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A differenza dei vertebrati, si pensa comunemente che gli insetti siano privi di ormoni steroidei sessuali maschili. In Anopheles gambiae, lo steroide ecdisone 20-idrossiecdisone (20E) sembra essersi evoluto per controllare lo sviluppo delle uova quando sintetizzato dalle femmine2 e per indurre un periodo refrattario all'accoppiamento quando trasferito sessualmente dai maschi3. Poiché lo sviluppo delle uova e l'accoppiamento sono tratti riproduttivi essenziali, comprendere come le zanzare Anopheles femmine integrano questi segnali ormonali potrebbe facilitare la progettazione di nuovi programmi di controllo della malaria. Qui, riveliamo che queste funzioni riproduttive sono regolate da steroidi sessuali distinti attraverso una complessa rete di enzimi che attivano/inattivano gli ecdisteroidi. Abbiamo identificato un ecdisone ossidato specifico del maschio, il 3-deidro-20E (3D20E), che protegge la paternità bloccando la ricettività sessuale femminile in seguito al trasferimento sessuale e all'attivazione tramite defosforilazione. In particolare, il trasferimento di 3D20E ha anche indotto l'espressione di ormoni riproduttivi geni che mantengono lo sviluppo delle uova durante l'infezione da Plasmodium, garantendo la salute delle femmine infette. Il 20E derivato dalle femmine non induce una risposta sessuale, ma permette agli individui che si accoppiano di deporre le uova dopo che le chinasi che inibiscono il 20E sono state inibite. L'identificazione di questo ormone steroideo degli insetti specifico del maschio e il suo ruolo nella regolazione della ricettività sessuale femminile, della fertilità e dell'interazione con il Plasmodium suggeriscono la possibilità di ridurre il successo riproduttivo delle zanzare che trasmettono la malaria.
I casi e i decessi per malaria sono di nuovo in aumento4 a causa della diffusa resistenza agli insetticidi nelle zanzare Anopheles, l'unico vettore dei parassiti della malaria umana. La biologia dell'accoppiamento di queste zanzare rappresenta un obiettivo particolarmente interessante per nuovi interventi di controllo della malaria, poiché le femmine si accoppiano una sola volta5; rendere sterile questo singolo evento di accoppiamento avrebbe un grande potenziale per ridurre le popolazioni di zanzare sul campo.
Le donne diventano sessualmente incapaci dopo aver ricevuto ormoni steroidei ad alto titolo dagli uomini. Studi hanno dimostrato che il fattore scatenante della difficoltà nell'accoppiamento successivo è il 20-idrossiecdisone (20E), un ormone steroideo meglio noto come regolatore del ciclo di muta nello stadio larvale. La capacità dei maschi di sintetizzare e trasferire 20E si è evoluta specificamente nelle specie di Anopheles che fanno parte del sottogenere Cellia7, che è distribuito in Africa e include i vettori più pericolosi della malaria, tra cui Anopheles gambiae. Ciò è particolarmente degno di nota perché in queste specie anche le femmine producono 20E dopo ogni pasto di sangue e il 20E guida il ciclo dell'oogenesi (vedi rif. 8). Tuttavia, si sa poco sul modo in cui le femmine integrano i segnali provenienti da due diverse fonti di ecdisone (trasferimento maschile e induzione del pasto di sangue) senza compromettere la propria capacità di accoppiarsi. Infatti, se il 20E prodotto dalle femmine innesca l'intolleranza sessuale, ciò porterà a infertilità negli individui che si nutrono di femmine vergini, un comportamento molto comune in queste zanzare5.
Una possibile spiegazione è che i maschi di A. gambiae trasferiscano un ecdisone modificato specifico per il sesso maschile, che attiva una cascata di segnalazione nel tratto riproduttivo femminile, con conseguente instabilità dell'accoppiamento. Tuttavia, sebbene i vertebrati possiedano molteplici ormoni steroidei, come estrogeni e androgeni (riportati nel riferimento 9), a nostra conoscenza, steroidi con una forte componente androgenica non sono stati identificati negli insetti.
Abbiamo cercato di determinare il repertorio degli ormoni steroidei nella ghiandola accessoria maschile (MAG) di A. gambiae sessualmente maturo alla ricerca di possibili steroidi modificatori. Utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa tandem (HPLC-MS/MS) piuttosto che il metodo meno specifico precedentemente utilizzato, abbiamo rilevato ecdisone (E) e 20E in questo tessuto, confermando il risultato precedente. Tuttavia, il campione era dominato da steroidi fosforilati ossidati, coerenti con la formula 3-deidro-20E-22-fosfato (3D20E22P)12 (Figura 1). Altre forme includono 3-deidro-20E (3D20E) e 20E-22-fosfato (20E22P). L'intensità del segnale HPLC-MS/MS di 3D20E22P era due ordini di grandezza superiore a quella della sua forma defosforilata, 3D20E, e tre ordini di grandezza superiore a quella di E e 20E (Figura 1).Sebbene in altre parti del corpo e nel tratto riproduttivo inferiore (LRT; Figura 1a dei Dati Estesi).Abbiamo anche analizzato gli ecdisteroidi in maschi e femmine appena chiusi (<1 giorno di età) e rilevato 3D20E e 3D20E22P solo nel MAG; E, 20E e 20E22P erano presenti in entrambi i sessi (Figura 1b dei Dati Estesi).Questi dati suggeriscono che i maschi adulti di A. gambiae producono alti titoli di ormoni modificatori nei loro MAG che non sono sintetizzati dalle femmine.
MAG e LRT femminile (inclusi atri, vescicole seminali e parovario) sono stati dissezionati da maschi vergini di 4 giorni (4 giorni) e femmine vergini e accoppiate (0,5, 3 e 12 hpm). L'ecdisone in questi tessuti è stato analizzato mediante HPLC-MS/MS (media ± sem; test t non accoppiato, a due lati, tasso di falsa scoperta (FDR) corretto; NS, non significativo; *P < 0,05, **P < 0,01 . 3D20E: 3 ore contro 0,5 ore, P = 0,035; 12 ore contro 3 ore, P = 0,0015; 12 ore contro 0,5 ore, P = 0,030. 3D20E22P: 3 ore contro 0,5 ore, P = 0,25; 12 ore contro 3 ore, P = 0,0032; 12 ore contro 0,5 ore, P = 0,015). I dati provengono da tre repliche biologiche. L'area del picco per ogni ecdisone di interesse è stata calcolata e normalizzata in base al numero di zanzare. L'ecdisone è rappresentato dal colore come segue: E, verde; 20E, arancione; 20E22P, viola; 3D20E, blu; 3D20E22P, rosa. L'inserto aumenta la scala sull'asse y per mostrare livelli di ecdisone più bassi.
Per indagare se 3D20E22P e 3D20E vengono trasferiti durante l'accoppiamento, abbiamo dissezionato i tratti genitali femminili (LRT) in vari momenti dopo l'accoppiamento. Sebbene l'ecdisone non sia stato trovato nelle femmine vergini, abbiamo osservato quantità sostanziali di 3D20E22P nei tratti genitali femminili immediatamente dopo l'accoppiamento (0,5 ore post-accoppiamento, hpm), che diminuivano nel tempo, mentre i livelli di 3D20E aumentavano significativamente (Fig. 1). Utilizzando 3D20E sintetizzato chimicamente come standard, abbiamo determinato che i livelli di questo ormone steroideo nei tratti genitali femminili dopo l'accoppiamento erano almeno 100 volte superiori a quelli di 20E (Tabella dati estesi 1). Pertanto, 3D20E22P è il principale ecdisone maschile che viene trasferito ai tratti genitali femminili durante l'accoppiamento, e la sua forma defosforilata, 3D20E, diventa molto abbondante poco dopo l'accoppiamento. Ciò suggerisce un ruolo importante per quest'ultimo ecdisone nella biologia femminile post-accoppiamento.
Dopo aver generato un nuovo set di dati di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) (Fig. 2a), utilizzando una pipeline bioinformatica personalizzata, abbiamo cercato l'ecdisone chinasi (EcK), l'ecdisone ossidasi (EO) e il gene della fosfatasi modificata 20E codificante per l'ecdisone. L'EPP) è espresso nei tessuti riproduttivi. Abbiamo identificato un gene EPP candidato e due potenziali geni EcK (EcK1 ed EcK2), ma non siamo stati in grado di trovare un buon gene EO candidato. In particolare, i singoli geni EPP erano espressi ad alti livelli (98,9° percentile) nei MAG gambiani ma non nei LRT femminili (Fig. 2b), contrariamente alle nostre aspettative poiché la defosforilazione di 3D20E22P si è verificata in questo tessuto femminile. Pertanto, crediamo che l'EPP maschile possa essere trasferito durante l'accoppiamento. Infatti, abbiamo utilizzato la marcatura con isotopi stabili in vivo per mascherare la proteina femminile dopo l'accoppiamento, un enzima identificato da MS nell'atrio femminile (Fig. 2c e Tabella supplementare 1). La presenza di EPP nel MAG e nel LRT femminile accoppiato (ma non in quello vergine) è stata confermata anche utilizzando anticorpi specifici (Fig. 2d).
a, Una pipeline bioinformatica personalizzata per ricercare nei tessuti riproduttivi di ciascun sesso i geni che codificano per EcK, EO ed EPP. I numeri accanto alle frecce indicano il numero di candidati maschi e femmine in ogni fase. Questa analisi ha identificato un gene EPP (EPP) e un gene EcK (EcK1) che sono espressi nei maschi, e un gene EcK (EcK2) che è espresso in entrambi i sessi ma non produce un gene EO candidato. b, Mappa di calore che confronta l'espressione dei geni candidati nei tessuti di Anopheles gambiae e Anopheles albicans vergini (V) e in fase di accoppiamento (M). Spca, fecondazione; MAGs, ghiandole accessorie nei maschi; altre parti del corpo, tra cui seni, ali, gambe, corpi grassi e organi interni in entrambi i sessi e ovaie nelle femmine. EcK2 è altamente espresso sia nel MAG che negli atri del Gambia, mentre EPP si trova solo nel MAG. c, Analisi proteomica della traslocazione del gruppo di eiaculato maschile negli atri femminili a 3, 12 e 24 hpm, che mostra le 67 proteine ​​più abbondanti. Le femmine sono state allevate con una dieta contenente 15N per etichettare (e mascherare) tutte le proteine. I maschi non marcati sono stati accoppiati con femmine marcate e i LRT femminili sono stati dissezionati a 3, 12 e 24 hpm per l'analisi proteomica (vedere la Tabella supplementare 1 per un elenco completo delle proteine ​​eiaculatorie). Nell'inserto, EPP, Eck1 ed EcK2 sono stati rilevati nel MAG di maschi vergini mediante analisi proteomica di questi tessuti. d, EPP è stato rilevato mediante western blot nel MAG e nel LRT di femmine accoppiate, ma non nelle femmine vergini, nei maschi o nel resto del corpo femminile. Le membrane sono state analizzate simultaneamente con anticorpi anti-actina (controllo di carico) e anti-EPP. Tutti i maschi sono vergini. Vedere la Figura supplementare 1 per i dati di origine del gel. I Western blot sono stati eseguiti due volte con risultati simili.
L'attività ecdisteroide fosfofosfatasi dell'EPP è stata verificata dopo incubazione mediante HPLC-MS/MS con 3D20E22P isolato da MAG (Figura 2a dei Dati Supplementari). Inoltre, quando abbiamo silenziato l'EPP mediante interferenza mediata da RNA (RNAi), abbiamo rilevato una forte riduzione dell'attività fosfatasica nei tessuti riproduttivi di questi maschi (Figura 3a), e le femmine accoppiate con maschi con EPP silenziato hanno mostrato una proporzione significativamente inferiore di 3D20E defosforilato (Figura 3b) nonostante il silenziamento genico parziale (Figura 2b,c dei Dati Supplementari). Al contrario, non abbiamo rilevato cambiamenti significativi nel rapporto 20E22P/20E nelle stesse zanzare, il che potrebbe suggerire che l'enzima sia specifico per 3D20E22P (Figura 3b).
a, Diminuzione dell'attività fosfatasica nel MAG causata dal silenziamento di EPP utilizzando controlli con RNA EPP a doppio filamento (dsEPP) o RNA GFP a doppio filamento (dsGFP). Venti pool di MAG sono stati utilizzati in ogni replica (P = 0,0046, test t appaiato, a due code), rappresentati da punti separati. b, Le femmine accoppiate con maschi con silenziamento di EPP presentavano una proporzione significativamente inferiore di 3D20E defosforilato a 3 hpm (P = 0,0043, test t non appaiato, a due code), mentre i livelli di 20E non erano influenzati (P ​​= 0,063, non appaiato). test t, a due code). I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM) da tre gruppi di 13, 16 e 19 femmine ciascuno.c, Le femmine accoppiate con maschi con EPP silenziato avevano tassi di riaccoppiamento significativamente più elevati (P ​​= 0,0002, test esatto di Fisher, a due code). Le femmine sono state prima costrette ad accoppiarsi per garantire il loro stato di accoppiamento; 2 giorni dopo, sono stati contattati con altri maschi portatori di sperma transgenico per valutare i tassi di riaccoppiamento mediante rilevamento quantitativo del transgene tramite PCR.d, Le femmine nutrite con sangue e accoppiate con maschi con EPP silenziato hanno avuto una fertilità significativamente ridotta (P < 0,0001; test di Mann-Whitney, a due code) e un numero di uova leggermente ridotto (P = 0,088, test di Mann-Whitney, a due code), mentre il tasso di deposizione delle uova non è stato influenzato (P = 0,94, test esatto di Fisher, a due code).In tutti i pannelli, n rappresenta il numero di campioni di zanzare biologicamente indipendenti.NS, non significativo.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Successivamente, abbiamo valutato se la defosforilazione dell'ecdisone sia importante per indurre resistenza all'accoppiamento nelle femmine. In particolare, le femmine accoppiate con maschi con EPP depleto si sono riaccoppiate con una frequenza molto più alta (44,9%) rispetto alle femmine di controllo (10,4%) quando esposte a maschi aggiuntivi (transgenici) (Fig. 3c). Abbiamo anche osservato una diminuzione significativa della fertilità (Fig. 3d, a sinistra) e una leggera diminuzione del numero di uova deposte da queste femmine (Fig. 3d, al centro), mentre la percentuale di uova deposte dalle femmine (un'altra risposta indotta nelle femmine dall'accoppiamento) non è stata influenzata (Fig. 3d, a destra). Data la specificità osservata dell'EPP per 3D20E22P, questi risultati suggeriscono che l'attivazione di 3D20E da parte dell'EPP trasferito durante l'accoppiamento può avere un ruolo importante nello spegnere la ricettività femminile a ulteriori accoppiamenti, un comportamento precedentemente attribuito al trasferimento sessuale di 20E. Pertanto, questo ormone specifico maschile influenza fortemente anche influisce sulla fertilità femminile.
Successivamente, abbiamo confrontato le attività di 20E e 3D20E in esperimenti di iniezione in vergini sessualmente mature utilizzando 3D20E sintetizzato chimicamente (Fig. 4a-c) e 20E disponibile in commercio. Abbiamo osservato che 3D20E era significativamente più efficace di 20E nel bloccare la sensibilità femminile all'accoppiamento a entrambe le concentrazioni (Fig. 4d). In particolare, metà del livello fisiologico di 3D20E nel LRT (1.066 pg post-iniezione vs. 2.022 pg post-accoppiamento) ha indotto una proporzione di femmine refrattarie che era 20 volte superiore al livello fisiologico di 20E (361 pg post-iniezione) 24 ore dopo l'iniezione alla concentrazione più alta 18 pg post-accoppiamento; Tabella dati estesa 1). Questo risultato è coerente con l'idea che il trasferimento sessuale di 20E non causi periodi refrattari all'accoppiamento e indica inoltre 3D20E come un fattore importante nel garantire la relazione genitore-figlio. 3D20E è risultato anche significativamente più attivo di 20E nei test di deposizione delle uova nelle femmine vergini (Fig. 4e), suggerendo che il normale tasso di deposizione delle uova osservato dopo il silenziamento parziale di EPP fosse dovuto alla presenza di attività residua di 3D20E ancora prodotta da fattori femminili indotti dall'accoppiamento.
(a,b) 3D20E sintetizzato chimicamente da 20E (a) con conversione/efficienza molto elevata (dati presentati come media ± sem da tre reazioni di sintesi indipendenti) (b).c, Lo spettro di massa (metà inferiore) corrisponde esattamente all'ecdisone trovato nella femmina LRT accoppiata (metà superiore).d, Rispetto a 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; test esatto di Fisher, bilaterale) e etanolo al 10% (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; test esatto di Fisher, bilaterale), mentre 20E era significativamente più alto del controllo solo a dosi più elevate (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Test esatto di Fisher, a due code).e, l'iniezione di 3D20E ha indotto tassi di deposizione delle uova significativamente più elevati nelle femmine vergini rispetto ai controlli con etanolo al 10% (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; test esatto di Fisher, a due code), mentre 20E rispetto ai controlli Solo a dosi più elevate (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; test esatto di Fisher, a due code).3D20E ha indotto tassi di deposizione delle uova significativamente più elevati rispetto a 20E a dosi più elevate (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; test esatto di Fisher, a due code).In tutti i pannelli, n rappresenta il numero di campioni di zanzare biologicamente indipendenti.NS, non significativo.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. I dati provengono da tre repliche.
In studi precedenti, abbiamo determinato che il trasferimento sessuale di ormoni steroidei induce l'espressione di MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), un gene riproduttivo femminile che protegge le femmine di A. gambiae dall'infezione da P. falciparum, il parassita della malaria umana più letale. Data l'importanza di MISO per la capacità riproduttiva di Anopheles nelle aree endemiche per la malaria, abbiamo deciso di determinare quale ormone 3D20E o 20E innesca l'espressione di questo gene. Abbiamo scoperto che mentre l'iniezione di 20E induceva specificamente o più potentemente alcuni recettori ormonali nucleari (HR), come HR3 e HR4, e tipici bersagli steroidei a valle, come i geni yolkogenici Vg14, 15, 16, MISO era indotto più fortemente da 3D20E (Fig. 3 dei Dati Estesi). Pertanto, il trasferimento sessuale di questo ormone steroideo androgeno sembra indurre meccanismi che proteggono le femmine da i costi posti dall'infezione parassitaria. Inoltre, 3D20E influenza in modo differenziale entrambe le isoforme del recettore EcR, inducendo EcR-A e reprimendo EcR-B, e innescando più fortemente altri geni che inducono l'accoppiamento, incluso HPX15, che influenza la fertilità femminile. Ciò potrebbe spiegare la significativa infertilità osservata nelle femmine accoppiate con maschi con EPP silenziato (Fig. 3 dei Dati Estesi). Questi dati suggeriscono l'esistenza di percorsi a valle attivati ​​preferenzialmente da due ormoni ecdisone che potrebbero essere alla base della funzione sesso-specifica.
Successivamente, abbiamo testato la funzione dei due geni EcK identificati nella nostra pipeline bioinformatica. Il silenziamento di EcK1 o EcK2 ha comportato una mortalità significativa nei maschi (Figura 4a dei Dati Supplementari), suggerendo che la fosforilazione dell'ecdisone, e quindi la sua inattivazione, sia importante per la sopravvivenza. Poiché EcK2 era espresso a livelli più elevati rispetto a EcK1 ed è stato rilevato nei MAG mediante proteomica (Figura 2b,c e Tabella Supplementare 2), abbiamo convalidato la sua attività di chinasi degli ecdisteroidi incubandolo con 20E, che ha portato alla fosforilazione di 20E22P (Figura 2b dei Dati Supplementari). Utilizzando 3D20E come substrato, non siamo stati in grado di rilevare il prodotto fosforilato 3D20E22P (Figura 4c dei Dati Supplementari), suggerendo che 20E piuttosto che 3D20E potrebbe essere il bersaglio preferito di EcK2.
Secondo la nostra analisi RNA-seq, EcK2 era anche altamente espresso nel LRT delle femmine vergini, dove veniva disattivato dopo l'accoppiamento (Fig. 2b). Abbiamo confermato questi dati e determinato che l'espressione di EcK2 non era influenzata dal pasto di sangue (Fig. 5a dei dati estesi). Estendendo i nostri esperimenti MS iniziali, abbiamo determinato che il picco di 20E22P era strettamente correlato al picco di 20E (22-26 ore dopo il pasto di sangue; Fig. 5b dei dati estesi). Il silenziamento di EcK2 nelle femmine vergini ha portato a un aumento di 3 volte del rapporto relativo di 20E a 20E22P a 26 ore dopo il pasto di sangue (Figure 2c e 5c dei dati estesi), confermando che EcK2 fosforila anche 20E nelle femmine. In particolare, le vergini con deplezione di EcK2 hanno mantenuto la piena ricettività sessuale (Fig. 5d,e dei dati estesi), suggerendo ulteriormente che la produzione femminile di Il 20E non induce periodi refrattari all'accoppiamento. Tuttavia, queste femmine presentavano tassi di deposizione delle uova significativamente aumentati rispetto ai controlli, con oltre il 30% delle vergini che deponevano uova (Figura 5f dei Dati Supplementari). Se le iniezioni di RNA Eck2 a doppio filamento (dsEcK2) venivano eseguite dopo il pasto di sangue, la deposizione delle uova non avveniva, momento in cui il picco di 20E dovuto all'ingestione di sangue era diminuito. Nel complesso, questi risultati supportano un modello secondo cui il 20E prodotto dopo aver succhiato il sangue può indurre la deposizione delle uova, ma solo quando il blocco della deposizione (EcK2 e possibilmente altri fattori) viene disattivato dall'accoppiamento. Né le iniezioni di 20E né quelle di 3D20E inibivano l'espressione di EcK2 nelle vergini (Figura 5g dei Dati Supplementari), suggerendo che altri fattori mediano l'inibizione di questa chinasi. Tuttavia, i livelli di 20E dopo il pasto di sangue non erano sufficienti a indurre disagio durante l'accoppiamento, ma venivano effettivamente attivati ​​da alti titoli di RNA trasferito sessualmente. 3D20E.
I nostri risultati forniscono importanti spunti sui meccanismi che regolano il successo riproduttivo di A. gambiae. È emerso un modello in cui i maschi si sono evoluti per sintetizzare alti titoli di 3D20E, un ecdisone modificato specifico del maschio che assicura la paternità desensibilizzando le femmine a ulteriori accoppiamenti. Allo stesso tempo, questi vettori della malaria hanno anche sviluppato un sistema efficiente per attivare il 3D20E nelle femmine in risposta al trasferimento sessuale dell'EPP specifico del maschio. A nostra conoscenza, questo è il primo esempio di un sistema ormonale steroideo dominato da maschi e femmine che svolge una funzione unica e critica negli insetti. La funzione dell'ecdisone specifica del maschio è stata ipotizzata ma non definitivamente dimostrata. Ad esempio, un'ipotesi ampiamente smentita 18 è che queste funzioni possano essere svolte dal precursore 20E E1. È noto che in Drosophila, la monandria è innescata dal trasferimento sessuale di piccoli peptidi sessuali19,20 che interagiscono con i neuroni che innervano l'apparato riproduttivo femminile tratto attraverso recettori specifici per i peptidi sessuali21,22.Sono necessari ulteriori studi per determinare le cascate di segnalazione a valle controllate da 3D20E nelle femmine di A. gambiae e per determinare se queste cascate possono essere conservate tra zanzare e Drosophila.
Dato l'importante ruolo del 3D20E sulla fertilità e sul comportamento femminile identificato nel nostro studio, i percorsi che portano alla sintesi e all'attivazione del 3D20E offrono nuove opportunità per future strategie di controllo delle zanzare, come la generazione di maschi sterili competitivi nelle strategie di tecnologia degli insetti sterili da utilizzare per il rilascio in natura o per imitare il 3D20E nel gioco delle vergini. La funzione specifica maschile del 3D20E potrebbe essersi evoluta quando A. gambiae e altre specie di Cellia hanno acquisito la capacità di coagulare il loro sperma in tappi di accoppiamento, poiché ciò consente il trasferimento efficiente di un gran numero di ormoni ed enzimi attivatori degli ormoni. A sua volta, l'evoluzione del 3D20E che implementa la monandria fornisce un meccanismo per le femmine (attraverso l'elevata espressione di MISO) per favorire la loro fitness riproduttiva in aree ad alta prevalenza di malaria, che contribuisce indirettamente alla trasmissione del Plasmodium. Dato che è stato dimostrato che il 20E femminile ha effetti profondi sulla sopravvivenza e sulla crescita di P. falciparum nelle zanzare Anopheles femmine,24 sia l'ormone steroideo maschile che quello femminile Le vie di trasmissione sono ormai aspetti chiave delle interazioni tra zanzare e parassiti.
I ceppi G3 di A. gambiae sono stati allevati in condizioni standard per insetti (26-28 °C, 65-80% di umidità relativa, fotoperiodo di 12:12 ore luce/buio). Le larve sono state nutrite con mangime in polvere per pesci (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets e Tetra Pond Sticks in un rapporto di 7:7:2). Le zanzare adulte sono state nutrite ad libitum con una soluzione di destrosio al 10% e settimanalmente con sangue umano (per lo studio dei componenti del sangue). Le zanzare vergini sono state ottenute separando i sessi allo stadio pupale dopo averne esaminato le estremità al microscopio. I maschi portatori del transgene DsRed sono stati descritti in precedenza.
Gli esperimenti di accoppiamento forzato sono stati condotti secondo protocolli precedentemente descritti. Per l'accoppiamento naturale, femmine vergini di 4 giorni sono state tenute in un rapporto di 1:3 con maschi vergini sessualmente maturi per due notti. Per gli esperimenti in cui i maschi sono stati iniettati con dsEPP, la co-gabbie è coincisa con i giorni 3-4 post-iniezione, quando l'attività della fosfatasi era massimamente silenziata (Fig. 2b dei Dati Supplementari).
I tessuti delle zanzare, i cadaveri rimanenti (resto del corpo) o l'intero corpo sono stati sezionati in metanolo al 100% e omogeneizzati con un omogeneizzatore a sfere (sfere di vetro da 2 mm, 2.400 giri/min, 90 sec). Le quantità di tessuto e i volumi di metanolo erano i seguenti: resto del corpo, 50 in 1.000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT femmina, 25–50 80 µl. Il precipitato è stato sottoposto a una seconda estrazione con metanolo con lo stesso volume di metanolo. I detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione. Il metanolo di entrambe le estrazioni è stato combinato e essiccato sotto flusso di azoto, quindi risospeso nei seguenti volumi di metanolo all'80% in acqua: resto del corpo, 50 µl; MAG e LRT femmina, 30 µl.
I campioni sono stati analizzati su uno spettrometro di massa (ID-X, Thermo Fisher) accoppiato a uno strumento LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl di campione sono stati iniettati su una colonna da 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) mantenuta a 25 °C. Le fasi mobili per la LC erano A (acqua, acido formico allo 0,1%) e B (acetonitrile, acido formico allo 0,1%). Il gradiente LC era il seguente: 5% B per 1 minuto, quindi aumentato al 100% B in 11 minuti. Dopo 8 minuti al 100%, riequilibrare la colonna al 5% B per 4 minuti. La velocità di flusso era di 0,3 ml min⁻¹. L'ionizzazione nella sorgente MS è realizzata mediante ionizzazione elettrospray riscaldata in modalità positiva e negativa.
Lo spettrometro di massa misura i dati nell'intervallo m/z da 350 a 680 con una risoluzione di 60.000 in modalità MS completa. I dati MS/MS sono stati acquisiti su [M + H]+ (tutti i target), [M - H2O + H]+ (tutti i target) e [M - H]- (target fosforilati). I dati MS/MS sono stati utilizzati per confermare le proprietà dell'ecdisone dei target per i quali non era disponibile alcuno standard. Per identificare gli ecdisteroidi non target, sono stati analizzati i dati MS/MS per tutti i picchi HPLC con abbondanza relativa >15%. Quantificare utilizzando curve standard create da standard puri (20E, 3D20E) per calcolare le quantità assolute o le diluizioni di un campione specifico (tutti gli altri target) per calcolare la loro equivalenza alle quantità trovate in un maschio. Per 3D20E, la quantificazione è stata eseguita utilizzando la somma dei seguenti addotti: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.I dati sono stati estratti e quantificati utilizzando Tracefinder (versione 4.1).I dati MS/MS sono stati analizzati utilizzando Xcalibur (versione 4.4).Gli spettri MS di E, 20E e 3D20E sono stati confrontati con i rispettivi standard.3D20E22P è stato analizzato mediante derivatizzazione con il reagente di Girard.20E22P è stato analizzato mediante rapporto m/z.
Il composto 3D20E22P è stato purificato da MAG. La purificazione è stata effettuata su scala analitica utilizzando un cromatografo liquido ad altissime prestazioni (Acquity, Waters) con un rivelatore di massa quadrupolare (QDa, Acquity, Waters) nelle stesse condizioni LC dell'analisi HPLC-MS/MS. La raccolta delle frazioni è stata attivata quando è stato rilevato il valore m/z corrispondente al 3D20E22P allo stesso tempo di ritenzione precedentemente determinato. La purezza dei composti estratti è stata quindi verificata mediante HPLC-MS/MS come descritto in precedenza.
L'RNA totale è stato estratto da 10-12 tessuti riproduttivi o altre parti del corpo (senza testa) utilizzando il reagente TRI (Thermo Fisher) seguendo le istruzioni del produttore. L'RNA è stato trattato con TURBO DNase (Thermo Fisher). Il cDNA è stato sintetizzato utilizzando la trascrittasi inversa del virus della leucemia murina di Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) seguendo le istruzioni del produttore. I primer per la PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR; Tabella dati estesa 2) sono stati precedentemente pubblicati24 o progettati utilizzando Primer-BLAST26, con preferenza data a prodotti di dimensioni comprese tra 70 e 150 bp e che coprono le giunzioni esone-esone o i primer della coppia Primer separano gli esoni. I campioni di cDNA da tre a quattro repliche biologiche sono stati diluiti quattro volte in acqua per la RT-qPCR. La quantificazione è stata eseguita in reazioni replicate da 15 µl contenenti 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primer e 5 µl di cDNA diluito. Le reazioni sono state eseguite su un sistema PCR in tempo reale QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) e i dati sono stati raccolti e analizzati utilizzando Design and Analysis (versione 2.4.3). Come dimostrato in questo studio, le quantità relative sono state normalizzate rispetto al gene ribosomiale RpL19 (AGAP004422), la cui espressione non è cambiata significativamente con l'alimentazione di sangue 27 o l'accoppiamento 3.
La qualità dell'RNA è stata verificata utilizzando un Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Le librerie paired-end Illumina sono state preparate ed eseguite presso il Broad Institute del MIT e di Harvard. Le sequenze di lettura sono state allineate al genoma di A. gambiae (ceppo PEST, versione 4.12) utilizzando HISAT2 (versione 2.0.5) con parametri predefiniti. Le letture con punteggi di qualità di mappatura (MAPQ) <30 sono state rimosse utilizzando Samtools (versione 1.3.1). Il numero di letture mappate ai geni è stato contato utilizzando htseq-count (versione 0.9.1) con parametri predefiniti. I conteggi di lettura normalizzati sono stati calcolati e l'espressione genica differenziale è stata analizzata utilizzando il pacchetto DESeq2 (versione 1.28.1) in R (versione 4.0.3).
I geni candidati per la modifica dell'ecdisone sono stati identificati cercando dapprima nel genoma di A. gambiae utilizzando l'algoritmo PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), utilizzando i valori predefiniti Parametri con le seguenti sequenze proteiche di query: da Bombyx mori (numero di accesso NP_001038956.1), Musca domestica (numero di accesso XP_005182020.1, XP_005175332.1 e XP_011294434.1) e Microplitis demolitor (numero di accesso XP_008552646.1 e XP_008552645.1) EcK da B. mori (numero di accesso NP_001036900), Drosophila melanogaster (numero di accesso NP_651202), Apis mellifera (numero di accesso XP_394838) e Acyrthosiphon pisum (numero di accesso XP_001947166); e EPP da B. mori (numero di accesso XP_001947166) NP_001177919.1 e NP_001243996.1) e EO di D. melanogaster (numero di accesso NP_572986.1) (fase 1). Successivamente, filtrare i risultati in base all'elevata espressione di mRNA (>100 frammenti/kilobase esoni per milione di letture mappate (FPKM) o >85%) nel tessuto riproduttivo (LRT o MAG femminile) in Gambia (fase 2). Per migliorare la specificità, abbiamo selezionato enzimi candidati che sono espressi anche nel tessuto riproduttivo di A. albimanus, una specie di anofele che non sintetizza né trasferisce ecdisone durante l'accoppiamento. I geni candidati sono stati filtrati in base alla bassa espressione (<100 FPKM o <85° percentile) nel tessuto riproduttivo di A. albimanus (fase 3). Come filtro finale (fase 4), i geni candidati devono soddisfare almeno uno dei seguenti criteri: (1) essere significativamente sovraregolati dopo l'accoppiamento (P < 0,05) secondo l'analisi dei geni differenzialmente espressi e (2) essere presenti in tessuti non riproduttivi (< 85% o <100 FPKM).
Abbiamo modificato i metodi precedentemente descritti 28,29,30 per ottenere la marcatura isotopica dell'intero organismo. In breve, il Saccharomyces cerevisiae di tipo II (YSC2, Sigma) di tipo selvatico è stato testato in una base di azoto per lievito (BD Difco, DF0335) contenente (p/v) il 2% di glucosio (G7528, Sigma), l'1,7% di solfato di ammonio privo di amminoacidi e di ammonio. terreno di coltura) e il 5% di solfato di ammonio 15N (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) come unica fonte di azoto. Il lievito è stato recuperato mediante centrifugazione e le larve di zanzara sono state alimentate ad libitum fino alla pupazione. Supplemento con farina di pesce (0,5 mg per 300 larve) per prevenire la mortalità del quarto stadio. Solo le femmine sono state quindi utilizzate in esperimenti di accoppiamento con maschi non marcati per analizzare il proteoma maschile trasferito durante l'accoppiamento.
Femmine vergini di 4-6 giorni di età marcate con 15N sono state costrette ad accoppiarsi con maschi vergini non marcati della stessa età. L'accoppiamento riuscito è stato verificato rilevando i tappi di accoppiamento al microscopio a epifluorescenza. A 3, 12 e 24 ore post-accoppiamento, gli atri di 45-55 femmine accoppiate sono stati dissezionati in 50 µl di tampone di bicarbonato di ammonio (pH 7,8) e omogeneizzati con un pestello. L'omogenato è stato centrifugato e il supernatante è stato miscelato con 50 µl di RapiGest allo 0,1% (186001860, Waters) in bicarbonato di ammonio 50 mM. Il supernatante e il pellet di ciascun campione sono stati congelati rapidamente su ghiaccio secco e spediti durante la notte al laboratorio MacCoss dell'Università di Washington, dove è stata completata la preparazione del campione per LC-MS/MS. Risospendere il pellet in 50 µl di 0,1% RapiGest in 50 mM bicarbonato di ammonio e sonicato in un bagno d'acqua. La concentrazione proteica del pellet e del supernatante è stata misurata mediante il saggio BCA, i campioni sono stati ridotti con 5 mM ditiotreitolo (DTT; Sigma), alchilati con 15 mM iodoacetamide (Sigma) e incubati a 37 °C (1:0 50) per 1 ora con tripsinizzazione: rapporto tripsina:substrato). Il RapiGest è stato lisato mediante aggiunta di 200 mM HCl, seguito da incubazione a 37 °C per 45 minuti e centrifugazione a 14.000 rpm per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti. I campioni sono stati lavati mediante estrazione in fase solida a doppia modalità (cartucce Oasis MCX, Waters) e risospesi in acido formico allo 0,1% per una concentrazione proteica finale di 0,33 µg µl-1. I proteomi MAG non marcati sono stati analizzati in modo simile da maschi vergini. Per ogni campione sono state analizzate due repliche analitiche. Successivamente, 1 µg di ciascuno è stato analizzato utilizzando una colonna di silice fusa da 25 cm e 75 μm con una trappola a frit Kasil1 (PQ) in silice fusa da 4 cm impaccata con resina a fase inversa Jupiter C12 (Phenomenex) e cromatografia liquida da 180 minuti. Digestione del campione – MS/MS è stato eseguito su uno spettrometro di massa Q-Exactive HF (Thermo Fisher) con un sistema nanoACQUITY UPLC (Waters). I dati di acquisizione relativi ai dati generati per ogni run sono stati convertiti in formato mzML utilizzando Proteowizard (versione 3.0.20287) e utilizzando Comet31 (versione 3.2) contro il database FASTA contenente sequenze proteiche di Anopheles gambiae (VectorBase versione 54), Anopheles coluzzi. È stata eseguita una ricerca su Mali-NIH (VectorBase versione 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marzo 2021), RNA-seq di A. gambiae e traduzioni a tre frame di contaminanti umani noti. Gli FDR corrispondenti alla mappa dei peptidi sono stati determinati utilizzando Percolator32 (versione 3.05) con una soglia di 0,01 e i peptidi sono stati assemblati in identificazioni proteiche utilizzando la parsimonia proteica in Limelight33 (versione 2.2.0). L'abbondanza proteica relativa è stata stimata utilizzando il fattore di abbondanza spettrale normalizzato (NSAF) calcolato per ciascuna proteina in ogni run come precedentemente descritto. L'NSAF relativo a ciascuna proteina è stato mediato tra i campioni di due diverse repliche biologiche. La marcatura con 15N ha mascherato con successo il proteoma femminile, sebbene una piccola quantità di proteina non marcata potesse essere rilevata dalle vergini marcate. Abbiamo registrato il rilevamento della riduzione proteica maschile (1-5 spettri) nei campioni grezzi femminili solo nelle run tecniche, dove i campioni grezzi sono stati analizzati dopo i campioni maschili/di accoppiamento, a causa del "carry over" dell'HPLC. Le proteine ​​occasionalmente trovate come "contaminanti" dalle vergini marcate sono elencate nella Tabella supplementare 1.
Due peptidi antigenici, QTTDRVAPAPDQQQ (all'interno dell'isotipo PA) e MESDGTTPSGDSEQ (all'interno degli isotipi PA e PB) in Genscript. I due peptidi sono stati combinati, quindi coniugati alla proteina carrier KLH e iniettati in conigli della Nuova Zelanda. I conigli sono stati sacrificati dopo la quarta iniezione e le IgG totali sono state isolate mediante purificazione per affinità. Le IgG del coniglio più specifico per EPP sono state utilizzate per ulteriori analisi Western blot.
Per i western blot, MAG (n = 10, dove n rappresenta il numero di campioni di zanzare biologicamente indipendenti) e LRT femminile (n = 30) da maschi vergini di 4 giorni e femmine vergini o accoppiate forzatamente (<10 post-accoppiamento), tampone di estrazione proteica (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% deossicolato di sodio; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× cocktail di inibitori della proteasi (Roche)) è stato aggiunto separatamente. I campioni sono stati omogeneizzati immediatamente dopo la dissezione con un beader (perline di vetro da 2 mm, 2.400 rpm, 90 sec). I detriti insolubili sono stati rimossi mediante centrifugazione a 20.000 g a 4 °C. Le proteine ​​sono state quantificate mediante saggio di Bradford (Bio-Rad). Quindi, 20 µg di proteina MAG, 40 µg di proteina LRT e 20 µg di proteine ​​residue sono state denaturate e separate mediante NuPAGE Bis-Tris al 10% utilizzando tampone MOPS. Le proteine ​​sono state trasferite su membrane di fluoruro di polivinilidene utilizzando il sistema di trasferimento iBlot2 (Thermo Fisher). Le membrane sono state lavate due volte in 1× PBS-T (0,1% Tween-20 in PBS) e quindi bloccate in tampone di blocco Odyssey (Li-Cor) per 1 ora a 22 °C. Le membrane sono state agitate per una notte a 4 °C con anticorpo primario policlonale di coniglio anti-EPP personalizzato (1:700 in tampone di blocco) e anticorpo primario monoclonale di ratto anti-actina MAC237 (Abeam; 1:4.000). Le membrane sono state lavate con PBS-T e quindi incubate con anticorpi secondari (asino anti-coniglio 800CW e capra anti-ratto 680LT (Li-Cor), entrambi 1:20.000) in tampone di blocco contenente 0,01% SDS e 0,2% Tween-20 per 1 ora a 22 °C. Le membrane sono state lavate con PBS-T e visualizzate con uno scanner Odyssey CLx. Le immagini sono state raccolte ed elaborate in Image Studio (versione 5.2). Non è stata rilevata una banda specifica corrispondente all'isoforma EPP-RA (82 kDa).
Le regioni codificanti di EPP (come isoforma AGAP002463-RB contenente il dominio istidina fosfatasi, ricerca del dominio conservato NCBI 34) e EcK2 (AGAP002181) sono state clonate nel plasmide pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); I primer sono elencati nella Tabella dati estesa 2. Otto linker GS4 (in tandem) sono stati inseriti prima del tag 6xHis C-terminale del costrutto pET-21a(+)-EcK2. Le proteine ​​ricombinanti sono state prodotte utilizzando la reazione di sintesi proteica acellulare di E. coli NEBExpress (New England BioLabs). Le proteine ​​ricombinanti sono state purificate utilizzando colonne di centrifugazione al nichel NEBExpress (New England BioLabs). La proteina di controllo diidrofolato reduttasi (DHFR) è stata prodotta utilizzando il DNA stampo del kit di sintesi proteica acellulare di E. coli NEBExpress. Le proteine ​​sono state conservate in glicerolo al 50% in PBS a -20 °C per un massimo di 3 mesi.
L'attività fosfatasica dell'EPP e degli estratti tissutali è stata misurata utilizzando 4-nitrofenilfosfato (pNPP; Sigma-Aldrich). Il tampone di reazione conteneva 25 mM Tris, 50 mM acido acetico, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA e 1 mM DTT. Il tessuto è stato omogeneizzato nel tampone di reazione e i detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione. La reazione è stata avviata aggiungendo l'enzima o l'estratto tissutale al tampone di reazione contenente 2,5 mg ml-1 di pNPP. La miscela di reazione è stata incubata a temperatura ambiente al buio e la quantità di pNP convertita da pNPP è stata quantificata misurando l'assorbanza a 405 nm a diversi intervalli di tempo.
Per l'attività EcK in vitro, la proteina è stata incubata con 0,2 mg di 20E o 3D20E in 200 µl di tampone (pH 7,5) contenente 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP e 10 mM MgCl2 per 2 ore a 27 °C. La reazione è stata interrotta aggiungendo 800 µl di metanolo, quindi raffreddata a -20 °C per 1 ora, poi centrifugata a 20.000 g per 10 minuti a 4 °C. Il supernatante è stato quindi analizzato mediante HPLC-MS/MS. Per inattivare termicamente le proteine ​​utilizzate nel gruppo di controllo, le proteine ​​sono state incubate in glicerolo al 50% in PBS per 20 minuti a 95 °C.
Per l'attività EPP in vitro, la proteina è stata incubata con 3D20E22P (equivalente alla quantità trovata in 18 coppie di MAG, purificate mediante HPLC-MS/MS) in 100 µl di tampone (pH 7,5) contenente 25 mM Tris, 50 mM acido acetico, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA e 1 mM DTT per 3 ore a 27 °C. La reazione è stata interrotta aggiungendo 400 µl di metanolo e raffreddata a -20 °C per 1 ora, quindi centrifugata a 20.000 g per 10 minuti a 4 °C. Il supernatante è stato analizzato mediante HPLC-MS/MS.
Frammenti di PCR per EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ed EcK2 (556 bp) sono stati amplificati da cDNA preparato da cadaveri di zanzare decapitate di entrambi i sessi. Il frammento di PCR del controllo eGFP (495 bp) è stato amplificato dal pCR2.1-eGFP precedentemente descritto; I primer per la PCR sono elencati nella Tabella dei Dati Supplementari 2. Il frammento di PCR è stato inserito tra i promotori T7 invertiti sul plasmide pL4440. I costrutti plasmidici sono stati recuperati da E. coli competenti NEB 5-α (New England Biolabs) e verificati mediante sequenziamento del DNA prima dell'uso (vedere Dati Supplementari 1 per la sequenza dell'inserto). I primer corrispondenti al promotore T7 (Tabella dei Dati Supplementari 2) sono stati utilizzati per amplificare l'inserto dal plasmide basato su pL4440. La dimensione del prodotto di PCR è stata confermata mediante elettroforesi su gel di agarosio. Il dsRNA è stato trascritto da modelli di PCR utilizzando il kit di trascrizione Megascript T7 (Thermo Fisher) e purificato secondo le istruzioni del produttore con le modifiche precedentemente descritte.
Per l'iniezione di dsRNA, 1.380 ng di dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) sono stati iniettati a una concentrazione di 10 ng nl-1 nel torace di maschi o femmine adulti (Nanoject III, Drummond) entro 1 giorno dopo lo sfarfallamento. I livelli di silenziamento genico sono stati determinati in almeno tre repliche biologiche mediante estrazione di RNA, sintesi di cDNA e RT-qPCR. Per l'iniezione di ecdisone, femmine vergini di 4 giorni o femmine vergini di 6 giorni alimentate con sangue sono state iniettate con 0,13, 0,21 o 0,63 µg di 20E o 3D20E (Nanoject III, Drummond) a concentrazioni rispettivamente di 1,3, 2,1, a seconda del disegno sperimentale o 6,3 ng nl-1. Iniettare 100 nl di soluzione al 10% (vol/vol) etanolo in acqua; 100 nl di 3D20E22P in etanolo al 10% (equivalente al 75% della quantità presente in una coppia di MAG). Le zanzare sono state assegnate in modo casuale al gruppo di iniezione.
Per i test di deposizione delle uova, le femmine di 3 giorni sono state alimentate ad libitum con sangue umano. Le zanzare parzialmente nutrite o non nutrite sono state rimosse. A seconda del trattamento, le femmine sono state collocate in contenitori di deposizione separati per quattro notti, almeno 48 ore dopo il pasto di sangue. Le uova sono state contate al microscopio stereoscopico (Stemi 508, Zeiss); per le femmine accoppiate, le uova che si sono schiuse in larve sono state considerate fertili.
Per le prove di accoppiamento, alle femmine sono stati concessi almeno 2 giorni, a seconda del trattamento, per sviluppare resistenza all'accoppiamento, e successivamente sono stati introdotti nella stessa gabbia maschi selvatici della stessa età. Due notti dopo, le vescicole fecondate delle femmine sono state dissezionate e il DNA genomico è stato rilasciato mediante cicli di congelamento-scongelamento e sonicazione in un tampone contenente 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA e 25 mM NaCl (pH 8,2). I campioni sono stati incubati con Proteinasi K (0,86 µg µl-1) per 15 minuti a 55 °C, seguiti da 10 minuti a 95 °C. Le preparazioni di DNA genomico grezzo sono state diluite 10 volte e sottoposte a rilevamento qPCR delle sequenze del cromosoma Y; i primer sono elencati nella Tabella dati supplementare 2. L'assenza della sequenza del cromosoma Y indica l'assenza di accoppiamento.
Per i test di riaccoppiamento, le femmine accoppiate forzatamente sono state esaminate per la presenza di tappi di accoppiamento per confermare lo stato di accoppiamento e sono stati lasciati 2 giorni per sviluppare refrattarietà all'accoppiamento in assenza di maschi, come precedentemente descritto 36. I maschi portatori di sperma transgenico DsRed sono stati quindi introdotti nelle gabbie delle femmine. Due notti dopo, le vescicole fecondanti sono state dissezionate dalle femmine e il DNA genomico è stato preparato come descritto sopra e sottoposto a rilevamento qPCR del transgene DsRed; i primer sono elencati nella Tabella dati estesa 2. L'assenza del transgene DsRed indicava che non si era verificato alcun riaccoppiamento.
Il 3D20E è stato sintetizzato come precedentemente descritto 37. In breve, 10 mg di 20E (Sigma-Aldrich) sono stati disciolti in 10 ml di acqua, seguiti dall'aggiunta di 30 mg di platino nero (in polvere, Sigma-Aldrich). Un flusso delicato di O2 è stato continuamente fatto gorgogliare nella miscela di reazione, che è stata agitata a temperatura ambiente. Dopo 6 ore, sono stati aggiunti 30 ml di metanolo per arrestare la reazione. La miscela è stata centrifugata per rimuovere le particelle di catalizzatore. Il supernatante è stato evaporato a secchezza sotto vuoto a temperatura ambiente. Il prodotto di reazione essiccato è stato disciolto in etanolo al 10% e metanolo per l'iniezione per l'analisi HPLC-MS/MS. Il tasso di conversione (da 20E a 3D20E) è stato di circa il 97% (Fig. 4b) e lo spettro MS del 3D20E sintetizzato corrispondeva a quello trovato nelle femmine accoppiate (Fig. 4c).
La legenda contiene dettagli specifici sui test statistici eseguiti. GraphPad (versione 9.0) è stato utilizzato per eseguire il test esatto di Fisher, il test di Mantel-Cox e il test t di Student. I test di Cochran-Mantel-Haenszel sono stati eseguiti utilizzando uno script R personalizzato (disponibile all'indirizzo https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). La distribuzione dei dati è stata testata per la normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk con una soglia di significatività di 0,05. Quando i dati non hanno superato il test di normalità, è stato eseguito il test di Mann-Whitney. I dati di sopravvivenza sono stati analizzati utilizzando il test di Mantel-Cox. Il pacchetto DESeq2 (versione 1.28.1) è stato utilizzato per eseguire l'analisi dell'espressione differenziale a livello genico RNA-seq. La barra orizzontale sul grafico rappresenta la mediana. Un valore di significatività di P = 0,05 è stato utilizzato come soglia per tutti i test.
Per maggiori informazioni sul disegno dello studio, si veda l'abstract del Nature Research Report collegato a questo articolo.
I dati proteomici MS sono stati depositati nel consorzio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) tramite il repository partner PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) con l'identificativo del set di dati PXD032157.
Il set di dati RNA-seq è depositato nella Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) con il numero di serie GSE198665.
Ulteriori set di dati generati e/o analizzati nel corso del presente studio possono essere ottenuti dagli autori corrispondenti su richiesta motivata. Questo articolo fornisce i dati di origine.
De Loof, A. Ecdisteroidi: steroidi sessuali degli insetti trascurati? Maschio: scatola nera. Scienza degli insetti. 13, 325–338 (2006).
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