Lo smistamento proteico nella via secretoria è essenziale per il mantenimento della compartimentazione e dell'omeostasi cellulare. Oltre allo smistamento mediato dal guscio, il ruolo dei lipidi nello smistamento della chinesina nel processo di trasporto secretorio è una questione fondamentale di lunga data che non ha ancora trovato risposta. In questo studio, eseguiamo un imaging 3D multicolore simultaneo ad alta risoluzione in tempo reale per dimostrare in vivo che le proteine ​​di nuova sintesi immobilizzate in glicosilfosfatidilinositolo con gruppi lipidici ceramidici molto lunghi vengono raggruppate e classificate in un sito di uscita specializzato per endoplasmi (Net), diverso da quello utilizzato dalle proteine ​​transmembrana. Inoltre, dimostriamo che la lunghezza della catena della ceramide nella membrana del reticolo endoplasmatico è fondamentale per questa selettività di smistamento. Il nostro studio fornisce la prima prova diretta in vivo per classificare i carichi proteici in base alla lunghezza della catena lipidica in siti di esportazione selettivi nella via secretoria.
Nelle cellule eucariotiche, le proteine ​​sintetizzate nel reticolo endoplasmatico (RE) vengono poi smistate durante il trasporto attraverso la via secretoria per essere consegnate alla loro destinazione cellulare appropriata (1). Oltre allo smistamento mediato dal rivestimento, si è a lungo ipotizzato che alcuni lipidi possano anche fungere da punti di uscita selettivi, raggruppandoli in specifici domini di membrana che contengono proteine ​​specifiche (2-5). Tuttavia, mancano ancora prove dirette in vivo per dimostrare questo possibile meccanismo basato sui lipidi. Per risolvere questo problema di base, abbiamo studiato nel lievito come le proteine ​​ancorate al glicosilfosfatidilinositolo (GPI) (GPI-AP) vengano esportate in modo differenziale dal RE. Le GPI-AP sono una varietà di proteine ​​di superficie cellulare connesse ai lipidi (6, 7). La GPI-AP è una proteina secreta attaccata ai foglietti esterni della membrana plasmatica attraverso la porzione glicolipidica (ancora GPI). Accettano le ancore GPI come modificazioni post-traduzionali conservative nel lume del RE (8). Dopo l'adesione, la GPI-AP passa attraverso l'apparato di Golgi (5, 9) dal RE alla membrana plasmatica. La presenza di ancore GPI fa sì che la GPI-AP venga trasportata separatamente dalle proteine ​​secrete transmembrana (incluse altre proteine ​​della membrana plasmatica) lungo la via secretoria (5, 9, 10). Nelle cellule di lievito, le GPI-AP vengono separate dalle altre proteine ​​secrete nel reticolo endoplasmatico e quindi impacchettate in vescicole uniche avvolte dal complesso proteico di rivestimento II (COPII) (6, 7). I determinanti di questo processo di classificazione nel processo di esportazione del RE non sono chiari, ma si ipotizza che questo meccanismo possa richiedere lipidi, in particolare il rimodellamento strutturale della porzione lipidica dell'ancora GPI (5, 8). Nel lievito, il rimodellamento lipidico del GPI inizia immediatamente dopo l'adesione del GPI e, in molti casi, induce la ceramide a legarsi all'acido grasso saturo a catena lunga a 26 atomi di carbonio (C26:0) (11, 12). La ceramide C26 è la principale ceramide prodotta finora dalle cellule di lievito. Viene sintetizzata nel reticolo endoplasmatico e la maggior parte viene esportata all'apparato di Golgi attraverso le vescicole COPII (13). L'esportazione di GPI-AP dal reticolo endoplasmatico richiede specificamente la continua sintesi di ceramide (14, 15) e, a sua volta, la conversione della ceramide in ceramide inositolo fosfato (IPC) nell'apparato di Golgi dipende dalla sintesi dell'ancora GPI (16). Studi biofisici con membrane artificiali hanno dimostrato che ceramidi a catena acilica molto lunga possono fondersi per formare domini ordinati con proprietà fisiche uniche (17, 18). Questi dati portano all'ipotesi che la ceramide C26 e il GPI-AP con la ceramide C26 utilizzino le loro proprietà fisiche per fondersi in regioni ordinate o regioni nell'ambiente lipidico relativamente disordinato della membrana del RE. Questo è composto principalmente da glicerolipidi corti e insaturi (C16:1 e C18:1) (19, 20). Queste regioni saranno selettivamente focalizzate su specifici siti di uscita del RE (ERE), dove la ceramide e il GPI-AP a base di ceramide possono essere co-trasportati al Golgi nella stessa vescicola COPII dedicata (5).
In questo studio, abbiamo testato direttamente questo meccanismo basato sui lipidi utilizzando la microscopia confocale in tempo reale a super risoluzione (SCLIM), una tecnica di microscopia all'avanguardia in grado di osservare simultaneamente proteine ​​marcate con fluorescenza. Le immagini tridimensionali e a tre colori (3D) hanno una risoluzione e una velocità estremamente elevate nelle cellule viventi (21, 22).
Abbiamo inizialmente applicato la tecnologia SCLIM per definire ulteriormente come la GPI-AP normale con gruppo ceramide C26 fosse selezionata dalle proteine ​​secrete transmembrana dopo aver lasciato l'ER in S. cerevisiae. Per verificare la classificazione dell'ER, abbiamo utilizzato un sistema genetico in grado di visualizzare direttamente il carico di nuova sintesi che entra nell'ERES in vivo (7, 23). Come carico, abbiamo scelto la GPI-AP Gas1 basata sulla ceramide C26 marcata con proteina fluorescente verde (GFP) e la proteina transmembrana Mid2 secreta marcata con proteina fluorescente nel vicino infrarosso (iRFP), entrambe aventi come target la membrana plasmatica (24–26). Nel mutante termosensibile sec31-1, questi due carichi sono espressi sotto un promotore inducibile dal galattosio e un marcatore costitutivo dell'ERES. A temperature estreme (37°C), poiché la mutazione sec31-1 influenza la funzione del componente del rivestimento COPII Sec31 di inibire la germinazione di COPII e l'esportazione dal RE, il carico di nuova sintesi si accumula nel RE (23). Dopo il raffreddamento a bassa temperatura (24°C), le cellule mutanti sec31-1 si sono riprese dall'area secretoria e il nuovo carico sintetico accumulato ha iniziato a essere esportato dal RE. La visualizzazione CLIM ha mostrato che la maggior parte di Gas1-GFP e Mid2-iRFP di nuova sintesi si accumulava ancora nel RE delle cellule mutanti sec31-1 dopo l'incubazione a 37°C e poi rilasciata a 24°C per 5 minuti (Figura 1). Poiché Mid2-iRFP è distribuito sull'intera membrana del RE e Gas1-GFP è concentrato e raccolto nell'area discontinua della membrana del RE, la loro distribuzione è completamente diversa (Figura 1, da A a C e Filmato S1). Inoltre, come mostrato in Figura 1D, il cluster Gas1-GFP non presenta Mid2-iRFP. Questi risultati indicano che GPI-AP e le proteine ​​transmembrana sono state separate precocemente in diverse regioni della membrana del RE. Il cluster Gas1-GFP è adiacente a uno specifico ERES marcato con la proteina di rivestimento COPII di mCherry, Sec13 (Figura 1, E e F, e filmato S1) (23).
Le cellule sec31-1 esprimono secrezioni indotte dal galattosio, una ceramide a lunga catena acilica (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e la proteina transmembrana Mid2-iRFP (TMP, blu) e questa marcatura ERES costruttiva Sec13-mCherry (ERES, magenta) è stata incubata a 37 °C per 30 minuti, spostata a 24 °C e acquisita tramite SCLIM 5 minuti dopo. (Da A a C) mostra un'immagine 2D rappresentativa, unita o singola, di un piano (A), un'immagine di proiezione 2D di 10 sezioni z (B) o un'immagine 3D dell'emisfero cellulare del carico e dei marcatori ERES (C). Barra di scala 1 μm (A e B). L'unità di scala è 0,551 μm (C). Gas1-GFP è stato rilevato in regioni o cluster discreti del RE, mentre Mid2-iRFP è stato rilevato e distribuito lungo tutta la membrana del RE (C). (D) Il grafico mostra l'intensità di fluorescenza relativa di Gas1-GFP e Mid2-iRFP nel cluster Gas1-GFP lungo la linea della freccia bianca (sinistra). AU, unità arbitraria. (E e F) rappresentano l'immagine 3D che combina i segni "goods" e "ERES". I cluster Gas1-GFP sono stati rilevati in prossimità dello specifico ERES. L'unità di scala è 0,551 μm. (F) La freccia bianca continua indica il cluster Gas1-GFP associato all'ERES. I pannelli centrale e destro mostrano l'immagine 3D ingrandita e una vista ruotata del cluster Gas1-GFP selezionato.
La stretta relazione spaziale tra il cluster Gas1-GFP e uno specifico ERES indica che Gas1-GFP può entrare in ERES selettive, il che è diverso dalla selettività utilizzata da Mid2-iRFP per uscire dall'ER. Per affrontare questa possibilità, abbiamo quantificato il rapporto ERES per uno o due soli beni (Figura 2, da A a C). Abbiamo scoperto che la maggior parte degli ERES (70%) contiene un solo tipo di carico. L'immagine in basso della Figura 2C mostra due tipici esempi di ERES con solo Gas1-GFP (Figura 1) o solo Mid2-iRFP (Figura 2). Al contrario, circa il 20% degli ERES contiene due carichi che si sovrappongono nella stessa area. È stato riscontrato che alcuni ERES (10%) contenevano due tipi di carico, ma erano isolati in aree chiaramente diverse. Pertanto, questa analisi statistica mostra che dopo l'esportazione dell'ER, GPI-AP Gas1-GFP e il carico transmembrana Mid2-iRFP sono suddivisi in diversi ERES (Figura 2D). Questa efficienza di smistamento è molto coerente con la precedente analisi biochimica (6) e la determinazione morfologica (7). Possiamo anche osservare il comportamento del carico in quarantena che entra nell'ERES (Figura 2E e Filmato S2). La Figura 2E mostra che solo una piccola porzione di Gas1-GFP (riquadro 3) o Mid2-iRFP (riquadro 4) entra nell'ERES da un lato ed è confinata in un'area discreta. Il riquadro 5 della Figura 2E mostra che Gas1-GFP e Mid2-iRFP si trovano talvolta nello stesso ERES, ma entrano da lati diversi e sono concentrati in regioni separate che possono rappresentare diverse vescicole COPII. Abbiamo anche confermato che la separazione e la classificazione osservate di GPI-AP Gas1 basata sulla ceramide C26 come ERES selettiva sono specifiche perché un altro carico di secrezione transmembrana, la proteina di membrana plasmatica marcata con GFP Axl2 (27), mostra un comportamento simile a Mid2-iRFP. (Immagine S1 e Filmato S3). La proteina Axl2-GFP di nuova sintesi è distribuita attraverso la membrana del RE come Mid2-iRFP (Figura S1, A e B) ed è co-localizzata con Mid2-iRFP nella maggior parte delle ERES (Figura S1, da B a D). I pannelli 1 e 2 della Figura 1.S1C mostrano due tipici esempi di ERES in cui due carichi transmembrana si sovrappongono. In questi casi, entrambi i prodotti entrano contemporaneamente nell'ERES (Figura S1E, pannello 3 e filmato S3).
Le cellule sec31-1 che esprimono secrezioni inducibili dal galattosio, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e Mid2-iRFP (TMP, blu) e la marcatura costitutiva ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) sono state posizionate a 37 Dopo l'incubazione per 30 minuti a °C, spostare a 24 °C per rilasciare il blocco di secrezione e acquisire l'immagine con SCLIM dopo 20 minuti. (Da A a C) Immagini di proiezione 2D rappresentative (A; barra di scala, 1 μm) o immagini dell'emisfero cellulare 3D (B e C; unità di scala, 0,456 μm) del carico e 10 sezioni z contrassegnate da ERES. Il pannello inferiore in (B) e il pannello in (C) mostrano immagini elaborate per visualizzare solo i beni presenti in ERES (magenta) [Gas1-GFP (grigio) e Mid2-iRFP (azzurro chiaro)]. (C) Freccia aperta: l'ERES trasporta un solo carico (da 1 a 4). Freccia grigia: l'ERES contiene un carico segregato (5). Freccia bianca continua: l'ERES contiene un carico co-localizzato. In basso: l'ERES singolo selezionato contiene solo Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Barra di scala, 100 nm. (D) Quantificazione della microfotografia descritta in (C). Percentuale media di ERES che contiene un solo carico (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), carico segregato e carico sovrapposto. In tre esperimenti indipendenti, n=432 in 54 cellule. Barra di errore = DS. Test t non accoppiato a due code. *** P = 0,0002. (E) Immagine 3D di ERES selezionati del carico in quarantena contrassegnati con (C). Gas1-GFP (verde) (3) o Mid2-iRFP (blu) (4) entrano nell'ERES (magenta) da un lato e sono confinati in una piccola area all'interno dell'ERES. A volte, entrambi i tipi di carico entrano nello stesso ERES (5) dallo stesso lato e sono confinati in un'area isolata all'interno dell'ERES. Barra di scala, 100 nm.
Successivamente, abbiamo testato l'ipotesi che la ceramide a catena acilica lunga (C26) presente nella membrana del reticolo endoplasmatico (RE) guidi il raggruppamento e lo smistamento specifici di Gas1 in ERES selettivi. A tal fine, abbiamo utilizzato un ceppo di lievito modificato GhLag1, in cui le due sintasi della ceramide endogena Lag1 e Lac1 sono state sostituite da GhLag1 (l'omologo di Lag1 del cotone), ottenendo un ceppo di lievito con un ceppo di ceramide della membrana cellulare più corto rispetto al tipo selvatico (Figura 3A) (28). L'analisi di spettrometria di massa (MS) ha mostrato che nei ceppi selvatici, il 95% della ceramide totale è ceramide a catena molto lunga (C26), mentre in GhLag1, l'85% della ceramide è molto lunga (C18 e C16). ), solo il 2% della ceramide è ceramide a catena molto lunga (C26). Sebbene le ceramidi C18 e C16 siano le principali ceramidi finora rilevate nella membrana di GhLag1, l'analisi MS ha anche confermato che l'ancora GPI di Gas1-GFP espressa nel ceppo GhLag1 contiene ceramide C26, che è paragonabile ai lipidi di tipo selvatico. La qualità è la stessa (Fig. 3A) (26). Pertanto, ciò significa che l'enzima di rimodellamento della ceramide Cwh43 è altamente selettivo per la ceramide C26, come mostrato in Figura 26, incorporando preferenzialmente l'ancora GPI da una piccola quantità di ceramide C26 nel ceppo GhLag1. S2 (29). Tuttavia, la membrana cellulare di GhLag1 contiene fondamentalmente solo ceramide C18-C16, mentre Gas1-GFP contiene ancora ceramide C26. Questo fatto rende questo ceppo uno strumento ideale per risolvere specificamente il problema della lunghezza della catena acilica della ceramide di membrana nel RE. Il ruolo ipotetico di classe e ordinamento. Successivamente, abbiamo studiato la capacità di C26 Gas1-GFP di accumularsi in cluster in GhLag1 con un allele mutante sensibile alla temperatura di sec31-1 attraverso la microscopia a fluorescenza convenzionale, dove solo la catena lunga (C18-C16) è presente nella ceramide della membrana del RE (Fig. 3). Abbiamo osservato che in sec31-1, la maggior parte di Gas1-GFP era concentrata in cluster, mentre Gas1-GFP in sec31-1 GhLag1 con lunga ceramide (C18-C16) nella membrana del RE non era principalmente raggruppata e distribuita nell'intera membrana del RE. Per essere precisi, poiché il clustering basato sulla ceramide C26 è strettamente correlato a specifici ERES (Figura 1), abbiamo poi studiato se questo processo possa anche coinvolgere la funzione del meccanismo proteico di esportazione del RE. GPI-AP utilizza uno speciale sistema COPII per l'esportazione dell'ER, che è attivamente regolato dal rimodellamento strutturale di Ted1 della porzione glicanica dell'ancora GPI (30, 31). Il GPI-glicano ricombinante viene quindi riconosciuto dal complesso recettore transmembrana p24, che a sua volta recluta selettivamente Lst1, che è un'isoforma specifica della principale subunità di legame del carico COPII Sec24, formando una COPII ricca di GPI-AP. Le vescicole sono necessarie (31-33). Pertanto, abbiamo costruito un doppio mutante che combinava la delezione di queste singole proteine ​​(il componente del complesso p24 Emp24, l'enzima di rimodellamento GPI-glicano Ted1 e la subunità specifica di COPII Lst1) con il ceppo mutante sec31-1 e le abbiamo studiate per verificare se è possibile formare la GFP del cluster Gas1 (Figura 3). Abbiamo osservato che in sec31-1emp24Δ e sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP è principalmente non clusterizzato e distribuito lungo tutta la membrana del RE, come precedentemente osservato in sec31-1 GhLag1, mentre in sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP è simile a sec31-1. Questi risultati indicano che, oltre alla presenza di ceramide C26 nella membrana del RE, il clustering di Gas1-GFP necessita anche del legame al complesso p24 e non richiede il reclutamento specifico di Lst1. Abbiamo quindi esplorato la possibilità che la lunghezza della catena della ceramide nella membrana del RE possa regolare il legame di Gas1-GFP a p24. Tuttavia, abbiamo scoperto che la presenza di ceramide C18-C16 nella membrana non influenza i GPI-glicani ricostruiti dal complesso p24 (Figure S3 e S4, A e B) né il legame a GPI-AP e la capacità di esportare GPI-AP. Reclutare il sottotipo Lst1 di COPII (Figura S4C). Pertanto, il clustering dipendente dalla ceramide C26 non richiede interazioni proteiche con diversi meccanismi proteici di esportazione del RE, ma supporta un meccanismo di smistamento alternativo guidato dalla lunghezza dei lipidi. Quindi, abbiamo analizzato se la lunghezza della catena acilica della ceramide nella membrana del RE sia importante per l'efficace classificazione di Gas1-GFP come ERES selettivo. Poiché Gas1 nel ceppo GhLag1 con ceramide a catena corta lascia il RE ed entra nella membrana plasmatica (Figura S5), riteniamo che se lo smistamento è guidato dalla lunghezza della catena acilica della ceramide, Gas1 nel ceppo GhLag1 possa essere reindirizzato e incrociato. ERES con la stessa membrana.
(A) La membrana cellulare di GhLag1 contiene principalmente ceramidi C18-C16 più corte, mentre l'ancora GPI di Gas1-GFP presenta ancora la stessa IPC C26 delle cellule wild-type. Sopra: analisi della lunghezza della catena acilica della ceramide nella membrana cellulare dei ceppi wild-type (Wt) e GhLag1p mediante spettrometria di massa (MS). I dati rappresentano la percentuale di ceramide totale. Media di tre esperimenti indipendenti. Barra di errore = DS. T test non appaiato a due code. **** P <0,0001. Pannello inferiore: analisi MS della lunghezza della catena acilica dell'IPC presente nell'ancora GPI di Gas1-GFP (GPI-IPC) espressa nei ceppi wild-type e GhLag1p. I dati rappresentano la percentuale del segnale IPC totale. Media di cinque esperimenti indipendenti. Barra di errore = DS. T test non appaiato a due code. ns, non importante. P = 0,9134. (B) Micrografie a fluorescenza di cellule sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ e sec31-1lst1Δ che esprimono Gas1-GFP indotta da galattosio sono state incubate a 37 °C per 30 minuti e passate a Eseguire la microscopia a fluorescenza di routine dopo 24 °C. Freccia bianca: cluster Gas1-GFP del RE. Freccia aperta: Gas1-GFP non clusterizzato è distribuito sull'intera membrana del RE, mostrando la colorazione ad anello nucleare caratteristica del RE. Barra di scala, 5 μm. (C) Quantificazione della microfotografia descritta in (B). Percentuale media di cellule con struttura Gas1-GFP punteggiata. In tre esperimenti indipendenti, n ≥ 300 cellule. Barra di errore = DS. Test t non appaiato a due code. **** P < 0,0001.
Per risolvere direttamente questo problema, abbiamo eseguito la visualizzazione SCLIM di Gas1-GFP e Mid2-iRFP in GhLag1 con l'allele mutante sensibile alla temperatura sec31-1 (Figura 4 e filmato S4). Dopo che l'ER è stato mantenuto a 37 °C e successivamente rilasciato a 24 °C, la maggior parte del Gas1-GFP di nuova sintesi non era raggruppata e distribuita lungo la membrana dell'ER, come osservato dai microscopi convenzionali (Figura 4, A e B). Inoltre, un'ampia percentuale di ERES (67%) include due tipi di carico co-localizzati al suo interno (Figura 4D). I pannelli 1 e 2 della Figura 4C mostrano due tipici esempi di ERES con Gas1-GFP e Mid2-GFP sovrapposti. Inoltre, entrambi i prodotti sono stati reclutati nello stesso ERES (Figura 4E, pannello 3 e filmato S4). Pertanto, i nostri risultati indicano che la lunghezza della catena acilica della ceramide nella membrana del reticolo endoplasmatico è un fattore determinante per l'aggregazione e la classificazione delle proteine ​​del reticolo endoplasmatico.
Cellule Sec31-1 GhLag1 che esprimono secrezioni indotte da galattosio, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e Mid2-iRFP (TMP, blu) e Sec13-mCherry costitutivo marcato con ERES (ERES, magenta). Incubare a 37 °C. Continuare per 30 minuti, portare a 24 °C per rilasciare le secrezioni e acquisire l'immagine con SCLIM dopo 20 minuti. (Da A a C) Immagini di proiezione 2D rappresentative (A; barra di scala, 1 μm) o immagini 3D dell'emisfero cellulare (B e C; unità di scala, 0,45 μm) delle 10 sezioni z contrassegnate da carico ed ERES. Il pannello inferiore in (B) e il pannello in (C) mostrano immagini elaborate per visualizzare solo i beni presenti in ERES (magenta) [Gas1-GFP (grigio) e Mid2-iRFP (azzurro chiaro)]. (C) Freccia bianca piena: ERES, sovrapposizione dei beni. Freccia aperta: ERES contiene un solo elemento. Pannello inferiore: L'ERES selezionato presenta beni sovrapposti (1 e 2) contrassegnati in (C). Barra di scala, 100 nm. (D) Quantificazione della microfotografia descritta in (C). Nelle unità sec31-1 e sec31-1 GhLag1, è incluso un solo carico (Gas1-GFP o Mid2-iRFP) e la percentuale media di ERES per carico isolato e carico sovrapposto. In tre esperimenti indipendenti, n = 432 in 54 cellule (sec31-1) e n = 430 in 47 cellule (sec31-1 GhLag1). Barra di errore = DS. Test t non appaiato a due code. *** P = 0,0002 (sec31-1) e ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Immagine 3D di ERES selezionate con carico sovrapposto (3) contrassegnato in (C). Gas1-GFP (verde) e Mid2-iRFP (blu) si avvicinano all'ERES (magenta) dallo stesso lato e rimangono nella stessa area ristretta dell'ERES. Barra di scala, 100 nm.
Questo studio fornisce prove dirette in vivo che i carichi proteici a base lipidica sono classificati in siti di esportazione selettivi nella via secretoria e rivela l'importanza della lunghezza della catena acilica per la selettività della classificazione. Utilizzando una tecnica di microscopia potente e all'avanguardia chiamata SCLIM, abbiamo dimostrato la presenza di Gas1-GFP di nuova sintesi (un importante GPI-AP della membrana plasmatica con una porzione lipidica ceramidica a catena acilica molto lunga (C26)) nel lievito. Le regioni raggruppate in ER discreti sono associate a ERES specifici, mentre le proteine ​​secrete transmembrana sono distribuite in tutta la membrana dell'ER (Figura 1). Inoltre, questi due tipi di prodotti entrano selettivamente in ERES diversi (Figura 2). La lunghezza della catena acilica della ceramide cellulare nella membrana viene ridotta da C26 a C18-C16, il cluster Gas1-GFP viene interrotto nella regione discreta del RE e Gas1-GFP viene reindirizzato per lasciare il RE con la proteina transmembrana attraverso lo stesso ERES (Figura 3 e Figura 3). 4).
Sebbene GPI-AP utilizzi un meccanismo proteico specializzato per uscire dal RE, abbiamo scoperto che la separazione dipendente dalla ceramide C26 non si basa su interazioni proteiche differenziali che potrebbero portare alla specializzazione dell'ERES (Figure S4 e S5). Invece, i nostri risultati supportano un meccanismo di classificazione alternativo guidato dal clustering proteico basato sui lipidi e dalla successiva esclusione di altri carichi. Le nostre osservazioni indicano che la regione o il cluster Gas1-GFP associato a uno specifico ERES è privo della proteina transmembrana secreta Mid2-iRFP, il che indica che il cluster GPI-AP dipendente dalla ceramide C26 faciliterà il loro ingresso nell'ERES pertinente e, allo stesso tempo, escluderà le proteine ​​transmembrana secrete che entrano in questo specifico ERES (Figure 1 e 2). Al contrario, la presenza di ceramidi C18-C16 nella membrana del RE non causa la formazione di regioni o cluster da parte di GPI-AP, quindi non escludono o sostituiscono le proteine ​​transmembrana secrete nello stesso ERES (Figure 3 e 4). Pertanto, proponiamo che la ceramide C26 guidi la separazione e la classificazione facilitando il raggruppamento delle proteine ​​legate a specifici ERES.
Come ottenere questo clustering dipendente dalla ceramide C26 in un'area specifica del RE? La tendenza della ceramide di membrana a separarsi lateralmente può far sì che GPI-AP e ceramide C26 formino piccoli lipidi ordinati istantaneamente nell'ambiente lipidico più irregolare della membrana del RE contenente glicerolipidi più corti e insaturi. Cluster di qualità (17, 18). Questi piccoli cluster temporanei possono essere ulteriormente fusi in cluster più grandi e più stabili dopo il legame al complesso p24 (34). In linea con questo, abbiamo dimostrato che C26 Gas1-GFP deve interagire con il complesso p24 per formare cluster visibili più grandi (Figura 3). Il complesso p24 è un oligomero eterozigote composto da quattro diverse proteine ​​transmembrana p24 nel lievito (35), che fornisce un legame multivalente, che può portare al cross-linking di piccoli cluster GPI-AP, generando così cluster stabili più grandi (34). L'interazione tra gli ectodomini proteici delle GPI-AP può anche contribuire alla loro aggregazione, come dimostrato durante il loro trasporto tramite l'apparato di Golgi nelle cellule epiteliali polarizzate dei mammiferi (36). Tuttavia, quando la ceramide C18-C16 è presente nella membrana del RE, quando il complesso p24 si lega a Gas1-GFP, non si formeranno grandi cluster separati. Il meccanismo sottostante può dipendere dalle specifiche proprietà fisiche e chimiche della ceramide a catena acilica lunga. Studi biofisici su membrane artificiali mostrano che, sebbene sia le ceramidi a catena acilica lunga (C24) che quella corta (C18-C16) possano causare separazione di fase, solo le ceramidi a catena acilica lunga (C24) possono promuovere un'elevata curvatura e la flessione del film per rimodellarlo. Attraverso il riferimento reciproco (17, 37, 38). È stato dimostrato che l'elica transmembrana di TMED2, l'omologo umano di Emp24, interagisce selettivamente con la sfingomielina a base di ceramide C18 nei lobuli citoplasmatici (39). Utilizzando simulazioni di dinamica molecolare (MD), abbiamo scoperto che sia le ceramidi C18 che C26 si accumulano attorno ai lobuli citoplasmatici dell'elica transmembrana di Emp24 e hanno preferenze simili (Figura S6). Vale la pena notare che questo indica che l'elica transmembrana di Emp24 può portare a una distribuzione asimmetrica dei lipidi nella membrana. Questo è un risultato recente basato su cellule di mammifero. Simulazioni MD simili mostrano anche la presenza di lipidi eterei (40). Pertanto, ipotizziamo che la ceramide C26 nei due lobuli di ER26 sia localmente arricchita. Quando GPI-AP nei lobuli luminali si lega direttamente al p24 multivalente e l'accumulo di ceramide C26 attorno a p24 nei lobuli citoplasmatici, può promuovere l'aggregazione proteica e la curvatura della membrana che ne consegue vengono generate attraverso le dita (41), causando la separazione di GPI-AP in regioni discrete adiacenti all'ERES, che favorisce anche le regioni altamente curve della membrana dell'ER (42). Precedenti rapporti hanno supportato il meccanismo proposto (43, 44). Il legame multivalente di oligolectine, patogeni o anticorpi ai glicosfingolipidi a base di ceramide (GSL) sulla membrana plasmatica innesca una grande aggregazione di GSL, migliora la separazione di fase e causa la deformazione e l'internalizzazione della membrana (44). Iwabuchi ecc. (43) È stato scoperto che in presenza di catene aciliche lunghe (C24) ma non corte (C16), il ligando multivalente legato al lattosilceramide GSL induceva la formazione di grandi cluster e invaginazione della membrana, e la trasduzione del segnale mediata da Lyn nel citoplasma sui foglietti è interdigitata dalle catene aciliche nei neutrofili accoppiati.
Nelle cellule epiteliali polarizzate dei mammiferi, la concentrazione della rete anti-Golgi (TGN) a livello della membrana plasmatica apicale controlla la separazione e lo smistamento di GPI-AP (10, 45). Questa aggregazione è guidata dall'oligomerizzazione di GPI-AP (36), ma può anche dipendere dalla lunghezza della catena ceramidica che troviamo nel lievito. Sebbene la GPI-AP dei mammiferi abbia un'ancora lipidica eterea e la sua struttura chimica sia molto diversa dalla ceramide a catena acilica molto lunga, uno studio recente ha scoperto che entrambi i lipidi hanno proprietà fisiche e chimiche e funzioni evolutivamente simili (40). Pertanto, la parte lipidica eterea nelle cellule di mammifero può essere simile alla ceramide C26 del lievito e il suo ruolo è quello di associarsi alla ceramide a catena lunga nella membrana per promuovere l'aggregazione e lo smistamento di GPI-AP. Sebbene questa possibilità debba ancora essere testata direttamente, risultati precedenti supportano l'ipotesi che il trasporto della ceramide a catena acilica lunga all'apparato di Golgi non sia effettuato da proteine ​​di trasferimento citoplasmatiche, ma dipenda dalla sintesi di ancore GPI come quelle del lievito. Pertanto, il meccanismo conservativo evolutivo sembra essere in grado di co-trasportare selettivamente la ceramide a catena acilica molto lunga e GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) nella stessa vescicola di trasporto.
Nei sistemi di cellule epiteliali polarizzate di lievito e mammifero, l'aggregazione di GPI-AP e la separazione dalle altre proteine ​​della membrana plasmatica avvengono prima di raggiungere la superficie cellulare. Paladino et al. (48) hanno scoperto che sul TGN delle cellule epiteliali polarizzate di mammifero, il clustering di GPI-AP non è solo necessario per la classificazione selettiva delle GPI-AP sulla membrana plasmatica apicale, ma regola anche l'organizzazione del clustering delle GPI-AP e la sua attività biologica. Superficie cellulare. Nel lievito, questo studio ha dimostrato che il cluster di GPI-AP dipendente dalla ceramide C26 sul RE può regolare l'organizzazione del cluster e l'attività funzionale di GPI-AP sulla membrana plasmatica (24, 49). Coerentemente con questo modello, le cellule GhLag1 sono allergiche agli inibitori di GPI o ai farmaci che influenzano l'integrità della parete cellulare (28), e la necessità di cluster Gas1-GFP funzionali (49) della ceramide di punta proiettata nell'accoppiamento delle cellule di lievito indica possibili conseguenze fisiologiche delle cellule hLag1. Errore GPI-AP. Tuttavia, ulteriori verifiche per verificare se l'organizzazione funzionale della superficie cellulare sia stata programmata dal RE tramite un metodo di ordinamento basato sulla lunghezza dei lipidi saranno oggetto delle nostre future ricerche.
I ceppi di Saccharomyces cerevisiae utilizzati in questo lavoro sono elencati nella Tabella S1. I ceppi MMY1583 e MMY1635 di SCLIM per l'imaging di cellule vive sono stati costruiti sullo sfondo di W303. Questi ceppi che esprimono Sec13-mCherry con un tag proteico fluorescente sono stati costruiti utilizzando un metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) con il plasmide pFA6a come stampo (23). Il ceppo che esprime Mid2-iRFP marcato con proteina fluorescente sotto il controllo del promotore GAL1 è stato costruito come segue. Amplificazione PCR della sequenza iRFP-KanMx dal vettore pKTiRFP-KAN (dono di E. O'Shea, plasmide Addgene numero 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificatore della risorsa di ricerca (RRID): Addgene_64687) e inserito nel C-terminale di Mid2 endogeno. Dopo che la sequenza del genoma Mid2-iRFP è stata amplificata e clonata nel promotore GAL1, è stata integrata nel sito Not I-Sac I del plasmide di integrazione pRS306. Il plasmide risultante pRGS7 è stato linearizzato con Pst I per integrarsi nel locus URA3.
Il gene di fusione Gas1-GFP è espresso sotto il controllo del promotore GAL1 nel plasmide centromerico (CEN), che è costruito come segue. La sequenza Gas1-GFP è stata amplificata mediante PCR dal plasmide pRS416-GAS1-GFP (24) (dono di L. Popolo) e clonata nel sito Xma I–Xho I del plasmide CEN pBEVY-GL LEU2 (dono di C). Miller; Addgene plasmide numero 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Il plasmide risultante è stato denominato pRGS6. Anche il gene di fusione Axl2-GFP è espresso sotto il controllo del promotore GAL1 del vettore pBEVY-GL LEU2 e la sua costruzione è la seguente. La sequenza Axl2-GFP è stata amplificata dal plasmide pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) mediante PCR e clonata nel sito Bam HI-Pst I del vettore pBEVY-GL LEU2. Il plasmide risultante è stato denominato pRGS12. La sequenza degli oligonucleotidi utilizzati in questo studio è elencata nella Tabella S2.
Il ceppo è stato integrato con lo 0,2% di adenina e il 2% di glucosio [YP-destrosio (YPD)], il 2% di raffinosio [YP-raffinosio], il 2% di estratto di lievito ricco di proteine ​​p (YP) (1% di estratto di lievito e 2% di proteine ​​ept). (YPR)] o il 2% di galattosio [YP-galattosio (YPG)] come fonte di carbonio, o in un mezzo minimo sintetico (0,15% di base di azoto di lievito e 0,5% di solfato di ammonio) per integrare gli amminoacidi e le basi appropriati necessari per la nutrizione, e contenente il 2% di glucosio (mezzo minimo di glucosio sintetico) o il 2% di galattosio (mezzo minimo di galattosio sintetico) come fonte di carbonio.
Per l'imaging in tempo reale, cellule mutanti sec31-1 sensibili alla temperatura che esprimevano il costrutto sotto il promotore GAL1 sono state coltivate in terreno di coltura YPR a 24 °C per tutta la notte fino alla fase logaritmica media. Dopo l'induzione in YPG a 24 °C per 1 ora, le cellule sono state incubate in SG a 37 °C per 30 minuti, quindi trasferite a 24 °C per il rilascio dal blocco di secrezione. La concanavalina A è stata utilizzata per fissare le cellule su un vetrino e acquisite mediante SCLIM. SCLIM è una combinazione di microscopio a fluorescenza invertito Olympus IX-71 e lente a olio ad apertura numerica UPlanSApo 100×1,4 (Olympus), scanner confocale a disco rotante ad alta velocità e con elevato rapporto segnale/rumore (Yokogawa Electric), spettrometro personalizzato e raffreddamento personalizzato. L'intensificatore di immagine del sistema (Hamamatsu Photonics) può fornire un sistema di lenti di ingrandimento con un ingrandimento finale di ×266,7 e una fotocamera con dispositivo ad accoppiamento di carica che moltiplica gli elettroni (Hamamatsu Photonics) (21). L'acquisizione delle immagini viene eseguita da un software personalizzato (Yokogawa Electric). Per le immagini 3D, abbiamo utilizzato un attuatore piezoelettrico personalizzato per far vibrare verticalmente la lente dell'obiettivo e abbiamo raccolto le parti ottiche a 100 nm di distanza in uno stack. L'immagine Z-stack viene convertita in dati voxel 3D e la funzione di diffusione del punto teorica utilizzata per il microscopio confocale a disco rotante viene utilizzata per l'elaborazione della deconvoluzione dal software Volocity (PerkinElmer). Utilizzando il software Volocity per la soglia automatica per l'analisi di co-localizzazione, è stata misurata l'ERES, incluso il carico. L'analisi di scansione lineare è stata eseguita utilizzando il software MetaMorph (Molecular Devices).
Utilizzare il software GraphPad Prism per determinare la significatività statistica. Per il test t di Student a due code e il test di analisi della varianza (ANOVA) unidirezionale, si ritiene che le differenze tra i gruppi abbiano un impatto significativo su P <0,05 (*).
Per la microscopia a fluorescenza di Gas1-GFP, le cellule in fase logaritmica sono state coltivate durante la notte in YPD e raccolte per centrifugazione, lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato e incubate su ghiaccio per almeno 15 minuti, quindi sono state sottoposte al microscopio come precedentemente descritto Check (24). Per l'acquisizione è stato utilizzato il microscopio Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) dotato di obiettivo, filtro L5 (GFP), fotocamera Hamamatsu e software Application Suite X (LAS X).
I campioni sono stati denaturati con tampone campione SDS a 65 °C per 10 minuti e quindi separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide-SDS (PAGE). Per l'analisi di immunoblotting, sono stati caricati 10 μl di campione per corsia. Anticorpo primario: utilizzare anticorpo policlonale di coniglio anti-Gas1 a una diluizione di 1:3000, anticorpo policlonale di coniglio anti-Emp24 a una diluizione di 1:500 e anticorpo policlonale di coniglio anti-GFP (dono di H. Riezman) a una diluizione di 1:3000. L'anticorpo monoclonale di topo anti-Pgk1 è stato utilizzato a una diluizione di 1:5000 (dono di J. de la Cruz). Anticorpo secondario: immunoglobulina G (IgG) di capra anti-coniglio coniugata con perossidasi di rafano (HRP) utilizzata a una diluizione di 1:3000 (Pierce). È stato utilizzato un anticorpo di capra anti-topo IgG coniugato con HRP a una diluizione di 1:3000 (Pierce). La zona di risposta immunitaria è stata osservata mediante il metodo di chemiluminescenza del reagente SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Come descritto in (31), è stato eseguito un esperimento di immunoprecipitazione naturale sulla frazione ER arricchita. In breve, le cellule di lievito sono state lavate con tampone TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro e miscela di inibitori della proteasi] a 600 nm (OD600) a densità ottica 100 per due volte. Il campione è stato rotto con biglie di vetro, quindi i detriti cellulari e le biglie di vetro sono stati rimossi mediante centrifugazione. Il surnatante è stato quindi centrifugato a 17.000 g per 15 minuti a 4 °C. Il pellet è stato risospeso in TNE e la saponina digitale è stata aggiunta fino a una concentrazione finale dell'1%. La sospensione è stata incubata per 1 ora con rotazione a 4 °C, quindi i componenti insolubili sono stati rimossi mediante centrifugazione a 13.000 g a 4 °C per 60 minuti. Per l'immunoprecipitazione Gas1-GFP, preincubare prima il campione con sfere di agarosio vuote (ChromoTek) a 4 °C per 1 ora, quindi incubare con GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 °C per 3 ore. Le sfere immunoprecipitate sono state lavate cinque volte con TNE contenente lo 0,2% di digossigenina, eluite con tampone campione SDS, separate su SDS-PAGE e analizzate mediante immunoblotting.
Come descritto in (31), la determinazione della reticolazione è stata eseguita sulla frazione ER arricchita. In breve, la frazione ER arricchita è stata incubata con 0,5 mM di ditiobis(succinimidil propionato) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20 °C, 20 min). La reazione di reticolazione è stata bloccata aggiungendo glicina (concentrazione finale 50 mM, 5 minuti, 20 °C).
Come precedentemente descritto (50), è stata eseguita l'analisi MS della ceramide nei ceppi wild-type e GhLag1. In breve, le cellule sono state coltivate fino alla fase esponenziale (da 3 a 4 unità OD600/ml) in YPD a 30°C e sono state raccolte 25×107 cellule. Il loro metabolismo è stato bloccato con acido tricloroacetico. Utilizzare il solvente di estrazione [etanolo, acqua, etere, piridina e idrossido di ammonio 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] e 1,2 nmol di standard interno C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) di qualità). Utilizzare il reagente monometilamminico [metanolo, acqua, n-butanolo e soluzione di metilammina (4:3:1:5 v/v)] per eseguire una leggera idrolisi alcalina dell'estratto, quindi utilizzare n-butanolo saturo d'acqua per la desalinizzazione. Infine, l'estratto è stato risospeso in un solvente in modalità positiva [cloroformio/metanolo/acqua (2:7:1) + acetato di ammonio 5 mM] e iniettato nello spettrometro di massa. È stato eseguito il monitoraggio multi-reazione (MRM) per l'identificazione e la quantificazione delle molecole di sfingolipidi. Lo spettrometro di massa a quadrupolo terziario TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) è dotato di una sorgente ionica robotica a nanoflusso Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) per l'analisi dei lipidi. L'energia di collisione è ottimizzata per ciascuna categoria di ceramide. I dati MS sono stati ottenuti in modalità positiva. Per ogni replica biologica, il segnale lipidico è la mediana di tre misurazioni indipendenti.
Come descritto in (31), le cellule (800×107) che esprimono Gas1-GFP sono state sottoposte a immunoprecipitazione naturale. La Gas1-GFP purificata è stata separata mediante SDS-PAGE e trasferita su una membrana di polivinilidenfluoruro (PVDF). La proteina è stata visualizzata colorando il PVDF con nero ammidico. La banda Gas1-GFP è stata tagliata dal PVDF e lavata 5 volte con metanolo e una volta con acqua di grado per cromatografia liquida-MS (LC-MS). Incubando la striscia di membrana con 500 μl di NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampone e 500 μl di miscela di nitrito di sodio 1 M appena sciolta a 37 °C per 3 ore, la frazione lipidica viene rilasciata da Gas1-GFP e lisata. Rilascio di inosina fosfato ceramide tra glucosamina e inositolo (51). Successivamente, la striscia di membrana è stata lavata quattro volte con acqua di grado LC-MS, essiccata a temperatura ambiente e conservata in atmosfera di azoto a -80 °C fino all'analisi. Come controllo, è stato utilizzato un campione bianco di membrana PVDF per ciascun esperimento. Il lipide estratto da Gas1-GFP è stato quindi analizzato mediante spettroscopia di massa (MS) come descritto (50). In breve, le strisce di PVDF contenenti GPI-lipide sono state risospese in 75 μl di solvente per muffa negativo [cloroformio/metanolo (1:2) + 5 mM di acetato di ammonio] e sottoposte all'analisi di ionizzazione elettrospray (ESI)-MRM/MS delle specie di sfingolipidi (TSQ Vantage). In questo caso, i dati MS sono stati ottenuti in modalità ioni negativi.
Come accennato in precedenza, la porzione lipidica dell'ancora GPI è stata separata dal GPI-AP marcato con [3H]-inositolo (16). I lipidi sono stati separati mediante cromatografia su strato sottile utilizzando un sistema solvente (55:45:10 cloroformio-metanolo-0,25% KCl) e visualizzati utilizzando FLA-7000 (Fujifilm).
Le cellule esprimenti Gas1-GFP (600×107) sono state lavate due volte con tampone TNE e rotte con biglie di vetro, quindi centrifugate per rimuovere detriti cellulari e biglie di vetro. Il surnatante è stato quindi centrifugato a 17.000 g per 1 ora a 4 °C. Il pellet è stato lavato in TNE e incubato con 1 U di PI-PLC (Invitrogen) in TNE contenente lo 0,2% di saponina digitale per 1 ora a 37 °C. Dopo il trattamento enzimatico, la membrana è stata rimossa mediante centrifugazione a 17.000 g a 4 °C per 1 ora. Per immunoprecipitare Gas1-GFP, il surnatante è stato incubato con GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 °C per una notte. La Gas1-GFP purificata, separata mediante SDS-PAGE, è stata colorata con blu brillante di Coomassie. La banda di colorazione Gas1-GFP è stata separata dal grigio circostante l'acquedotto e, dopo alchilazione con iodoacetamide e riduzione con ditiotreitolo, è stata eseguita la digestione in gel con tripsina. Estrarre e seccare i peptidi triptici e i peptidi con GPI-glicani. Il peptide essiccato è stato sciolto in 20 μl di acqua. Iniettare una porzione (8 μl) nella LC. Una colonna di ottadecilsilano (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diametro interno 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Prefettura di Aichi, Giappone) è stata utilizzata per separare i peptidi in specifiche condizioni di gradiente. La fase mobile è costituita dal solvente A (acido formico allo 0,08%) e dal solvente B (acido formico allo 0,15% in acetonitrile all'80%). Un sistema HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) è stato utilizzato per eluire la colonna con il solvente A entro 55 minuti a una portata di 50 μl min-1 per 5 minuti, quindi la concentrazione del solvente B è stata aumentata al 40%. , Stati Uniti). L'eluato è stato introdotto in continuo nella sorgente ionica ESI e i peptidi triptici e i peptidi con GPI-glicani sono stati analizzati mediante LTQ Orbitrap XL (spettrometro di massa ibrido a trappola ionica lineare-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Nella configurazione MS, la tensione della sorgente capillare è stata impostata a 4,5 kV e la temperatura del capillare di trasferimento è stata mantenuta a 300 °C. La tensione del capillare e la tensione della lente del tubo sono state impostate rispettivamente a 15 V e 50 V. I dati MS sono stati ottenuti in modalità ionica positiva (risoluzione di 60.000; accuratezza di massa di 10 parti per milione) in un intervallo di massa di 300/m/z rapporto massa/carica (m/z) 3000. I dati MS/MS sono ottenuti tramite la trappola ionica nell'LTQ Orbitrap XL [le prime 3 cifre da cui dipendono i dati, dissociazione indotta da collisione (CID)].
Le simulazioni MD sono state eseguite utilizzando il software GROMACS (52) e il campo di forza MARTINI 2 (53-55). Il CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) è stato quindi utilizzato per costruire un doppio strato contenente dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) e Cer C18 o DOPC e Cer C26. La topologia e le coordinate di Cer C26 sono derivate da DXCE rimuovendo le sfere extra dalla coda di sfingosina. Utilizzare il processo descritto di seguito per bilanciare il doppio strato ed eseguirlo, quindi utilizzare le ultime coordinate del sistema per costruire un sistema contenente Emp24. Il dominio transmembrana di Emp24 di lievito (residui da 173 a 193) è stato costruito come un'α-elica utilizzando la struttura molecolare dello strumento MD visivo (VMD) (58). Quindi, dopo aver rimosso i lipidi sovrapposti, la proteina è stata granulata grossolanamente e inserita nel doppio strato utilizzando CHARMM GUI. Il sistema finale contiene 1202 DOPC e 302 Cer C26 oppure 1197 DOPC e 295 Cer C18 ed Emp24. Ionizzare il sistema a una concentrazione di 0,150 M. Sono state effettuate quattro repliche indipendenti per due composizioni a doppio strato.
Il doppio strato lipidico viene bilanciato utilizzando il processo CHARMM GUI, che prevede la minimizzazione e il successivo bilanciamento di 405.000 passaggi, in cui i vincoli di posizione vengono gradualmente ridotti ed eliminati e il passo temporale viene aumentato da 0,005 ps a 0,02 ps. Dopo l'equilibratura, produce 6 µs con un passo temporale di 0,02 ps. Dopo aver inserito Emp24, utilizzare lo stesso processo CHARMM GUI per minimizzare e bilanciare il sistema, quindi eseguire il processo in produzione per 8 s.
Per tutti i sistemi, durante il processo di bilanciamento, la pressione è controllata dal barostato Berendsen (59), mentre durante il processo di produzione è controllata dal barostato Parrinello-Rahman (60). In tutti i casi, la pressione media è di 1 bar e viene utilizzato uno schema di accoppiamento di pressione semi-isotropico. Nel processo di bilanciamento e produzione, un termostato (61) con ricalibrazione della velocità viene utilizzato per accoppiare la temperatura rispettivamente delle particelle proteiche, lipidiche e di solvente. Durante l'intera operazione, la temperatura target è di 310 K. L'interazione di non legame viene calcolata generando una lista di accoppiamento utilizzando lo schema Verlet con tolleranza del tampone di 0,005. Il termine di Coulomb viene calcolato utilizzando il campo di reazione e una distanza di cut-off di 1,1 nm. Il termine di Vander Waals utilizza uno schema di cut-off con una distanza di cut-off di 1,1 nm e lo schema di cut-off Verlet viene utilizzato per la deriva del potenziale (62).
Utilizzando la VMD, la lunghezza d'onda di taglio tra le sfere di fosfato DOPC o le sfere di ceramide AM1 e la proteina è di 0,7 nm e viene calcolato il numero di lipidi che interagiscono con la proteina. Secondo la seguente formula, calcolare il fattore di deplezione-arricchimento (DE) come in (63): fattore DE = (la quantità di lipidi totali nella proteina 0,7) nella proteina 0,7 (la quantità di Cer nei lipidi totali)
Il valore riportato è ottenuto come media e le barre di errore sono quattro copie indipendenti di SE. La significatività statistica del fattore DE è calcolata tramite il test t [(media fattore DE-1)/SE]. Calcolare il valore P dalla distribuzione unilaterale.
Lo strumento GROMACS è stato utilizzato per calcolare la mappa di densità laterale 2D del sistema contenente Emp24 negli ultimi 250 ns della traccia. Per ottenere la mappa di arricchimento/deplezione della ceramide, la mappa di densità di Cer viene divisa per la somma della mappa di Cer e DOPC, e poi divisa per la concentrazione di Cer nel corpo. Viene utilizzata la stessa scala di colori della mappa.
Per materiali supplementari per questo articolo, vedere http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
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