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I granuli Ban-Lan-Gen attenuano la colite cronica recidivante indotta da solfato di sodio destrano nei topi modulando il microbiota intestinale e ripristinando la produzione intestinale di SCFA Derived-GLP-1
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Dipartimento di Farmacia dell'Ospedale dell'Università di Pechino a Shenzhen, Shenzhen, Repubblica Popolare Cinese; 2Facoltà di Farmacia del Centro di Scienze della Salute dell'Università di Shenzhen, Shenzhen, Repubblica Popolare Cinese; 3Centro di Ricerca Tecnologica di Ingegneria dell'Università Medica di Guizhou per lo Sviluppo e l'Applicazione della Medicina Etnica e della Medicina Tradizionale Cinese, Ministero dell'Istruzione, Laboratorio Provinciale Principale di Farmacia di Guizhou, Università Medica di Guizhou, Guiyang, Repubblica Popolare Cinese; 4Dipartimento di Gastroenterologia, Ospedale dell'Università di Pechino a Shenzhen, Shenzhen, Repubblica Popolare Cinese; 5Facoltà di Farmacia, Università Medica di Guizhou, Laboratorio Statale Principale di Funzione e Applicazione delle Piante Medicinali, Guiyang; 6 Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Ospedale dell'Università di Pechino, Shenzhen, Cina [email protected] Shen Xiangchun, Facoltà di Farmacia, Università Medica di Guizhou, Guizhou, Repubblica Popolare Cinese, 550004, Email [email protected] Obiettivo: La terapia basata su GLP-1 è una nuova opzione di trattamento per la malattia infiammatoria intestinale. I granuli Ban-Lan-Gen (BLG) sono una nota formulazione antivirale della medicina tradizionale cinese che mostra una potenziale attività antinfiammatoria nel trattamento di varie condizioni infiammatorie. Tuttavia, il suo effetto antinfiammatorio sulla colite e il suo meccanismo d'azione non sono ancora chiari. METODI: Per stabilire la colite cronica recidivante indotta da destrano sodio solfato (DSS) nei topi. Sono stati eseguiti indici di attività della malattia, marcatori istologici di lesione e livelli di citochine proinfiammatorie per valutare l'effetto protettivo di BLG. Gli effetti di BLG sul microbiota intestinale e sull'intestino sono stati caratterizzati dai livelli sierici di GLP-1 e Gcg del colon, Espressione di GPR41 e GRP43, composizione del microbiota intestinale, livelli di SCFA fecali e rilascio di GLP-1 dalle cellule epiteliali primarie del colon di topo. Produzione di GLP-1 derivata da SCFA. Risultati: il trattamento con BLG ha ridotto significativamente la perdita di peso corporeo, il DAI, l'accorciamento del colon, il danno tissutale del colon e i livelli di citochine proinfiammatorie di TNF-α, IL-1β e IL-6 nel tessuto del colon. Inoltre, il trattamento con BLG può ripristinare significativamente l'espressione di Gcg, GPR41 e GRP43 nel colon e i livelli sierici di GLP-1 nei topi con colite, aumentando i batteri produttori di SCFA come Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001 e riducendo l'abbondanza di batteri come Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas e Oscillibacter. Inoltre, il trattamento con BLG può aumentare significativamente il livello di SCFA nelle feci dei topi con colite. Allo stesso tempo, esperimenti in vitro hanno anche dimostrato che l'estratto fecale di topi trattati con BLG può stimolare notevolmente la secrezione primaria di GLP-1 da parte delle piccole cellule epiteliali del colon murino. Conclusioni: Questi risultati suggeriscono che il BLG ha un effetto anticolite. Il BLG ha il potenziale per essere sviluppato come terapia, almeno in parte modulando il microbiota intestinale e ripristinando la produzione intestinale di GLP-1 derivato dagli SCFA. Farmaci promettenti per la colite cronica recidivante. Parole chiave: colite, granuli Ban-Lan-Gen, microbiota intestinale, acidi grassi a catena corta, GLP-1
La colite ulcerosa (CU) è una malattia infiammatoria cronica del colon e del retto caratterizzata da diarrea ricorrente, dolore addominale, perdita di peso e feci sanguinolente mucopurulente.1 Recentemente, la prevalenza della CU è aumentata in paesi precedentemente a bassa incidenza, tra cui la Cina, con la crescente popolarità degli stili di vita occidentali.2 Questo aumento pone gravi problemi per la salute pubblica e ha gravi implicazioni per la capacità lavorativa e la qualità della vita dei pazienti. In particolare, la patogenesi della CU rimane in gran parte poco chiara, ma è generalmente accettato che la genetica, i fattori ambientali, il microbiota intestinale e il sistema immunitario contribuiscano tutti allo sviluppo della CU.3 Anche ora, non esiste una cura per la CU e l'obiettivo del trattamento è clinicamente quello di controllare i sintomi clinici, indurre e mantenere la remissione, promuovere la guarigione della mucosa e ridurre le recidive. I trattamenti classici includono aminosalicilati, corticosteroidi, immunosoppressori e farmaci biologici. Tuttavia, questi farmaci non possono ottenere l'effetto desiderato a causa di i loro vari effetti collaterali.4 Recentemente, molti studi di casi hanno dimostrato che la medicina tradizionale cinese (MTC) ha mostrato un grande potenziale nell'aiutare ad alleviare la CU con bassa tossicità, suggerendo che lo sviluppo di nuove terapie TCM è una promettente strategia di trattamento per la CU.5-7​​​
I granuli di Banlangen (BLG) sono una preparazione della medicina tradizionale cinese ricavata dall'estratto acquoso della radice di Banlangen.8 Oltre alla sua efficacia antivirale, il BLG mostra una potenziale attività antinfiammatoria nel trattamento di varie condizioni infiammatorie.9,10 Inoltre, i glucosinolati (R,S-goitrina, progoitrina, epiprorubina e glucoside sono stati isolati e identificati da estratti acquosi di Radix isatidis) e nucleosidi (ipoxantina, adenosina, uridina e guanosina) e alcaloidi dell'indaco come l'indaco e l'indirubina.11,12 Studi precedenti hanno ampiamente documentato che i composti adenosina, uridina e indirubina mostrano potenti effetti anticolite in diversi modelli animali di colite.13-17 Tuttavia, non sono stati condotti studi basati sull'evidenza per valutare l'efficacia del BLG nella colite.Nel presente studio, abbiamo studiato l'effetto protettivo del BLG su colite cronica recidivante indotta da destrano sodio solfato (DSS) nei topi C57BL/6 e ha scoperto che la somministrazione orale di BLG attenuava significativamente la colite cronica recidivante indotta da DSS nei topi. L'infiammazione, i suoi meccanismi regolatori sono associati alla modulazione del microbiota intestinale e al ripristino della produzione di peptide-1 simile al glucagone (GLP-1) derivato dall'intestino.
I granuli BLG (senza zucchero, approvati NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Pechino, Cina; numero di lotto: 20110966) sono stati acquistati in farmacia. Il DSS (peso molecolare: 36.000–50.000 Dalton) è stato acquistato da MP Biologicals (Santa Ana, USA). La sulfasalazina (SASP) (purezza ≥ 98%), l'ematossilina e l'eosina sono state acquistate da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). I ​​kit di analisi Elisa luminex per TNF-α, IL-1β e IL-6 nel topo sono stati acquistati da R&D systems (Minneapolis, MN, USA). L'acido acetico, l'acido propionico e l'acido butirrico sono stati acquistati da Aladdin Industries (Shanghai, Cina). L'acido 2-etilbutirrico è stato acquistato da Merck KGaA (Darmstadt, Germania).
Topi maschi C57BL/6 di 6-8 settimane (peso corporeo 18-22 g) sono stati acquistati da Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pechino, Cina) e alloggiati in un ambiente di 22 ± 2 °C con ciclo luce/buio di 12 ore. I topi sono stati alimentati con una dieta standard per roditori con libero accesso all'acqua potabile per una settimana per acclimatarsi al nuovo ambiente. I topi sono stati quindi divisi casualmente in quattro gruppi: gruppo di controllo, gruppo modello DSS, gruppo trattato con SASP (200 mg/kg, orale) e gruppo trattato con BLG (1 g/kg, orale). Come mostrato nella Figura 1A, secondo il nostro studio precedente, la colite cronica recidivante sperimentale è stata indotta nei topi da tre cicli di DSS all'1,8% per 5 giorni, seguiti da acqua distillata per 7 giorni, secondo il nostro studio precedente.18 I topi nei gruppi trattati con SASP e BLG sono stati trattati con SASP e BLG, rispettivamente, ogni giorno a partire dal giorno 0. Secondo esperimenti preliminari, la dose di BLG è stata fissata a 1 g/kg. Nel frattempo, la dose di SASP è stata fissata a 200 mg/Kg secondo la letteratura.4 I gruppi di controllo e del modello DSS hanno ricevuto lo stesso volume di acqua durante l'esperimento.
Figura 1 BLG migliora la colite cronica recidivante indotta da DSS nei topi. (A) Disegno sperimentale della colite cronica ricorrente e trattamento, (B) variazione del peso corporeo, (C) punteggio dell'indice di attività della malattia (DAI), (D) lunghezza del colon, (E) immagine rappresentativa del colon, (F) colorazione H&E del colon (ingrandimento, ×100) e (G) punteggio istologico. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 o ###p < 0,001 rispetto al gruppo di controllo (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 rispetto al gruppo DSS.
Il peso corporeo, la consistenza delle feci e il sanguinamento rettale venivano registrati quotidianamente. L'indice di attività della malattia (DAI) veniva determinato combinando i punteggi del peso corporeo, della consistenza delle feci e del sanguinamento rettale come descritto in precedenza.19 Alla fine dell'esperimento, tutti i topi venivano soppressi e sangue, feci e colon venivano raccolti per ulteriori esperimenti.
Il tessuto del colon è stato fissato in formalina e incluso in paraffina. Sono state realizzate sezioni da 5 micron e colorate con ematossilina-eosina (H&E), quindi analizzate in cieco e valutate come precedentemente descritto.19
L'RNA totale del tessuto del colon è stato estratto con il reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguito dall'estrazione del cDNA con trascrittasi inversa (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Giappone). La PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando un sistema PCR in tempo reale con SYBR Green Master (Roche, Basilea, Svizzera). I trascritti del gene bersaglio sono stati normalizzati alla β-actina e i dati sono stati analizzati utilizzando il metodo 2-ΔΔCT. Le sequenze dei primer genici sono mostrate nella Tabella 1.
L'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali del colon del topo primario sono stati eseguiti come precedentemente descritto.20 In breve, i colon di topi di 6-8 settimane sono stati prima escissi dopo il sacrificio mediante dislocazione cervicale, quindi aperti longitudinalmente, trattati con soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS, senza calcio e magnesio) e tagliati in piccoli pezzi da 0,5-1 mm. Successivamente, i tessuti sono stati digeriti con 0,4 mg/mL di collagenasi XI (Sigma, Poole, Regno Unito) in terreno DMEM libero e centrifugati a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in terreno DMEM (supplementato con siero bovino fetale al 10%, 100 unità/mL di penicillina e 100 µg/mL di streptomicina) a 37 °C e passare attraverso una rete di nylon (dimensione dei pori ~250 µm). Aliquote di cellule epiteliali del colon sono state poste in piastre con fondo di vetro e incubate con acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed estratti fecali di topo per 2 ore a 37°C, 5% di CO2.
Il tessuto del colon è stato omogeneizzato con PBS e i livelli di citochine IL-6, TNF-α e IL-1β nel tessuto del colon sono stati rilevati utilizzando i kit di analisi ELISA Luminex (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Allo stesso modo, i livelli di GLP-1 nel siero e nel terreno di coltura delle cellule epiteliali primarie del colon murino sono stati determinati con un kit ELISA (Bioswamp, Wuhan, Cina) secondo le istruzioni del produttore.
Il DNA totale dalle feci è stato estratto utilizzando un kit di estrazione del DNA (Tiangen, Cina). La qualità e la quantità del DNA sono state misurate rispettivamente nei rapporti di 260 nm/280 nm e 260 nm/230 nm. Successivamente, utilizzando ciascun DNA estratto come stampo, sono stati utilizzati i primer specifici 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) e 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) per amplificare le regioni V3-V4 del gene 16S rRNA in diverse regioni. I prodotti PCR sono stati purificati utilizzando il kit di estrazione del gel QIAquick (QIAGEN, Germania), quantificati mediante PCR in tempo reale e sequenziati utilizzando la piattaforma di sequenziamento IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, USA). Per l'analisi bioinformatica, l'elaborazione dei dati è stata eseguita seguendo i protocolli precedentemente riportati.21,22 In breve, utilizzare Cutadapt (V1.9.1) per filtrare l'espressione grezza file. Gli OTU sono stati raggruppati utilizzando UPARSE (versione 7.0.1001) con un limite di similarità del 97%, e UCHIME è stato utilizzato per rimuovere le sequenze chimeriche. L'analisi della composizione della comunità e la classificazione sono state eseguite utilizzando il classificatore RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) basato sul database dei geni dell'RNA ribosomiale SILVA.
I livelli di acidi grassi a catena corta (acido acetico, acido propionico e acido butirrico) sono stati misurati come precedentemente descritto da Tao et al., con alcune modifiche.23 In breve, 100 mg di feci sono stati prima sospesi in 0,4 mL di acqua deionizzata, seguiti da 0,1 mL di acido solforico al 50% e 0,5 mL di acido 2-etilbutirrico (standard interno), quindi omogeneizzati e riscaldati a 4°C. Centrifugare a 12.000 giri/min per 15 minuti a C. Il surnatante è stato estratto con 0,5 mL di etere e iniettato nel GC per l'analisi. Per l'analisi gascromatografica (GC), i campioni sono stati analizzati utilizzando un gascromatografo GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) dotato di un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID). La separazione è stata ottenuta utilizzando una colonna ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Cina). I dati sono stati acquisiti utilizzando il software di soluzione GC (Shimadzu, Inc.). Il rapporto di splittaggio era 10:1, il gas di trasporto era azoto e la portata era di 6 mL/min. Il volume di iniezione era di 1 μL. La temperatura dell'iniettore e del rivelatore era di 300 °C. La temperatura del forno è stata mantenuta a 140 °C per 13,5 minuti, quindi aumentata a 250°C a una velocità di 120°C/min; la temperatura è stata mantenuta per 5 minuti.
I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). La significatività dei dati è stata valutata mediante ANOVA a un fattore seguita dal test di Duncan a intervalli multipli. Per tutti i calcoli è stato utilizzato il software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) e p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
È noto che la CU è una malattia colite cronica recidivante con forte dolore addominale, diarrea e sanguinamento. Pertanto, è stata stabilita la colite cronica recidivante indotta da DSS nei topi per valutare l'efficacia anticolite di BLG (Fig. 1A). Rispetto al gruppo di controllo, i topi nel gruppo modello DSS avevano un peso corporeo significativamente ridotto e un DAI più elevato, e questi cambiamenti sono stati significativamente invertiti dopo 24 giorni di trattamento con BLG (Figura 1B e C). L'accorciamento del colon è un importante segno distintivo della CU. Come mostrato nelle Figure 1D ed E, la lunghezza del colon dei topi che hanno ricevuto DSS è stata significativamente accorciata, ma è stata alleviata dal trattamento con BLG. Successivamente, è stata eseguita un'analisi istopatologica per valutare l'infiammazione del colon. Le immagini colorate con H&E e i punteggi patologici hanno mostrato che la somministrazione di DSS ha interrotto significativamente l'architettura del colon e ha portato alla distruzione delle cripte, mentre il trattamento con BLG ha ridotto significativamente la distruzione delle cripte e i punteggi patologici (Figura 1F e G). In particolare, L'effetto protettivo del BLG a una dose di 1 g/Kg è stato paragonabile a quello del SASP a una dose di 200 mg/Kg. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che il BLG è efficace nel ridurre la gravità della colite cronica recidivante indotta da DSS nei topi.
TNF-α, IL-1β e IL-6 sono importanti marcatori infiammatori dell'infiammazione del colon. Come mostrato nella Figura 2A, il DSS ha indotto un aumento significativo nell'espressione genica di TNF-α, IL-1β e IL-6 nel colon rispetto al gruppo di controllo. La somministrazione di BLG può invertire significativamente questi cambiamenti mediati dal DSS. Successivamente, abbiamo utilizzato ELISA per determinare i livelli delle citochine infiammatorie TNF-α, IL-1β e IL-6 nel tessuto del colon. I risultati hanno anche mostrato che i livelli colici di TNF-α, IL-1β e IL-6 erano significativamente aumentati nei topi trattati con DSS, mentre il trattamento con BLG ha alleviato questi aumenti (Figura 2B).
Figura 2 BLG inibisce l'espressione genica e la produzione delle citochine proinfiammatorie TNF-α, IL-1β e IL-6 nel colon dei topi trattati con DSS. (A) Espressione genica del colon di TNF-α, IL-1β e IL-6; (B) livelli proteici del colon di TNF-α, IL-1β e IL-6. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 o ###p < 0,001 rispetto al gruppo di controllo (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 rispetto al gruppo DSS.
La disbiosi intestinale è fondamentale nella patogenesi della CU.24 Per indagare se BLG modula il microbiota intestinale dei topi trattati con DSS, è stato eseguito il sequenziamento dell'rRNA 16S per analizzare la comunità batterica del contenuto intestinale. Il diagramma di Venn mostra che i tre gruppi condividono 385 OTU. Allo stesso tempo, ogni gruppo aveva OTU uniche (Fig. 3A). Inoltre, l'indice Chao1 e l'indice di Shannon mostrati nelle Figure 3B e C hanno mostrato che la diversità della comunità del microbiota intestinale era ridotta nei topi trattati con BLG, poiché l'indice di Shannon era significativamente diminuito nel gruppo trattato con BLG. L'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi delle coordinate principali (PCoA) sono state utilizzate per determinare i modelli di clustering tra i tre gruppi e hanno mostrato che la struttura della comunità dei topi trattati con DSS era chiaramente separata dopo il trattamento con BLG (Figura 3D ed E). Questi dati suggeriscono che il trattamento con BLG ha influenzato significativamente la struttura della comunità dei topi con colite indotta da DSS.
Figura 3 BLG altera la diversità del microbiota intestinale nei topi con colite indotta da DSS. (A) Diagramma di Venn di OTU, (B) Indice Chao1, (C) Indice di ricchezza di Shannon, (D) Grafico del punteggio dell'analisi delle componenti principali (PCA) di OTU, (E) Punteggio dell'analisi delle coordinate principali (PCoA) di OTU Figura. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 6).**p < 0,01 rispetto al gruppo DSS.
Per valutare cambiamenti specifici nel microbiota fecale, abbiamo analizzato la composizione del microbiota intestinale a tutti i livelli tassonomici. Come mostrato nella Figura 4A, i principali phyla in tutti i gruppi erano Firmicutes e Bacteroidetes, seguiti da Verrucomicrobia. Le abbondanze relative di Firmicutes e dei rapporti Firmicutes/Bacteroidetes erano significativamente aumentate nelle comunità microbiche fecali dei topi trattati con DSS rispetto ai topi di controllo e questi cambiamenti erano significativamente invertiti dopo il trattamento con BLG. In particolare, il trattamento con BLG ha aumentato significativamente l'abbondanza relativa di Verrucobacterium nelle feci dei topi con colite indotta da DSS. A livello domestico, le comunità microbiche fecali erano occupate da Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae e Prevotellaceae (Fig. 4B). Rispetto al gruppo DSS, l'esaurimento di BLG ha aumentato l'abbondanza di Akkermansiaceae, ma ha diminuito l'abbondanza di Lachnospiraceae e Ruminococcaceae. In particolare, a livello di genere, il microbiota fecale era occupato da Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Questa scoperta ha anche dimostrato che il trattamento con BLG ha invertito efficacemente lo squilibrio del microbiota in risposta alla sfida DSS, caratterizzato da una diminuzione di Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas e Oscillibacter e da un aumento di Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001.
Figura 4 BLG altera l'abbondanza del microbiota intestinale nei topi con colite indotta da DSS. (A) Abbondanza del microbiota intestinale a livello di phylum; (B) Abbondanza del microbiota intestinale a livello di famiglia; (C) Abbondanza del microbiota intestinale a livello di genere. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ###p < 0,001 rispetto al gruppo di controllo (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 rispetto al gruppo DSS.
Considerando che gli acidi grassi a catena corta (SCFA) sono i principali metaboliti di Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001, mentre acetato, propionato e butirrato sono gli SCFA più abbondanti nel lume intestinale, 25-27 siamo ancora nel nostro studio. Come mostrato nella Figura 5, le concentrazioni fecali di acetato, propionato e butirrato sono state significativamente ridotte nel gruppo trattato con DSS, mentre il trattamento con BLG potrebbe in gran parte sopprimere questa riduzione.
Figura 5. Il BLG aumenta i livelli di SCFA nelle feci dei topi con colite indotta da DSS. (A) Contenuto di acido acetico nelle feci; (B) contenuto di acido propionico nelle feci; (C) contenuto di acido butirrico nelle feci. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 rispetto al gruppo DSS.
Abbiamo inoltre calcolato il coefficiente di correlazione di Pearson tra SCFA differenziali a livello di genere e microbiota fecale. Come mostrato nella Figura 6, Akkermansia era correlata positivamente con la produzione di acido propionico (Pearson = 0,4866) e acido butirrico (Pearson = 0,6192). Al contrario, sia Enteromonas che Oscillobacter erano associati negativamente alla produzione di acetato, con coefficienti di Pearson rispettivamente di 0,4709 e 0,5104. Allo stesso modo, Ruminococcaceae_UCG-014 era correlato negativamente con la produzione di acido propionico (Pearson = 0,4508) e acido butirrico (Pearson = 0,5842), rispettivamente.
Figura 6 Analisi di correlazione di Pearson tra SCFA differenziali e microbi del colon. (A) Enteromonas con acido acetico; (B) Bacillo della commozione cerebrale con acido acetico; (C) Akkermansia vs acido propionico; (D) Ruminococcus_UCG-014 con acido propionico; (E) Akkermansia con acido butirrico; (F) Ruminococcus _UCG-014 con acido butirrico.
Il peptide-1 simile al glucagone (GLP-1) è un prodotto post-traduzionale specifico del tipo cellulare del proglucagone (Gcg) con proprietà antinfiammatorie.28 Come mostrato nella Figura 7, il DSS ha indotto una significativa diminuzione nell'espressione dell'mRNA di Gcg. Il trattamento con colon e BLG potrebbe invertire significativamente la riduzione di Gcg indotta dal DSS rispetto al gruppo di controllo (Fig. 7A). Allo stesso tempo, il livello di GLP-1 nel siero è stato significativamente ridotto nel gruppo trattato con DSS e il trattamento con BLG potrebbe prevenire in gran parte questa riduzione (Fig. 7B). Poiché gli acidi grassi a catena corta possono stimolare la secrezione di GLP-1 attraverso l'attivazione del recettore accoppiato a proteine ​​G 43 (GRP43) e del recettore accoppiato a proteine ​​G 41 (GRP41), abbiamo anche esaminato GPR41 e GRP43 nel colon dei topi con colite e abbiamo scoperto che l'espressione dell'mRNA del colon di GRP43 e GPR41 era significativamente diminuita dopo la sfida con DSS, e il trattamento BLG potrebbe effettivamente rimediare a queste diminuzioni (Figura 7C e D).
Figura 7 BLG aumenta i livelli sierici di GLP-1 e l'espressione di mRNA di Gcg, GPR41 e GRP43 nel colon nei topi trattati con DSS. (A) Espressione di mRNA di Gcg nel tessuto del colon; (B) Livello di GLP-1 nel siero; (C) Espressione di mRNA di GPR41 nel tessuto del colon; (D) Espressione di mRNA di GPR43 nel tessuto del colon. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo (Con); *p < 0,05 rispetto al gruppo DSS.
Poiché il trattamento con BLG potrebbe aumentare i livelli sierici di GLP-1, l'espressione di mRNA di Gcg nel colon e i livelli di SCFA fecali nei topi trattati con DSS, abbiamo ulteriormente esaminato l'acetato, il propionato e il butirrato, nonché dai topi di controllo (F-Con), dalla colite DSS (F-Con) -DSS) e dalla colite trattata con BLG (F-BLG) sul rilascio di GLP-1 dalle cellule epiteliali primarie del colon murino. Come mostrato nella Figura 8A, le cellule epiteliali primarie del colon del topo trattate rispettivamente con 2 mM di acido acetico, acido propionico e acido butirrico, hanno stimolato significativamente il rilascio di GLP-1, in linea con studi precedenti.29,30 Allo stesso modo, tutti gli F-Con, F-DSS e F-BLG (equivalenti a 0,25 g di feci) hanno stimolato notevolmente il rilascio di GLP-1 dalle cellule epiteliali primarie del colon murino. In particolare, la quantità di GLP-1 rilasciata da Le cellule epiteliali primarie del colon di topo trattate con F-DSS erano molto più basse rispetto a quelle delle cellule epiteliali primarie del colon di topo trattate con F-Con e F-BLG. (Figura 8B). Questi dati suggeriscono che il trattamento con BLG ha ripristinato significativamente la produzione intestinale di GLP-1 derivata da SCFA.
Figura 8 L'SCFA derivato da BLG stimola il rilascio di GLP-1 dalle cellule epiteliali primarie del colon murino. (A) L'acido acetico, l'acido propionico e l'acido butirrico hanno stimolato il rilascio di GLP-1 dalle cellule epiteliali primarie del colon murino; (B) gli estratti fecali F-Con, F-DSS e F-BLG hanno stimolato le cellule epiteliali primarie del colon murino Quantità di GLP-1 rilasciata. Aliquote di cellule epiteliali del colon sono state poste in piastre di Petri con fondo di vetro e trattate con 2 mM di acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed estratti fecali F-Con, F-DSS e F-BLG (equivalenti a 0,25 g di feci), rispettivamente. 2 ore a 37°C, 5% di CO2, rispettivamente. La quantità di GLP-1 rilasciata dalle cellule epiteliali primarie del colon murino è stata rilevata tramite ELISA. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 3).#p < 0,05 o ##p < 0,01 rispetto a bianco o F-Con; *p < 0,05 rispetto a F-DSS.
Abbreviazioni: Ace, acido acetico; Pro, acido propionico; tuttavia, acido butirrico; F-Con, estratto fecale da topi di controllo; F-DSS, estratto fecale da topi con colite; F-BLG, da colon trattato con BLG Estratti fecali di topi infiammatori.
Considerata dall'Organizzazione Mondiale della Sanità una malattia refrattaria, la CU sta diventando un pericolo globale; Tuttavia, i metodi efficaci per prevedere, prevenire e curare la malattia sono ancora limitati. Pertanto, vi è un urgente bisogno di esplorare e sviluppare nuove strategie terapeutiche sicure ed efficaci per la colite ulcerosa. I preparati della medicina tradizionale cinese rappresentano un'opzione promettente perché molti preparati della medicina tradizionale cinese hanno dimostrato di essere efficaci nel trattamento della colite ulcerosa nella popolazione cinese nel corso dei secoli e sono tutti composti organici biologici e materiali naturali che sono per lo più innocui per gli esseri umani e gli animali.31,32 Questo studio mirava a cercare un preparato della medicina tradizionale cinese sicuro ed efficace per il trattamento della colite ulcerosa e ad esplorare il suo meccanismo d'azione. Il BLG è una nota formula a base di erbe cinesi utilizzata per curare l'influenza.8,33 Il lavoro nel nostro laboratorio e in altri ha dimostrato che l'indaco, un prodotto della medicina tradizionale cinese elaborato dalla stessa materia prima del BLG, mostra un'efficacia significativa nel trattamento della colite ulcerosa negli esseri umani e negli animali.4,34 Tuttavia, gli effetti anti-colite del BLG e i suoi effetti Il meccanismo non è chiaro. Nello studio attuale, i nostri risultati dimostrano che il BLG attenua efficacemente la colite indotta da DSS infiammazione, che è associata alla modulazione del microbiota intestinale e al ripristino della produzione di GLP-1 derivata dall'intestino.
È noto che la CU è caratterizzata da periodi di recidiva con caratteristiche cliniche tipiche, come perdita di peso, diarrea, sanguinamento rettale e danno esteso alla mucosa del colon.35 Pertanto, la colite cronica recidivante è stata somministrata somministrando tre cicli di DSS all'1,8% per cinque giorni, seguiti da sette giorni di acqua potabile. Come mostrato nella Figura 1B, la perdita di peso fluttuante e i punteggi DAI hanno indicato un'induzione riuscita della colite cronica recidivante. I topi nel gruppo trattato con BLG hanno mostrato un recupero di upshift dal giorno 8, che era significativamente diverso dal giorno 24. Gli stessi cambiamenti sono stati osservati anche nel punteggio DAI, suggerendo un miglioramento nel miglioramento clinico della colite. In termini di danno al colon e stato infiammatorio, la lunghezza del colon, il danno al tessuto del colon e l'espressione genica e la produzione delle citochine proinfiammatorie TNF-α, IL-1β e IL-6 nel tessuto del colon sono stati notevolmente migliorati anche dopo il trattamento con BLG. Collettivamente, questi risultati dimostrano chiaramente che BLG è efficace nel trattamento di colite cronica recidivante nei topi.
In che modo BLG esercita i suoi effetti farmacologici? Numerosi studi precedenti hanno dimostrato che il microbiota intestinale svolge un ruolo chiave nella patogenesi della colite ulcerosa e le terapie basate sul microbioma e mirate al microbioma sono emerse come una strategia molto interessante per il trattamento della colite ulcerosa. Nel presente studio, abbiamo dimostrato che il trattamento con BLG ha portato a cambiamenti significativi nella composizione del microbiota intestinale, suggerendo che l'effetto protettivo di BLG contro la colite indotta da DSS è correlato alla modulazione del microbiota intestinale. Questa osservazione è coerente con l'idea che la riprogrammazione dell'omeostasi del microbiota intestinale sia un approccio importante per comprendere l'efficacia dei preparati di medicina tradizionale cinese.36,37 In particolare, Akkermansia è un batterio Gram-negativo e strettamente anaerobico che vive nello strato di muco dell'intestino, che degrada le mucine, produce acido propionico, stimola la differenziazione delle cellule caliciformi e mantiene la mucosa. funzione dell'integrità della barriera.26 Numerosi dati clinici e sugli animali suggeriscono che l'Akkermansia è altamente associata alla salute della mucosa,38 e alla somministrazione orale di Akkermansia spp. può migliorare significativamente l'infiammazione della mucosa.39 I nostri dati attuali suggeriscono che l'abbondanza relativa di Akkermansia è significativamente aumentata dopo il trattamento con BLG. Inoltre, Prevotellaceae_UCG-001 è un batterio produttore di SCFA.27 Numerosi studi hanno dimostrato che Prevotellaceae_UCG-001 è stato trovato in bassa abbondanza relativa nelle feci di animali con colite.40,41 I nostri dati attuali mostrano anche che il trattamento con BLG può aumentare significativamente l'abbondanza relativa di Prevotellaceae_UCG-001 nel colon dei topi trattati con DSS. Al contrario, Oscillibacter è un batterio mesofilo, strettamente anaerobico.42 hanno riportato che l'abbondanza relativa di Oscillibacter era significativamente aumentata nei topi UC ed era significativamente correlata positivamente con i livelli di IL-6 e IL-1β e i punteggi patologici.43,44 In particolare, il trattamento con BLG ha ridotto significativamente l'abbondanza relativa di Oscillibacter nelle feci dei topi trattati con DSS. In particolare, questi I batteri alterati da BLG erano i batteri che producevano più SCFA. Numerosi studi precedenti hanno dimostrato i potenziali effetti benefici degli SCFA sull'infiammazione del colon e sulla protezione dell'integrità epiteliale intestinale.45,46 I nostri dati attuali hanno anche osservato che le concentrazioni di acetato, propionato e butirrato di SCFA nelle feci trattate con DSS erano notevolmente aumentate nei topi trattati con BLG. Nel complesso, questi risultati dimostrano chiaramente che il trattamento con BLG può migliorare efficacemente i batteri produttori di SCFA indotti da DSS nei topi con colite cronica recidivante.
Il GLP-1 è un'incretina prodotta principalmente nell'ileo e nel colon e svolge un ruolo importante nel ritardare lo svuotamento gastrico e nell'abbassare la glicemia postprandiale.47 Le prove suggeriscono che la dipeptidil peptidasi (DPP)-4, un agonista del recettore del GLP-1 e una nanomedicina del GLP-1 possono alleviare efficacemente l'infiammazione intestinale nei topi.48-51 Come riportato in studi precedenti, elevate concentrazioni di SCFA sono state associate a livelli plasmatici di GLP-1 negli esseri umani e nei topi.52 I nostri dati attuali mostrano che dopo il trattamento con BLG, i livelli sierici di GLP-1 e l'espressione di mRNA di Gcg sono aumentati significativamente. Allo stesso modo, la secrezione di GLP-1 è aumentata significativamente nelle colture del colon in seguito alla stimolazione con estratti fecali di topi con colite trattati con BLG rispetto alla stimolazione con estratti fecali di topi con colite trattati con DSS.In che modo gli SCFA influenzano il rilascio di GLP-1?Gwen Tolhurst et al. è stato riferito che gli SCFA possono stimolare la secrezione di GLP-1 attraverso GRP43 e GPR41.29 I nostri dati attuali mostrano anche che il trattamento con BLG aumenta significativamente l'espressione di mRNA di GRP43 e GPR41 nel colon dei topi trattati con DSS. Questi dati suggeriscono che il trattamento con BLG può ripristinare la produzione di GLP-1 promossa dagli SCFA attivando GRP43 e GPR41.
In Cina il BLG è un farmaco da banco (OTC) a lungo termine. La dose massima tollerata di BLG nei topi Kunming è di 80 g/Kg e non è stata osservata alcuna tossicità acuta.53 Attualmente, la dose raccomandata di BLG (senza zucchero) negli esseri umani è di 9-15 g/giorno (3 volte al giorno). Il nostro studio ha dimostrato che BLG a 1 g/Kg ha migliorato la colite cronica recidivante indotta da DSS nei topi. Questa dose è vicina alla dose di BLG utilizzata clinicamente. Il nostro studio ha anche scoperto che il suo meccanismo d'azione è mediato, almeno in parte, da alterazioni nel microbiota intestinale, in particolare nei batteri produttori di SCFA, come Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001, per ripristinare la produzione di GLP-1 derivata dall'intestino. Questi risultati suggeriscono che BLG merita ulteriore considerazione come potenziale agente terapeutico per il trattamento clinico della colite. Tuttavia, l'esatto meccanismo con cui modula il microbiota intestinale deve ancora essere confermato da topi con deficit di microbiota e trapianto di batteri fecali.
Ace, acido acetico; but, acido butirrico; BLG, pandano; DSS, destrano solfato di sodio; DAI, indice di attività della malattia; DPP, dipeptidil peptidasi; FID, rilevatore a ionizzazione di fiamma; F-Con, controllo Estratti fecali di topi; F-DSS, estratti fecali di topi con colite DSS; F-BLG, estratti fecali di topi con colite trattati con BLG; GLP-1, peptide-1 simile al glucagone; Gcg, glucagone; gascromatografia, gascromatografia; GRP43, recettore accoppiato a proteine ​​G 43; GRP41, recettore accoppiato a proteine ​​G 41; H&E, ematossilina-eosina; HBSS, soluzione salina bilanciata di Hanks; OTC, OTC; PCA, analisi dei componenti principali; PCoA, analisi delle coordinate principali; Pro, acido propionico; SASP, sulfasalazina; SCFA, acidi grassi a catena corta; medicina cinese, medicina tradizionale cinese; CU, colite ulcerosa.
Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato etico per gli animali del Centro medico scientifico e tecnologico dell'Università di Pechino, Shenzhen-Hong Kong (Shenzhen, Cina) secondo le linee guida istituzionali e i regolamenti sugli animali (numero etico A2020157).
Tutti gli autori hanno apportato contributi significativi alla concezione e alla progettazione, all'acquisizione dei dati o all'analisi e all'interpretazione dei dati; hanno partecipato alla stesura dell'articolo o alla revisione critica di importanti contenuti intellettuali; hanno accettato di inviare il manoscritto alla rivista corrente; hanno infine approvato la versione per la pubblicazione; sono responsabili di tutti gli aspetti del lavoro.
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (81560676 e 81660479), dal progetto di prima classe dell'Università di Shenzhen (86000000210), dal Fondo del Comitato per l'innovazione scientifica e tecnologica di Shenzhen (JCYJ20210324093810026) e dal Fondo per la ricerca scientifica e tecnologica medica della provincia del Guangdong (A2020157 e A2020272), dalla Farmacia dell'Università medica di Guizhou, provincia di Guizhou, finanziata dal Laboratorio chiave (YWZJ2020-01) e dall'Ospedale universitario di Pechino a Shenzhen (JCYJ2018009).
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