase versione 54), Anopheles coluzzi. È stata eseguita una ricerca su Mali-NIH (VectorBase versione 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marzo 2021), A. gambiae RNA-seq e traduzioni a tre frame di contaminanti umani noti. Gli FDR abbinati alla mappa peptidica sono stati determinati utilizzando Percolator32 (versione 3.05) con una soglia di 0,01 e i peptidi sono stati assemblati in identificazioni proteiche utilizzando la parsimonia proteica in Limelight33 (versione 2.2.0). L'abbondanza proteica relativa è stata stimata utilizzando il fattore di abbondanza spettrale normalizzato (NSAF) calcolato per ciascuna proteina in ogni esecuzione come precedentemente descritto. L'NSAF relativo a ciascuna proteina è stato calcolato in media su campioni provenienti da due diverse repliche biologiche. L'etichettatura 15N ha mascherato con successo il proteoma femminile, sebbene una piccola quantità di proteina non etichettata potesse essere rilevata dalle vergini etichettate. Abbiamo registrato il rilevamento della riduzione delle proteine ​​maschili (1-5 spettri) nei campioni grezzi femminili solo nelle esecuzioni tecniche, in cui i campioni grezzi sono stati eseguiti dopo i campioni maschili/di accoppiamento, come risultato del "carry over" HPLC. Le proteine ​​occasionali trovate come "contaminanti" dalle vergini etichettate sono elencate nella Tabella supplementare 1.
Due peptidi antigenici, QTTDRVAPAPDQQQ (all'interno dell'isotipo PA) e MESDGTPSGDSEQ (all'interno dell'isotipo PA e PB) in Genscript. I due peptidi sono stati combinati, quindi coniugati alla proteina trasportatrice KLH e iniettati in conigli neozelandesi. I conigli sono stati sacrificati dopo la quarta iniezione e l'IgG totale è stata isolata mediante purificazione per affinità. L'IgG del coniglio più specifico per EPP è stata utilizzata per un ulteriore western blotting.
Per i western blot, MAG (n = 10, dove n rappresenta il numero di campioni di zanzara biologicamente indipendenti) e LRT femmina (n = 30) da maschi vergini di 4 giorni e femmine vergini o forzate (<10 post-accoppiamento), tampone di estrazione proteica (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% sodio desossicolato; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× cocktail di inibitori della proteasi (Roche)) è stato aggiunto separatamente. I campioni sono stati omogeneizzati immediatamente dopo la dissezione con un beader (perle di vetro da 2 mm, 2.400 giri/min, 90 sec). I detriti insolubili sono stati rimossi mediante centrifugazione a 20.000 g a 4 °C. Le proteine ​​sono state quantificate mediante saggio Bradford (Bio-Rad). Quindi, 20 µg di proteina MAG, 40 µg di proteina LRT e 20 µg di proteine ​​residue in massa sono state denaturate e separate mediante il 10% di Bis-Tris NuPAGE utilizzando il tampone MOPS. Le proteine ​​sono state trasferite su membrane di fluoruro di polivinilidene utilizzando il sistema di trasferimento iBlot2 (Thermo Fisher). Le membrane sono state lavate due volte in 1× PBS-T (0,1% di Tween-20 in PBS) e quindi bloccate nel tampone di blocco Odyssey (Li-Cor) per 1 ora a 22°C. Le membrane sono state agitate per una notte a 4°C con anticorpo primario policlonale anti-EPP di coniglio personalizzato (1:700 nel tampone di blocco) e anticorpo primario monoclonale anti-actina di ratto MAC237 (Abeam; 1:4.000). Le membrane sono state lavate con PBS-T e quindi incubate con anticorpi secondari (asino anti-coniglio 800CW e capra anti-ratto 680LT (Li-Cor), entrambi 1:20.000) nel tampone di blocco contenente lo 0,01% di SDS e lo 0,2% di Tween -20 per 1 ora a 22 °C. Le membrane sono state lavate con PBS-T e acquisite con uno scanner Odyssey CLx. Le immagini sono state raccolte ed elaborate in Image Studio (versione 5.2). Non è stata rilevata una banda specifica corrispondente all'isoforma EPP-RA (82 kDa).
Le regioni codificanti di EPP (come isoforma AGAP002463-RB contenente dominio fosfatasi istidina, ricerca dominio conservato NCBI 34) ed EcK2 (AGAP002181) sono state clonate nel plasmide pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); I primer sono elencati nella Tabella 2 dei dati estesi. Otto linker GS4 (in tandem) sono stati inseriti prima del tag 6xHis C-terminale del costrutto pET-21a(+)-EcK2. Le proteine ​​ricombinanti sono state prodotte utilizzando la reazione di sintesi proteica di E. coli cell-free NEBExpress (New England BioLabs). Le proteine ​​ricombinanti sono state purificate utilizzando le colonne di spin Ni NEBExpress (New England BioLabs). La proteina di controllo della diidrofolato reduttasi (DHFR) è stata prodotta utilizzando il modello di DNA del kit di sintesi proteica di E. coli cell-free NEBExpress. Le proteine ​​sono state conservate in glicerolo al 50% in PBS a -20 °C per un massimo di 3 mesi.
L'attività fosfatasica dell'EPP e degli estratti tissutali è stata misurata utilizzando 4-nitrofenil fosfato (pNPP; Sigma-Aldrich). Il tampone di reazione conteneva 25 mM Tris, 50 mM acido acetico, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA e 1 mM DTT. Il tessuto è stato omogeneizzato nel tampone di reazione e i detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione. Avviare la reazione aggiungendo l'enzima o l'estratto tissutale al tampone di reazione contenente 2,5 mg ml-1 di pNPP. La miscela di reazione è stata incubata a temperatura ambiente al buio e la quantità di pNP convertita da pNPP è stata quantificata misurando l'assorbanza a 405 nm in vari momenti.
Per l'attività EcK in vitro, la proteina è stata incubata con 0,2 mg di 20E o 3D20E in 200 µl di tampone (pH 7,5) contenente 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP e 10 mM MgCl2 per 2 ore a 27 °C. La reazione è stata interrotta aggiungendo 800 µl di metanolo, quindi raffreddata a -20 °C per 1 ora, quindi centrifugata a 20.000 g per 10 minuti a 4 °C. Il surnatante è stato quindi analizzato tramite HPLC-MS/MS. Per inattivare termicamente le proteine ​​utilizzate nel gruppo di controllo, le proteine ​​sono state incubate in glicerolo al 50% in PBS per 20 minuti a 95 °C.
Per l'attività EPP in vitro, la proteina è stata incubata con 3D20E22P (equivalente alla quantità trovata in 18 coppie di MAG, purificate mediante HPLC-MS/MS) in 100 µl di tampone (pH 7,5) contenente 25 mM Tris, 50 mM acido acetico, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA e 1 mM DTT per 3 ore a 27 °C. La reazione è stata interrotta aggiungendo 400 µl di metanolo e raffreddata a -20 °C per 1 ora, quindi centrifugata a 20.000 g per 10 minuti a 4 °C. Il surnatante è stato analizzato mediante HPLC-MS/MS.
I frammenti PCR per EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ed EcK2 (556 bp) sono stati amplificati dal cDNA preparato da cadaveri di zanzare senza testa di sesso misto. Il frammento PCR del controllo eGFP (495 bp) è stato amplificato dal pCR2.1-eGFP precedentemente descritto; I primer PCR sono elencati nella Tabella dati estesa 2. Il frammento PCR è stato inserito tra i promotori T7 invertiti sul plasmide pL4440. I costrutti plasmidici sono stati recuperati da E. coli competente per NEB 5-α (New England Biolabs) e verificati mediante sequenziamento del DNA prima dell'uso (vedere Dati supplementari 1 per la sequenza dell'inserto). I primer abbinati al promotore T7 (Tabella dati estesa 2) sono stati utilizzati per amplificare l'inserto dal plasmide basato su pL4440. La dimensione del prodotto PCR è stata confermata mediante elettroforesi su gel di agarosio. Il dsRNA è stato trascritto dai modelli PCR utilizzando il kit di trascrizione Megascript T7 (Thermo Fisher) e purificato secondo le istruzioni del produttore con le modifiche descritte in precedenza.
Per l'iniezione di dsRNA, 1.380 ng di dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) sono stati iniettati a una concentrazione di 10 ng nl-1 nel torace di maschi o femmine adulti (Nanoject III, Drummond) entro 1 giorno dall'eclosione. I livelli di knockdown genico sono stati determinati in almeno tre repliche biologiche mediante estrazione di RNA, sintesi di cDNA e RT-qPCR. Per l'iniezione di ecdisone, femmine vergini di 4 giorni o vergini di 6 giorni alimentate con sangue sono state iniettate con 0,13, 0,21 o 0,63 µg di 20E o 3D20E (Nanoject III, Drummond) a concentrazioni rispettivamente di 1,3, 2,1, a seconda del disegno sperimentale o 6,3 ng nl-1. Iniettare 100 nl di Etanolo al 10% (vol/vol) in acqua; 100 nl di 3D20E22P in etanolo al 10% (equivalente al 75% della quantità presente in una coppia di MAG). Le zanzare sono state assegnate in modo casuale al gruppo di iniezione.
Per i test di deposizione delle uova, le femmine di 3 giorni sono state alimentate a volontà con sangue umano. Rimuovere le zanzare parzialmente alimentate o non alimentate. A seconda del trattamento, le femmine sono state poste in contenitori separati per la deposizione delle uova per quattro notti, almeno 48 ore dopo il pasto di sangue. Le uova sono state contate con uno stereoscopio (Stemi 508, Zeiss); per le femmine accoppiate, le uova che si sono schiuse in larve sono state considerate fertili.
Per le prove di accoppiamento, alle femmine è stato concesso almeno 2 giorni, a seconda del trattamento, per sviluppare resistenza all'accoppiamento, e maschi selvatici della stessa età sono stati successivamente introdotti nella stessa gabbia. Due notti dopo, le vescicole fecondate delle femmine sono state sezionate e il DNA genomico è stato rilasciato tramite congelamento-scongelamento e sonicazione in un tampone contenente 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA e 25 mM NaCl (pH 8,2). I campioni sono stati incubati con Proteinasi K (0,86 µg µl-1) per 15 minuti a 55 °C, seguiti da 10 minuti a 95 °C. Le preparazioni di DNA genomico grezzo sono state diluite 10 volte e sottoposte a rilevamento qPCR delle sequenze del cromosoma Y; i primer sono elencati nella Tabella dati estesa 2. L'assenza della sequenza del cromosoma Y indica nessun accoppiamento.
Per i test di re-accoppiamento, le femmine sottoposte ad accoppiamento forzato sono state esaminate per la presenza di tappi di accoppiamento per confermare lo stato di accoppiamento e hanno avuto 2 giorni per sviluppare refrattarietà all'accoppiamento in assenza di maschi, come precedentemente descritto 36. I maschi portatori di sperma transgenico DsRed sono stati quindi introdotti nelle gabbie delle femmine. Due notti dopo, le vescicole fecondanti sono state dissezionate dalle femmine e il DNA genomico è stato preparato come descritto sopra e sottoposto al rilevamento qPCR del transgene DsRed; i primer sono elencati nella Tabella dati estesa 2. L'assenza del transgene DsRed indicava che non si era verificato alcun re-accoppiamento.
Il 3D20E è stato sintetizzato come precedentemente descritto 37. In breve, 10 mg di 20E (Sigma-Aldrich) sono stati sciolti in 10 ml di acqua, seguiti dall'aggiunta di 30 mg di nero di platino (in polvere, Sigma-Aldrich). Un flusso delicato di O2 è stato fatto gorgogliare continuamente nella miscela di reazione, che è stata agitata a temperatura ambiente. Dopo 6 ore, sono stati aggiunti 30 ml di metanolo per interrompere la reazione. La miscela è stata centrifugata per rimuovere le particelle di catalizzatore. Il surnatante è stato evaporato a secchezza sotto vuoto a temperatura ambiente. Il prodotto di reazione essiccato è stato sciolto in etanolo al 10% e metanolo per iniezione per analisi HPLC-MS/MS. Il tasso di conversione (da 20E a 3D20E) è stato di circa il 97% (Fig. 4b) e lo spettro MS del 3D20E sintetizzato corrispondeva a quello trovato nelle femmine accoppiate (Fig. 4c).
La legenda contiene dettagli specifici dei test statistici eseguiti. GraphPad (versione 9.0) è stato utilizzato per eseguire il test esatto di Fisher, il test di Mantel-Cox e il test t di Student. I test di Cochran-Mantel-Haenszel sono stati eseguiti utilizzando uno script R personalizzato (disponibile su https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). La distribuzione dei dati è stata testata per la normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk con una soglia di significatività di 0,05. Quando i dati non hanno superato il test di normalità, è stato eseguito il test di Mann-Whitney. I dati di sopravvivenza sono stati analizzati utilizzando il test di Mantel-Cox. Il pacchetto DESeq2 (versione 1.28.1) è stato utilizzato per eseguire l'analisi dell'espressione differenziale a livello genico RNA-seq. La barra orizzontale sul grafico rappresenta la mediana. Un valore di significatività di P = 0,05 è stato utilizzato come soglia per tutti i test.
Per maggiori informazioni sulla progettazione dello studio, consultare l'abstract del Nature Research Report collegato a questo articolo.
I dati proteomici MS sono stati depositati nel consorzio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) tramite il PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) con l'identificativo del set di dati PXD032157.
Il set di dati RNA-seq è depositato nella Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) con il record seriale GSE198665.
Ulteriori set di dati generati e/o analizzati durante lo studio attuale possono essere ottenuti dagli autori corrispondenti su richiesta ragionevole. Questo articolo fornisce i dati di origine.
De Loof, A. Ecdisteroidi: steroidi sessuali degli insetti trascurati? Maschio: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
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