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I granuli di Ban-Lan-Gen attenuano la colite cronica recidivante indotta da destrano solfato di sodio nei topi modulando il microbiota intestinale e ripristinando la produzione intestinale di GLP-1 derivato da SCFA.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Dipartimento di Farmacia dell'Ospedale dell'Università di Pechino di Shenzhen, Shenzhen, Repubblica Popolare Cinese; 2Facoltà di Farmacia del Centro di Scienze della Salute dell'Università di Shenzhen, Shenzhen, Repubblica Popolare Cinese; 3Centro di Ricerca di Ingegneria Tecnologica per lo Sviluppo e l'Applicazione della Medicina Etnica e della Medicina Tradizionale Cinese dell'Università Medica di Guizhou, Ministero dell'Istruzione, Laboratorio Provinciale Chiave di Farmacia di Guizhou, Università Medica di Guizhou, Guiyang, Repubblica Popolare Cinese; 4Dipartimento di Gastroenterologia, Ospedale dell'Università di Pechino di Shenzhen, Shenzhen, Repubblica Popolare Cinese; 5Facoltà di Farmacia, Università Medica di Guizhou, Laboratorio Statale Chiave per la Funzione e l'Applicazione delle Piante Medicinali, Guiyang; 6 Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Ospedale dell'Università di Pechino di Shenzhen, Shenzhen, Cina [email protected] Shen Xiangchun, Scuola di Farmacia, Università Medica di Guizhou, Guizhou, Repubblica Popolare Cinese, 550004, Email [email protected] Obiettivo: la terapia basata su GLP-1 è una nuova opzione di trattamento per le malattie infiammatorie intestinali. I granuli di Ban-Lan-Gen (BLG) sono una nota formulazione antivirale della MTC che mostra una potenziale attività antinfiammatoria nel trattamento di varie condizioni infiammatorie. Tuttavia, il suo effetto antinfiammatorio sulla colite e il suo meccanismo d'azione non sono ancora chiari. METODI: Stabilire una colite cronica recidivante indotta da destrano solfato di sodio (DSS) nei topi. Sono stati eseguiti indici di attività della malattia, marcatori istologici di danno e livelli di citochine proinfiammatorie per valutare l'effetto protettivo del BLG. Gli effetti del BLG sul microbiota intestinale e sull'intestino sono stati caratterizzati dai livelli sierici di GLP-1 e Gcg del colon, GPR41, e l'espressione di GRP43, la composizione del microbiota intestinale, i livelli di SCFA fecali e il rilascio di GLP-1 dalle cellule epiteliali del colon di topo primarie Produzione di GLP-1 derivato da SCFA. Risultati: il trattamento con BLG ha ridotto significativamente la perdita di peso corporeo, il DAI, l'accorciamento del colon, il danno al tessuto del colon e i livelli di citochine proinfiammatorie TNF-α, IL-1β e IL-6 nel tessuto del colon. Inoltre, il trattamento con BLG può ripristinare significativamente l'espressione di Gcg, GPR41 e GRP43 nel colon e i livelli sierici di GLP-1 nei topi con colite, aumentando i batteri produttori di SCFA come Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001 e riducendo l'abbondanza di batteri come Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas e Oscillibacter. Inoltre, il trattamento con BLG può aumentare significativamente il livello di SCFA nelle feci dei topi con colite. Allo stesso tempo, esperimenti in vitro hanno anche dimostrato che l'estratto fecale di topi trattati con BLG può stimolare notevolmente la secrezione di GLP-1 da parte delle cellule epiteliali del colon murino primario. Conclusioni: Questi risultati suggeriscono che il BLG ha un effetto anticolite. Il BLG ha il potenziale per essere sviluppato come terapia, almeno in parte modulando il microbiota intestinale e ripristinando la produzione intestinale di GLP-1 derivato dagli SCFA. Farmaci promettenti per la colite cronica recidivante. Parole chiave: colite, granuli di Ban-Lan-Gen, microbiota intestinale, acidi grassi a catena corta, GLP-1
La colite ulcerosa (CU) è una malattia infiammatoria cronica del colon e del retto caratterizzata da diarrea ricorrente, dolore addominale, perdita di peso e feci mucopurulente e sanguinolente.¹ Recentemente, la prevalenza della CU è aumentata anche in paesi con bassa incidenza, tra cui la Cina, a causa della crescente diffusione degli stili di vita occidentali.² Questo aumento pone gravi problemi di salute pubblica e ha serie implicazioni per la capacità lavorativa e la qualità della vita dei pazienti. In particolare, la patogenesi della CU rimane in gran parte sconosciuta, ma è generalmente accettato che la genetica, i fattori ambientali, il microbiota intestinale e il sistema immunitario contribuiscano allo sviluppo della CU.³ Ad oggi, non esiste una cura per la CU e l'obiettivo del trattamento è controllare i sintomi clinici, indurre e mantenere la remissione, promuovere la guarigione della mucosa e ridurre le recidive. I trattamenti classici includono aminosalicilati, corticosteroidi, immunosoppressori e farmaci biologici. Tuttavia, questi farmaci non riescono a raggiungere l'effetto desiderato a causa dei loro vari effetti collaterali. effetti.4 Recentemente, numerosi studi di caso hanno dimostrato che la medicina tradizionale cinese (MTC) ha mostrato un grande potenziale nell'aiutare ad alleviare la colite ulcerosa con bassa tossicità, suggerendo che lo sviluppo di nuove terapie MTC rappresenta una promettente strategia di trattamento per la colite ulcerosa.5-7​​​
I granuli di Banlangen (BLG) sono una preparazione della medicina tradizionale cinese ottenuta dall'estratto acquoso della radice di Banlangen.8 Oltre alla sua efficacia antivirale, il BLG mostra una potenziale attività antinfiammatoria nel trattamento di varie condizioni infiammatorie.9,10 Inoltre, glucosinolati (R,S-goitrina, progoitrina, epiprorubina e glucoside) sono stati isolati e identificati da estratti acquosi di Radix isatidis, nucleosidi (ipoxantina, adenosina, uridina e guanosina) e alcaloidi indaco come indaco e indirubina.11,12 Studi precedenti hanno ben documentato che i composti adenosina, uridina e indirubina mostrano potenti effetti anticolite in diversi modelli animali di colite.13-17 Tuttavia, non sono stati condotti studi basati sull'evidenza per valutare l'efficacia del BLG nella colite. Nel presente studio, abbiamo indagato l'effetto protettivo del BLG sul destrano sodico Colite cronica recidivante indotta da solfato (DSS) in topi C57BL/6 e si è scoperto che la somministrazione orale di BLG ha attenuato significativamente la colite cronica recidivante indotta da DSS nei topi. L'infiammazione, i suoi meccanismi regolatori sono associati alla modulazione del microbiota intestinale e al ripristino della produzione di peptide-1 simile al glucagone (GLP-1) derivato dall'intestino.
I granuli di BLG (senza zucchero, approvati da NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Pechino, Cina; numero di lotto: 20110966) sono stati acquistati in farmacia. Il DSS (peso molecolare: 36.000–50.000 Dalton) è stato acquistato da MP Biologicals (Santa Ana, USA). La sulfasalazina (SASP) (purezza ≥ 98%), l'ematossilina e l'eosina sono state acquistate da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). I ​​kit per il dosaggio ELISA Luminex di TNF-α, IL-1β e IL-6 di topo sono stati acquistati da R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). L'acido acetico, l'acido propionico e l'acido butirrico sono stati acquistati da Aladdin Industries (Shanghai, Cina). L'acido 2-etilbutirrico è stato acquistato da Merck KGaA (Darmstadt, Germania).
Topi maschi C57BL/6 di 6-8 settimane (peso corporeo 18-22 g) sono stati acquistati dalla Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pechino, Cina) e alloggiati in un ambiente a 22 ± 2 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore. I topi sono stati alimentati con una dieta standard per roditori con libero accesso all'acqua potabile per una settimana per acclimatarsi al nuovo ambiente. I topi sono stati quindi divisi casualmente in quattro gruppi: gruppo di controllo, gruppo modello DSS, gruppo trattato con SASP (200 mg/kg, per via orale) e gruppo trattato con BLG (1 g/kg, per via orale). Come mostrato nella Figura 1A, secondo il nostro studio precedente, la colite cronica recidivante sperimentale è stata indotta nei topi mediante tre cicli di DSS all'1,8% per 5 giorni, seguiti da acqua distillata per 7 giorni, secondo il nostro studio precedente.18 I topi nei gruppi trattati con SASP e BLG sono stati trattati rispettivamente con SASP e BLG ogni giorno A partire dal giorno 0. Secondo esperimenti preliminari, la dose di BLG è stata fissata a 1 g/kg. Nel frattempo, la dose di SASP è stata fissata a 200 mg/kg secondo la letteratura.4 I gruppi di controllo e modello DSS hanno ricevuto lo stesso volume di acqua per tutta la durata dell'esperimento.
Figura 1 BLG migliora la colite cronica recidivante indotta da DSS nei topi. (A) Schema sperimentale della colite cronica recidivante e del trattamento, (B) variazione del peso corporeo, (C) punteggio dell'indice di attività della malattia (DAI), (D) lunghezza del colon, (E) immagine rappresentativa del colon, (F) colorazione H&E del colon (ingrandimento, ×100) e (G) punteggio istologico. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 o ###p < 0,001 rispetto al gruppo di controllo (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 rispetto al gruppo DSS.
Il peso corporeo, la consistenza delle feci e il sanguinamento rettale sono stati registrati quotidianamente. L'indice di attività della malattia (DAI) è stato determinato combinando i punteggi del peso corporeo, della consistenza delle feci e del sanguinamento rettale come descritto in precedenza.19 Al termine dell'esperimento, tutti i topi sono stati soppressi e sono stati raccolti sangue, feci e colon per ulteriori esperimenti.
Il tessuto del colon è stato fissato in formalina e incluso in paraffina. Sono state realizzate sezioni di 5 micron e colorate con ematossilina-eosina (H&E), quindi rese anonime e valutate come precedentemente descritto.19
L'RNA totale del tessuto del colon è stato estratto con il reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguito dall'estrazione del cDNA con trascrittasi inversa (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Giappone). La PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando un sistema di PCR in tempo reale con SYBR Green Master (Roche, Basilea, Svizzera). I trascritti del gene target sono stati normalizzati rispetto alla β-actina e i dati sono stati analizzati utilizzando il metodo 2-ΔΔCT. Le sequenze dei primer genici sono riportate nella Tabella 1.
L'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali del colon di topo primarie sono stati eseguiti come precedentemente descritto.20 In breve, i colon di topi di 6-8 settimane sono stati prima escissi dopo il sacrificio mediante dislocazione cervicale, quindi aperti longitudinalmente, trattati con soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS, senza calcio e magnesio) e tagliati in piccoli pezzi di 0,5-1 mm. Successivamente, i tessuti sono stati digeriti con 0,4 mg/mL di collagenasi XI (Sigma, Poole, Regno Unito) in terreno DMEM libero e centrifugati a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in terreno DMEM (integrato con 10% di siero fetale bovino, 100 unità/mL di penicillina e 100 µg/mL di streptomicina) a 37 °C e passare attraverso una rete di nylon (dimensione dei pori ~250 µm). Aliquote di cellule epiteliali del colon sono state poste in piastre con fondo di vetro e incubato con acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed estratti fecali di topo per 2 ore a 37 °C, 5% CO2.
Il tessuto del colon è stato omogeneizzato con PBS e i livelli delle citochine IL-6, TNF-α e IL-1β nel tessuto del colon sono stati rilevati utilizzando kit di dosaggio ELISA Luminex (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Analogamente, i livelli di GLP-1 nel siero e nel terreno di coltura delle cellule epiteliali del colon murino primarie sono stati determinati con un kit ELISA (Bioswamp, Wuhan, Cina) secondo le istruzioni del produttore.
Il DNA totale dalle feci è stato estratto utilizzando un kit di estrazione del DNA (Tiangen, Cina). La qualità e la quantità del DNA sono state misurate rispettivamente ai rapporti 260 nm/280 nm e 260 nm/230 nm. Successivamente, utilizzando ciascun DNA estratto come stampo, sono stati utilizzati i primer specifici 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) e 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) per amplificare le regioni V3-V4 del gene 16S rRNA in diverse regioni. I prodotti della PCR sono stati purificati utilizzando il kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN, Germania), quantificati mediante PCR in tempo reale e sequenziati utilizzando la piattaforma di sequenziamento IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, USA). Per l'analisi bioinformatica, l'elaborazione dei dati è stata eseguita seguendo protocolli precedentemente riportati.21,22 In breve, utilizzare Cutadapt (V1.9.1) per filtrare l'espressione grezza I file OTU sono stati raggruppati utilizzando UPARSE (versione 7.0.1001) con una soglia di similarità del 97% e UCHIME è stato utilizzato per rimuovere le sequenze chimeriche. L'analisi e la classificazione della composizione della comunità sono state eseguite utilizzando il classificatore RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) basato sul database dei geni dell'RNA ribosomiale SILVA.
I livelli di acidi grassi a catena corta (acido acetico, acido propionico e acido butirrico) sono stati misurati come precedentemente descritto da Tao et al., con alcune modifiche.23 In breve, 100 mg di feci sono stati prima sospesi in 0,4 mL di acqua deionizzata, seguiti da 0,1 mL di acido solforico al 50% e 0,5 mL di acido 2-etilbutirrico (standard interno), quindi omogeneizzati e riscaldati a 4 °C. Centrifugare a 12.000 giri/min per 15 minuti a C. Il supernatante è stato estratto con 0,5 mL di etere e iniettato nel GC per l'analisi. Per l'analisi mediante gascromatografia (GC), i campioni sono stati analizzati utilizzando un gascromatografo GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) dotato di un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID). La separazione è stata ottenuta utilizzando una colonna ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Cina). I dati sono stati acquisiti utilizzando il software GC solution (Shimadzu, Inc.). Il rapporto di split era 10:1, il gas vettore era azoto e la portata era 6 mL/min. Il volume di iniezione era 1 μL. La temperatura dell'iniettore e del rivelatore era 300 °C. La temperatura del forno è stata mantenuta a 140 °C per 13,5 minuti, quindi La temperatura è stata aumentata fino a 250 °C con una velocità di 120 °C/min; la temperatura è stata mantenuta per 5 minuti.
I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). La significatività dei dati è stata valutata mediante ANOVA a una via seguita dal test di confronto multiplo di Duncan. Il software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) è stato utilizzato per tutti i calcoli e un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
È noto che la colite ulcerosa (UC) è una malattia cronica recidivante caratterizzata da forti dolori addominali, diarrea e sanguinamento. Pertanto, è stata indotta una colite cronica recidivante nei topi mediante DSS per valutare l'efficacia anticolitica del BLG (Fig. 1A). Rispetto al gruppo di controllo, i topi del gruppo modello DSS presentavano un peso corporeo significativamente ridotto e un DAI più elevato, e questi cambiamenti sono stati significativamente invertiti dopo 24 giorni di trattamento con BLG (Figura 1B e C). L'accorciamento del colon è un importante segno distintivo della UC. Come mostrato nelle Figure 1D e E, la lunghezza del colon dei topi trattati con DSS era significativamente ridotta, ma è stata alleviata dal trattamento con BLG. Successivamente, è stata eseguita un'analisi istopatologica per valutare l'infiammazione del colon. Le immagini colorate con H&E e i punteggi patologici hanno mostrato che la somministrazione di DSS ha significativamente alterato l'architettura del colon e ha provocato la distruzione delle cripte, mentre il trattamento con BLG ha ridotto significativamente la distruzione delle cripte e i punteggi patologici (Figura 1F e G). In particolare, l'effetto protettivo del La BLG alla dose di 1 g/kg è risultata paragonabile alla SASP alla dose di 200 mg/kg. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che la BLG è efficace nel ridurre la gravità della colite cronica recidivante indotta da DSS nei topi.
TNF-α, IL-1β e IL-6 sono importanti marcatori infiammatori dell'infiammazione del colon. Come mostrato nella Figura 2A, il DSS ha indotto un aumento significativo dell'espressione genica di TNF-α, IL-1β e IL-6 nel colon rispetto al gruppo di controllo. La somministrazione di BLG può invertire significativamente questi cambiamenti mediati dal DSS. Successivamente, abbiamo utilizzato l'ELISA per determinare i livelli delle citochine infiammatorie TNF-α, IL-1β e IL-6 nel tessuto del colon. I risultati hanno anche mostrato che i livelli del colon di TNF-α, IL-1β e IL-6 erano significativamente aumentati nei topi trattati con DSS, mentre il trattamento con BLG ha attenuato questi aumenti (Figura 2B).
Figura 2 BLG inibisce l'espressione genica e la produzione delle citochine proinfiammatorie TNF-α, IL-1β e IL-6 nel colon di topi trattati con DSS. (A) Espressione genica di TNF-α, IL-1β e IL-6 nel colon; (B) livelli proteici di TNF-α, IL-1β e IL-6 nel colon. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 o ###p < 0,001 rispetto al gruppo di controllo (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 rispetto al gruppo DSS.
La disbiosi intestinale è fondamentale nella patogenesi della UC.24 Per indagare se BLG modula il microbiota intestinale dei topi trattati con DSS, è stato eseguito il sequenziamento dell'rRNA 16S per analizzare la comunità batterica del contenuto intestinale. Il diagramma di Venn mostra che i tre gruppi condividono 385 OTU. Allo stesso tempo, ogni gruppo aveva OTU unici (Fig. 3A). Inoltre, l'indice Chao1 e l'indice di Shannon mostrati nella Figura 3B e C hanno mostrato che la diversità della comunità del microbiota intestinale era ridotta nei topi trattati con BLG, poiché l'indice di Shannon era significativamente diminuito nel gruppo trattato con BLG. L'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi delle coordinate principali (PCoA) sono state utilizzate per determinare i modelli di clustering tra i tre gruppi e hanno mostrato che la struttura della comunità dei topi trattati con DSS era chiaramente separata dopo il trattamento con BLG (Figura 3D e E). Questi dati suggeriscono che il trattamento con BLG ha influenzato significativamente la struttura della comunità dei topi con Colite indotta da DSS.
Figura 3 BLG altera la diversità del microbiota intestinale nei topi con colite indotta da DSS. (A) Diagramma di Venn dell'OTU, (B) Indice Chao1, (C) Indice di ricchezza di Shannon, (D) Grafico del punteggio dell'analisi delle componenti principali (PCA) dell'OTU, (E) Figura del punteggio dell'analisi delle coordinate principali (PCoA) dell'OTU. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 6).**p < 0,01 rispetto al gruppo DSS.
Per valutare i cambiamenti specifici nel microbiota fecale, abbiamo analizzato la composizione del microbiota intestinale a tutti i livelli tassonomici. Come mostrato nella Figura 4A, i principali phyla in tutti i gruppi erano Firmicutes e Bacteroidetes, seguiti da Verrucomicrobia. Le abbondanze relative di Firmicutes e i rapporti Firmicutes/Bacteroidetes erano significativamente aumentati nelle comunità microbiche fecali dei topi trattati con DSS rispetto ai topi di controllo, e questi cambiamenti sono stati significativamente invertiti dopo il trattamento con BLG. In particolare, il trattamento con BLG ha aumentato significativamente l'abbondanza relativa di Verrucobacterium nelle feci dei topi con colite indotta da DSS. A livello familiare, le comunità microbiche fecali erano occupate da Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae e Prevotellaceae (Fig. 4B). Rispetto al gruppo DSS, la deplezione di BLG ha aumentato l'abbondanza di Akkermansiaceae, ma ha diminuito l'abbondanza di Lachnospiriceae. e Ruminococcaceae. In particolare, a livello di genere, il microbiota fecale era occupato da Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Questo risultato ha anche dimostrato che il trattamento con BLG ha invertito efficacemente lo squilibrio del microbiota in risposta alla sfida DSS, caratterizzato da una diminuzione di Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas e Oscillibacter e un aumento di Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001.
Figura 4 BLG altera l'abbondanza del microbiota intestinale nei topi con colite indotta da DSS. (A) Abbondanza del microbiota intestinale a livello di phylum; (B) Abbondanza del microbiota intestinale a livello di famiglia; (C) Abbondanza del microbiota intestinale a livello di genere. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ###p < 0,001 rispetto al gruppo di controllo (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 rispetto al gruppo DSS.
Considerando che gli acidi grassi a catena corta (SCFA) sono i principali metaboliti di Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001, mentre acetato, propionato e butirrato sono gli SCFA più abbondanti nel lume intestinale, 25-27 siamo ancora nel nostro studio. Come mostrato nella Figura 5, le concentrazioni fecali di acetato, propionato e butirrato sono state significativamente ridotte nel gruppo trattato con DSS, mentre il trattamento con BLG ha potuto sopprimere in gran parte questa riduzione.
Figura 5. BLG aumenta i livelli di SCFA nelle feci di topi con colite indotta da DSS. (A) Contenuto di acido acetico nelle feci; (B) contenuto di acido propionico nelle feci; (C) contenuto di acido butirrico nelle feci. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 rispetto al gruppo DSS.
Abbiamo inoltre calcolato il coefficiente di correlazione di Pearson tra gli SCFA differenziali a livello di genere e il microbiota fecale. Come mostrato nella Figura 6, Akkermansia era correlata positivamente con la produzione di acido propionico (Pearson = 0,4866) e acido butirrico (Pearson = 0,6192). Al contrario, sia Enteromonas che Oscillobacter erano associati negativamente alla produzione di acetato, con coefficienti di Pearson rispettivamente di 0,4709 e 0,5104. Allo stesso modo, Ruminococcaceae_UCG-014 era correlato negativamente con la produzione di acido propionico (Pearson = 0,4508) e acido butirrico (Pearson = 0,5842), rispettivamente.
Figura 6 Analisi di correlazione di Pearson tra SCFA differenziali e microbi del colon. (A) Enteromonas con acido acetico; (B) Bacillus concussion con acido acetico; (C) Akkermansia vs acido propionico; (D) Ruminococcus_UCG-014 con acido propionico; (E) Akkermansia con acido butirrico; (F) Ruminococcus_UCG-014 con acido butirrico.
Il peptide-1 simile al glucagone (GLP-1) è un prodotto post-traduzionale specifico per tipo cellulare del proglucagone (Gcg) con proprietà antinfiammatorie.28 Come mostrato nella Figura 7, il DSS ha indotto una diminuzione significativa dell'espressione dell'mRNA del Gcg. Il trattamento del colon e del BLG potrebbe invertire significativamente la riduzione del Gcg indotta dal DSS rispetto al gruppo di controllo (Fig. 7A). Allo stesso tempo, il livello di GLP-1 nel siero era significativamente ridotto nel gruppo trattato con DSS e il trattamento con BLG potrebbe prevenire in gran parte questa riduzione (Fig. 7B). Poiché gli acidi grassi a catena corta possono stimolare la secrezione di GLP-1 attraverso l'attivazione del recettore accoppiato alla proteina G 43 (GRP43) e del recettore accoppiato alla proteina G 41 (GRP41), abbiamo anche esaminato GPR41 e GRP43 nel colon di topi con colite e abbiamo scoperto che l'espressione dell'mRNA del colon di GRP43 e GPR41 era significativamente diminuita dopo la sfida con DSS e Il trattamento con BLG potrebbe contrastare efficacemente queste diminuzioni (Figura 7C e D).
Figura 7 BLG aumenta i livelli sierici di GLP-1 e l'espressione di mRNA di Gcg, GPR41 e GRP43 nel colon di topi trattati con DSS. (A) Espressione di mRNA di Gcg nel tessuto del colon; (B) Livello di GLP-1 nel siero; (C) Espressione di mRNA di GPR41 nel tessuto del colon; (D) Espressione di mRNA di GPR43 nel tessuto del colon. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo (Con); *p < 0,05 rispetto al gruppo DSS.
Poiché il trattamento con BLG potrebbe aumentare i livelli sierici di GLP-1, l'espressione dell'mRNA di Gcg nel colon e i livelli di SCFA fecali nei topi trattati con DSS, abbiamo ulteriormente esaminato acetato, propionato e butirrato, nonché da topi di controllo (F-Con), colite da DSS (F-Con) -DSS) e colite trattata con BLG (F-BLG) sul rilascio di GLP-1 da cellule epiteliali del colon murino primarie. Come mostrato nella Figura 8A, le cellule epiteliali del colon murino primarie trattate rispettivamente con 2 mM di acido acetico, acido propionico e acido butirrico hanno stimolato significativamente il rilascio di GLP-1, in linea con studi precedenti.29,30 Allo stesso modo, tutti F-Con, F-DSS e F-BLG (equivalenti a 0,25 g di feci) hanno stimolato notevolmente il rilascio di GLP-1 da cellule epiteliali del colon murino primarie. In particolare, la quantità di GLP-1 rilasciata da La produzione di GLP-1 derivato dagli SCFA intestinali è risultata molto inferiore nelle cellule epiteliali del colon di topo primarie trattate con F-DSS rispetto a quelle trattate con F-Con e F-BLG (Figura 8B). Questi dati suggeriscono che il trattamento con BLG ha ripristinato in modo significativo la produzione di GLP-1 derivato dagli SCFA intestinali.
Figura 8 Gli SCFA derivati ​​da BLG stimolano il rilascio di GLP-1 dalle cellule epiteliali del colon murino primarie. (A) L'acido acetico, l'acido propionico e l'acido butirrico hanno stimolato il rilascio di GLP-1 dalle cellule epiteliali del colon murino primarie; (B) gli estratti fecali F-Con, F-DSS e F-BLG hanno stimolato le cellule epiteliali del colon murino primarie. Quantità di GLP-1 rilasciato. Aliquote di cellule epiteliali del colon sono state poste in piastre di Petri con fondo di vetro e trattate rispettivamente con 2 mM di acido acetico, acido propionico, acido butirrico ed estratti fecali F-Con, F-DSS e F-BLG (equivalenti a 0,25 g di feci). 2 ore a 37 °C, 5% CO2, rispettivamente. La quantità di GLP-1 rilasciata dalle cellule epiteliali del colon murino primarie è stata rilevata mediante ELISA. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 3). #p < 0,05 o ##p < 0,01 rispetto al bianco o F-Con; *p < 0,05 rispetto a F-DSS.
Abbreviazioni: Ace, acido acetico; Pro, acido propionico; tuttavia, acido butirrico; F-Con, estratto fecale di topi di controllo; F-DSS, estratto fecale di topi con colite; F-BLG, estratto fecale di colon trattato con BLG. Estratti fecali di topi infiammatori.
Classificata dall'Organizzazione Mondiale della Sanità come malattia refrattaria, la colite ulcerosa sta diventando un pericolo globale; Tuttavia, i metodi efficaci per prevedere, prevenire e trattare la malattia sono ancora limitati. Pertanto, è urgente esplorare e sviluppare nuove strategie terapeutiche sicure ed efficaci per la colite ulcerosa. I preparati della medicina tradizionale cinese sono un'opzione promettente perché molti preparati della medicina tradizionale cinese si sono dimostrati efficaci nel trattamento della colite ulcerosa nella popolazione cinese nel corso dei secoli, e sono tutti organici biologici e materiali naturali che sono per lo più innocui per l'uomo e gli animali.31,32 Questo studio mirava a cercare un preparato della medicina tradizionale cinese sicuro ed efficace per il trattamento della colite ulcerosa e ad esplorarne il meccanismo d'azione. Il BLG è una nota formula erboristica cinese utilizzata per trattare l'influenza.8,33 Il lavoro svolto nel nostro laboratorio e in altri ha dimostrato che l'indaco, un prodotto della medicina tradizionale cinese lavorato dalla stessa materia prima del BLG, mostra una significativa efficacia nel trattamento della colite ulcerosa nell'uomo e negli animali.4,34 Tuttavia, gli effetti anticolite del BLG e il suo meccanismo d'azione non sono chiari. Nel presente studio, i nostri risultati dimostrano che il BLG attenua efficacemente l'infiammazione del colon indotta da DSS, che è associato alla modulazione del microbiota intestinale e al ripristino della produzione di GLP-1 di origine intestinale.
È noto che la colite ulcerosa (CU) è caratterizzata da periodi di recidiva con caratteristiche cliniche tipiche, come perdita di peso, diarrea, sanguinamento rettale e danni estesi alla mucosa del colon.35 Pertanto, la colite cronica recidivante è stata indotta somministrando tre cicli di DSS all'1,8% per cinque giorni, seguiti da sette giorni di acqua potabile. Come mostrato nella Figura 1B, la perdita di peso fluttuante e i punteggi DAI hanno indicato l'induzione riuscita della colite cronica recidivante. I topi del gruppo trattato con BLG hanno mostrato un recupero in aumento a partire dal giorno 8, che era significativamente diverso dal giorno 24. Gli stessi cambiamenti sono stati osservati anche nel punteggio DAI, suggerendo un miglioramento nel miglioramento clinico della colite. In termini di danno al colon e stato infiammatorio, la lunghezza del colon, il danno al tessuto del colon e l'espressione genica e la produzione delle citochine proinfiammatorie TNF-α, IL-1β e IL-6 nel tessuto del colon sono stati anche notevolmente migliorati dopo il trattamento con BLG. Collettivamente, questi risultati dimostrano chiaramente che BLG è efficace nel trattamento della colite cronica colite recidivante nei topi.
Come agisce BLG per esercitare i suoi effetti farmacologici? Numerosi studi precedenti hanno dimostrato che il microbiota intestinale svolge un ruolo chiave nella patogenesi della colite ulcerosa (UC), e le terapie basate sul microbioma e mirate al microbioma sono emerse come una strategia molto interessante per il trattamento della UC. Nel presente studio, abbiamo dimostrato che il trattamento con BLG ha determinato cambiamenti significativi nella composizione del microbiota intestinale, suggerendo che l'effetto protettivo di BLG contro la colite indotta da DSS è correlato alla modulazione del microbiota intestinale. Questa osservazione è coerente con l'idea che riprogrammare l'omeostasi del microbiota intestinale sia un approccio importante per comprendere l'efficacia dei preparati della MTC.36,37 In particolare, Akkermansia è un batterio Gram-negativo e strettamente anaerobico che vive nello strato mucoso dell'intestino, che degrada le mucine, produce acido propionico, stimola la differenziazione delle cellule caliciformi e mantiene la mucosa. funzione dell'integrità della barriera.26 Numerosi dati clinici e su animali suggeriscono che Akkermansia è fortemente associata a una mucosa sana,38 e alla somministrazione orale di Akkermansia spp. può migliorare significativamente l'infiammazione della mucosa.39 I nostri dati attuali suggeriscono che l'abbondanza relativa di Akkermansia è significativamente aumentata dopo il trattamento con BLG. Inoltre, Prevotellaceae_UCG-001 è un batterio produttore di SCFA.27 Diversi studi hanno dimostrato che Prevotellaceae_UCG-001 è stato trovato in bassa abbondanza relativa nelle feci di animali con colite.40,41 I nostri dati attuali mostrano anche che il trattamento con BLG può aumentare significativamente l'abbondanza relativa di Prevotellaceae_UCG-001 nel colon di topi trattati con DSS. Al contrario, Oscillibacter è un batterio mesofilo, strettamente anaerobico.42 hanno riportato che l'abbondanza relativa di Oscillibacter era significativamente aumentata nei topi UC ed era significativamente correlata positivamente con i livelli di IL-6 e IL-1β e i punteggi patologici.43,44 In particolare, il trattamento con BLG ha ridotto significativamente l'abbondanza relativa di Oscillibacter nelle feci di topi trattati con DSS. In particolare, questi I batteri modificati da BLG erano i batteri che producevano la maggior quantità di SCFA. Numerosi studi precedenti hanno dimostrato i potenziali effetti benefici degli SCFA sull'infiammazione del colon e sulla protezione dell'integrità dell'epitelio intestinale.45,46 I nostri dati attuali hanno anche osservato che le concentrazioni di SCFA acetato, propionato e butirrato nelle feci trattate con DSS erano notevolmente aumentate nei topi trattati con BLG. Nel complesso, questi risultati dimostrano chiaramente che il trattamento con BLG può potenziare efficacemente i batteri produttori di SCFA indotti da DSS nei topi con colite cronica recidivante.
Il GLP-1 è un'incretina prodotta principalmente nell'ileo e nel colon e svolge un ruolo importante nel ritardare lo svuotamento gastrico e nell'abbassare la glicemia postprandiale.47 Le prove suggeriscono che la dipeptidil peptidasi (DPP)-4, un agonista del recettore del GLP-1, e una nanomedicina GLP-1 possono alleviare efficacemente l'infiammazione intestinale nei topi.48-51 Come riportato in studi precedenti, elevate concentrazioni di SCFA sono state associate a livelli plasmatici di GLP-1 negli esseri umani e nei topi. 52 I nostri dati attuali mostrano che dopo il trattamento con BLG, i livelli sierici di GLP-1 e l'espressione dell'mRNA di Gcg sono aumentati significativamente. Allo stesso modo, la secrezione di GLP-1 è aumentata significativamente nelle colture del colon dopo la stimolazione con estratti fecali di topi con colite trattati con BLG rispetto alla stimolazione con estratti fecali di topi con colite trattati con DSS. In che modo gli SCFA influenzano il rilascio di GLP-1? Gwen Tolhurst et al. È stato riportato che gli SCFA possono stimolare la secrezione di GLP-1 attraverso GRP43 e GPR41.29 I nostri dati attuali mostrano anche che il trattamento con BLG aumenta significativamente l'espressione dell'mRNA di GRP43 e GPR41 nel colon di topi trattati con DSS. Questi dati suggeriscono che il trattamento con BLG può ripristinare la produzione di GLP-1 promossa dagli SCFA attivando GRP43 e GPR41.
BLG è un farmaco da banco (OTC) utilizzato a lungo termine in Cina. La dose massima tollerata di BLG nei topi Kunming è di 80 g/kg e non è stata osservata alcuna tossicità acuta.53 Attualmente, la dose raccomandata di BLG (senza zucchero) negli esseri umani è di 9-15 g/giorno (3 volte al giorno). Il nostro studio ha dimostrato che BLG a 1 g/kg ha migliorato la colite cronica recidivante indotta da DSS nei topi. Questa dose è vicina alla dose di BLG utilizzata clinicamente. Il nostro studio ha anche scoperto che il suo meccanismo d'azione è mediato, almeno in parte, da alterazioni del microbiota intestinale, in particolare batteri produttori di SCFA, come Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001, per ripristinare la produzione di GLP-1 derivata dall'intestino. Questi risultati suggeriscono che BLG merita ulteriore considerazione come potenziale agente terapeutico per il trattamento clinico della colite. Tuttavia, l'esatto meccanismo con cui modula il microbiota intestinale deve ancora essere confermato da topi con deficit di microbiota e trapianto di batteri fecali.
Ace, acido acetico; but, acido butirrico; BLG, pandano; DSS, destrano solfato di sodio; DAI, indice di attività della malattia; DPP, dipeptidil peptidasi; FID, rivelatore a ionizzazione di fiamma; F-Con, controllo Estratti fecali di topi; F-DSS, estratti fecali di topi con colite indotta da DSS; F-BLG, estratti fecali di topi con colite trattati con BLG; GLP-1, peptide-1 simile al glucagone; Gcg, glucagone; gascromatografia, gascromatografia; GRP43, recettore 43 accoppiato a proteina G; GRP41, recettore 41 accoppiato a proteina G; H&E, ematossilina-eosina; HBSS, soluzione salina bilanciata di Hanks; OTC, OTC; PCA, analisi delle componenti principali; PCoA, analisi delle coordinate principali; Pro, acido propionico; SASP, sulfasalazina; SCFA, acidi grassi a catena corta; medicina cinese, medicina tradizionale cinese; UC, colite ulcerosa.
Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del Centro Medico dell'Università di Pechino-Università di Scienza e Tecnologia di Shenzhen-Hong Kong (Shenzhen, Cina) in conformità con le Linee Guida Istituzionali e le Norme sugli Animali (numero di approvazione etica A2020157).
Tutti gli autori hanno fornito contributi significativi alla concezione e alla progettazione, all'acquisizione dei dati o all'analisi e all'interpretazione dei dati; hanno partecipato alla stesura dell'articolo o alla revisione critica di importanti contenuti intellettuali; hanno acconsentito alla presentazione del manoscritto alla rivista in questione; hanno approvato la versione finale per la pubblicazione; sono responsabili di tutti gli aspetti del lavoro.
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (81560676 e 81660479), dal progetto di prima classe della Shenzhen University (86000000210), dal Shenzhen Science and Technology Innovation Committee Fund (JCYJ20210324093810026), dal Guangdong Provincial Medical Science and Technology Research Fund (A2020157 e A2020272), dal Guizhou Medical University Pharmacy Guizhou Province Funded by Key Laboratory (YWZJ2020-01) e dal Peking University Shenzhen Hospital (JCYJ2018009).
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