Lo smistamento delle proteine ​​nel percorso secretorio è essenziale per il mantenimento della compartimentalizzazione cellulare e dell'omeostasi. Oltre allo smistamento mediato dalla membrana cellulare, il ruolo dei lipidi nello smistamento della chinesina nel processo di trasporto secretorio è un quesito fondamentale di lunga data che non ha ancora trovato risposta. In questo studio, abbiamo eseguito un'imaging tridimensionale simultanea multicolore ad alta risoluzione in tempo reale per dimostrare in vivo che le proteine ​​di nuova sintesi immobilizzate nel glicosilfosfatidilinositolo, con porzioni lipidiche di ceramide molto lunghe, vengono raggruppate e classificate in siti di uscita specializzati del reticolo endoplasmatico, diversi da quelli utilizzati dalle proteine ​​transmembrana. Inoltre, dimostriamo che la lunghezza della catena di ceramide nella membrana del reticolo endoplasmatico è fondamentale per questa selettività di smistamento. Il nostro studio fornisce la prima prova diretta in vivo per classificare i carichi proteici in base alla lunghezza della catena lipidica in siti di esportazione selettivi nel percorso secretorio.
Nelle cellule eucariotiche, le proteine ​​sintetizzate nel reticolo endoplasmatico (RE) vengono quindi smistate durante il trasporto attraverso la via secretoria per essere consegnate alla loro destinazione cellulare appropriata (1). Oltre allo smistamento mediato dal rivestimento, si è a lungo ipotizzato che alcuni lipidi possano anche fungere da punti di uscita selettivi raggruppandoli in domini di membrana specifici per determinate proteine ​​(2-5). Tuttavia, manca ancora una prova diretta in vivo per dimostrare questo possibile meccanismo basato sui lipidi. Per risolvere questo problema fondamentale, abbiamo studiato nel lievito come le proteine ​​ancorate al glicosilfosfatidilinositolo (GPI-AP) vengano esportate in modo differenziale dal RE. Le GPI-AP sono una varietà di proteine ​​di superficie cellulare connesse ai lipidi (6, 7). Le GPI-AP sono proteine ​​secrete attaccate ai foglietti esterni della membrana plasmatica attraverso la porzione glicolipidica (ancora GPI). Accettano ancore GPI come modifiche post-traduzionali conservative nel lume del RE (8). Dopo l'attacco, il GPI-AP passa attraverso l'apparato di Golgi (5, 9) dal reticolo endoplasmatico alla membrana plasmatica. La presenza di ancore GPI fa sì che il GPI-AP venga trasportato separatamente dalle proteine ​​secrete transmembrana (incluse altre proteine ​​della membrana plasmatica) lungo la via secretoria (5, 9, 10). Nelle cellule di lievito, i GPI-AP vengono separati dalle altre proteine ​​secrete nel reticolo endoplasmatico e quindi impacchettati in vescicole uniche avvolte dal complesso proteico di rivestimento II (COPII) (6, 7). I determinanti di questo processo di classificazione nel processo di esportazione dal reticolo endoplasmatico non sono chiari, ma si ipotizza che questo meccanismo possa richiedere i lipidi, in particolare il rimodellamento strutturale della porzione lipidica dell'ancora GPI (5, 8). Nel lievito, il rimodellamento lipidico del GPI inizia immediatamente dopo l'attacco del GPI e, in molti casi, fa sì che la ceramide si leghi all'acido grasso saturo a catena lunga a 26 atomi di carbonio (C26:0) (11, 12). La ceramide C26 è la principale ceramide prodotta finora dalle cellule di lievito. Viene sintetizzata nel reticolo endoplasmatico (RE) e la maggior parte viene esportata nell'apparato di Golgi attraverso vescicole COPII (13). L'esportazione di GPI-AP dal RE richiede specificamente una sintesi continua di ceramide (14, 15) e, a sua volta, la conversione della ceramide in inositolo fosfato ceramide (IPC) nell'apparato di Golgi dipende dalla sintesi dell'ancora GPI (16). Studi biofisici con membrane artificiali hanno dimostrato che le ceramidi a catena acilica molto lunga possono coalescere per formare domini ordinati con proprietà fisiche uniche (17, 18). Questi dati portano all'ipotesi che la ceramide C26 e il GPI-AP con ceramide C26 utilizzino le loro proprietà fisiche per coalescere in regioni ordinate o regioni nell'ambiente lipidico relativamente disordinato della membrana del RE. È composta principalmente da glicerolipidi corti e insaturi (C16:1 e C18:1) (19, 20). Queste regioni saranno focalizzate selettivamente su specifici siti di uscita del reticolo endoplasmatico (ERES), dove la ceramide e il GPI-AP a base di ceramide possono essere cotrasportati al Golgi nella stessa vescicola COPII dedicata (5).
In questo studio, abbiamo testato direttamente questo meccanismo basato sui lipidi utilizzando la microscopia confocale a super-risoluzione in tempo reale (SCLIM), una tecnica di microscopia all'avanguardia che può osservare simultaneamente le proteine ​​marcate fluorescentemente. Le immagini tridimensionali (3D) e a tre colori hanno una risoluzione e una velocità estremamente elevate nelle cellule viventi (21, 22).
Abbiamo applicato per la prima volta la tecnologia SCLIM per definire ulteriormente come il GPI-AP normale con gruppo ceramide C26 venga separato dalle proteine ​​secrete transmembrana dopo aver lasciato il reticolo endoplasmatico in S. cerevisiae. Per verificare la classificazione del reticolo endoplasmatico, abbiamo utilizzato un sistema genetico in grado di visualizzare direttamente il carico di nuova sintesi che entra nell'ERES in vivo (7, 23). Come carico, abbiamo scelto il GPI-AP Gas1 a base di ceramide C26 marcato con proteina fluorescente verde (GFP) e la proteina secreta transmembrana Mid2 marcata con proteina fluorescente nel vicino infrarosso (iRFP), entrambe dirette alla membrana plasmatica (24-26). Nel mutante termosensibile sec31-1, questi due carichi sono espressi sotto un promotore inducibile dal galattosio e un marcatore ERES costitutivo. A temperature estreme (37°C), poiché la mutazione sec31-1 influenza la funzione del componente del rivestimento COPII Sec31 per inibire la germinazione COPII e l'esportazione dall'ER, il carico di nuova sintesi si accumula nell'ER (23). Dopo il raffreddamento a bassa temperatura (24°C), le cellule mutanti sec31-1 si sono riprese dall'area secretoria e il nuovo carico sintetico accumulato ha iniziato ad essere esportato dall'ER. La visualizzazione CLIM ha mostrato che la maggior parte del Gas1-GFP e del Mid2-iRFP di nuova sintesi si accumulavano ancora nell'ER delle cellule mutanti sec31-1 dopo l'incubazione a 37°C e poi venivano rilasciati a 24°C per 5 minuti (Figura 1). Poiché il Mid2-iRFP è distribuito sull'intera membrana dell'ER e il Gas1-GFP è concentrato e raccolto nell'area discontinua della membrana dell'ER, la loro distribuzione è completamente diversa (Figura 1, da A a C e Video S1). Inoltre, come mostrato nella Figura 1D, il cluster Gas1-GFP non ha Mid2-iRFP. Questi risultati indicano che le proteine ​​GPI-AP e transmembrana sono state separate in diverse regioni della membrana del reticolo endoplasmatico precocemente. Il cluster Gas1-GFP è adiacente a uno specifico ERES etichettato con la proteina di rivestimento COPII di mCherry Sec13 (Figura 1, E e F, e video S1) (23).
Le cellule sec31-1 esprimono secrezioni indotte dal galattosio, una ceramide a catena acilica lunga (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e la proteina transmembrana Mid2-iRFP (TMP, blu) e questa marcatura ERES costruttiva Sec13-mCherry (ERES, magenta) è stata incubata a 37 °C per 30 minuti, spostata a 24 °C e visualizzata tramite SCLIM 5 minuti dopo. (Da A a C) mostra un'immagine 2D rappresentativa, combinata o singola, di un piano (A), un'immagine di proiezione 2D di 10 sezioni z (B) o un'immagine 3D di un emisfero cellulare del carico e dei marcatori ERES (C). Barra di scala 1 μm (A e B). L'unità di scala è 0,551 μm (C). Gas1-GFP è stato rilevato in regioni o cluster discreti del reticolo endoplasmatico, mentre Mid2-iRFP è stato rilevato e distribuito in tutta la membrana del reticolo endoplasmatico (C). (D) Il grafico mostra l'intensità di fluorescenza relativa di Gas1-GFP e Mid2-iRFP nel cluster di Gas1-GFP lungo la linea della freccia bianca (a sinistra). AU, unità arbitraria. (E e F) rappresentano l'immagine 3D che combina il marchio Goods e ERES. I cluster di Gas1-GFP sono stati rilevati vicino allo specifico ERES. L'unità di scala è 0,551 μm. (F) La freccia bianca continua indica il cluster di Gas1-GFP associato a ERES. I pannelli centrale e destro mostrano l'immagine 3D ingrandita e unita e una vista ruotata del cluster di Gas1-GFP selezionato.
La stretta relazione spaziale tra il cluster Gas1-GFP e uno specifico ERES indica che Gas1-GFP può entrare in ERES selettivi, il che è diverso dalla selettività utilizzata da Mid2-iRFP per lasciare il reticolo endoplasmatico. Per affrontare questa possibilità, abbiamo quantificato il rapporto ERES per solo uno o due carichi (Figura 2, da A a C). Abbiamo scoperto che la maggior parte degli ERES (70%) contiene un solo tipo di carico. L'immagine in basso della Figura 2C mostra due esempi tipici di ERES con solo Gas1-GFP (Figura 1) o solo Mid2-iRFP (Figura 2). Al contrario, circa il 20% degli ERES contiene due carichi che si sovrappongono nella stessa area. È stato scoperto che alcuni ERES (10%) contenevano due tipi di carico, ma erano isolati in aree chiaramente diverse. Pertanto, questa analisi statistica mostra che dopo l'esportazione dal reticolo endoplasmatico, GPI-AP Gas1-GFP e il carico transmembrana Mid2-iRFP vengono divisi in ERES diversi (Figura 2D). Questa efficienza di smistamento è molto coerente con la precedente analisi biochimica (6) e determinazione morfologica (7). Possiamo anche osservare il comportamento del carico in quarantena che entra nell'ERES (Figura 2E e Video S2). La Figura 2E mostra che solo una piccola porzione di Gas1-GFP (pannello 3) o Mid2-iRFP (pannello 4) entra nell'ERES da un lato ed è confinata in un'area discreta. Il pannello 5 della Figura 2E mostra che Gas1-GFP e Mid2-iRFP si trovano talvolta nello stesso ERES, ma entrano da lati diversi e sono concentrati in regioni separate che possono rappresentare diverse vescicole COPII. Abbiamo anche confermato che la separazione e la classificazione osservate di Gas1 GPI-AP a base di ceramide C26 come ERES selettivo sono specifiche perché un altro carico di secrezione transmembrana, la proteina della membrana plasmatica Axl2 marcata con GFP (27), mostra un comportamento simile a Mid2-iRFP. (Immagine S1 e Video S3). La proteina Axl2-GFP di nuova sintesi si distribuisce attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico come Mid2-iRFP (Figura S1, A e B) ed è co-localizzata con Mid2-iRFP nella maggior parte degli ERES (Figura S1, da B a D). I pannelli 1 e 2 della Figura 1. S1C mostrano due esempi tipici di ERES in cui due carichi transmembrana si sovrappongono. In questi casi, entrambi i carichi entrano negli ERES insieme (Figura S1E, pannello 3 e Video S3).
Le cellule sec31-1 che esprimono secrezioni inducibili dal galattosio, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e Mid2-iRFP (TMP, blu) e marcatura costitutiva ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) sono state poste a 37 °C. Dopo un'incubazione di 30 minuti a °C, spostare a 24 °C per rilasciare il blocco di secrezione e acquisire immagini con SCLIM dopo 20 minuti. (Da A a C) Immagini di proiezione 2D rappresentative (A; barra di scala, 1 μm) o immagini 3D di emisferi cellulari (B e C; unità di scala, 0,456 μm) del carico e 10 sezioni z contrassegnate da ERES. Il pannello inferiore in (B) e il pannello in (C) mostrano immagini elaborate per visualizzare solo i prodotti presenti in ERES (magenta) [Gas1-GFP (grigio) e Mid2-iRFP (azzurro)]. (C) Freccia vuota: ERES trasporta un solo carico (da 1 a 4). Freccia grigia: ERES contiene carico segregato (5). Freccia bianca piena: ERES contenente carico co-localizzato. Sotto: il singolo ERES selezionato contiene solo Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Barra di scala, 100 nm. (D) Quantificazione della microfotografia descritta in (C). Percentuale media di ERES che contiene un solo carico (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), carico segregato e carico sovrapposto. In tre esperimenti indipendenti, n=432 in 54 cellule. Barra di errore = DS. Test t non accoppiato a due code. *** P = 0,0002. (E) Immagine 3D di un ERES selezionato del carico in quarantena contrassegnato con (C). Gas1-GFP (verde) (3) o Mid2-iRFP (blu) (4) entra nell'ERES (magenta) da un lato ed è confinato in una piccola area all'interno dell'ERES. Talvolta, entrambi i tipi di carico entrano nello stesso ERES (5) dallo stesso lato e sono confinati in un'area isolata all'interno dell'ERES. Barra di scala, 100 nm.
Successivamente, abbiamo testato un'ipotesi secondo cui la ceramide a catena acilica lunga (C26) presente nella membrana dell'ER guida l'aggregazione e lo smistamento specifici di Gas1 in ERES selettivi. A tal fine, abbiamo utilizzato un ceppo di lievito modificato GhLag1, in cui le due ceramide sintasi endogene Lag1 e Lac1 sono state sostituite da GhLag1 (l'omologo di Lag1 del cotone), ottenendo un ceppo di lievito con una ceramide della membrana cellulare più corta del tipo selvatico (Figura 3A) (28). L'analisi mediante spettrometria di massa (MS) ha mostrato che nei ceppi di tipo selvatico, il 95% della ceramide totale è ceramide a catena molto lunga (C26), mentre in GhLag1, l'85% della ceramide è molto lunga (C18 e C16). ), solo il 2% della ceramide è ceramide a catena molto lunga (C26). Sebbene le ceramidi C18 e C16 siano le principali ceramidi rilevate finora nella membrana GhLag1, l'analisi MS ha anche confermato che l'ancora GPI di Gas1-GFP espresso nel ceppo GhLag1 contiene ceramide C26, che è paragonabile ai lipidi di tipo selvatico. La qualità è la stessa (Fig. 3A) (26). Pertanto, ciò significa che l'enzima di rimodellamento della ceramide Cwh43 è altamente selettivo per la ceramide C26, come mostrato nella Figura 26, incorpora preferenzialmente l'ancora GPI da una piccola quantità di ceramide C26 nel ceppo GhLag1. S2 (29). Tuttavia, la membrana cellulare di GhLag1 contiene fondamentalmente solo ceramide C18-C16, mentre Gas1-GFP ha ancora ceramide C26. Questo fatto rende questo ceppo uno strumento ideale per risolvere specificamente il problema della lunghezza della catena acilica della ceramide di membrana nel RE. Il ruolo ipotetico della classe e dello smistamento. Successivamente, abbiamo studiato la capacità di C26 Gas1-GFP di accumularsi in cluster in GhLag1 con un allele mutante termosensibile di sec31-1 mediante microscopia a fluorescenza convenzionale, dove solo la catena lunga (C18-C16) è presente nella ceramide della membrana del reticolo endoplasmatico (Fig. 3). Abbiamo osservato che in sec31-1, la maggior parte di Gas1-GFP era concentrata in cluster, mentre Gas1-GFP in sec31-1 GhLag1 con la ceramide lunga (C18-C16) della membrana del reticolo endoplasmatico non era principalmente raggruppata e distribuita nell'intera membrana del reticolo endoplasmatico. Per essere precisi, poiché l'aggregazione basata sulla ceramide C26 è strettamente correlata a specifici ERES (Figura 1), abbiamo quindi indagato se questo processo potesse coinvolgere anche la funzione del meccanismo di esportazione delle proteine ​​del reticolo endoplasmatico. GPI-AP utilizza uno speciale sistema COPII per l'esportazione dal reticolo endoplasmatico, che è attivamente regolato dal rimodellamento strutturale della porzione glicanica dell'ancora GPI da parte di Ted1 (30, 31). Il glicano GPI ricombinante viene quindi riconosciuto dal complesso recettore di carico transmembrana p24, che a sua volta recluta selettivamente Lst1, che è un'isoforma specifica della principale subunità di legame del carico COPII Sec24, formando vescicole COPII ricche di GPI-AP (31-33). Pertanto, abbiamo costruito un doppio mutante che combinava la delezione di queste singole proteine ​​(il componente del complesso p24 Emp24, l'enzima di rimodellamento del glicano GPI Ted1 e la subunità COPII specifica Lst1) con il ceppo mutante sec31-1 e abbiamo studiato se fosse possibile formare il cluster Gas1-GFP (Figura 3). Abbiamo osservato che in sec31-1emp24Δ e sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP è principalmente non aggregato e distribuito in tutta la membrana del RE, come precedentemente visto in sec31-1 GhLag1, mentre in sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP è simile a sec31-1. Questi risultati indicano che, oltre alla presenza di ceramide C26 nella membrana del RE, l'aggregazione di Gas1-GFP necessita anche del legame al complesso p24 e non richiede il reclutamento specifico di Lst1. Abbiamo quindi esplorato la possibilità che la lunghezza della catena di ceramide nella membrana del RE possa regolare il legame di Gas1-GFP a p24. Tuttavia, abbiamo scoperto che la presenza di ceramide C18-C16 nella membrana non influenza i glicani GPI ricostruiti dal complesso p24 (Figure S3 e S4, A e B) o il legame a GPI-AP e l'esportazione di GPI-AP. Recluta il sottotipo COPII Lst1 (Figura S4C). Pertanto, il clustering dipendente dalla ceramide C26 non richiede interazioni proteiche con diversi meccanismi di esportazione delle proteine ​​del reticolo endoplasmatico, ma supporta un meccanismo di smistamento alternativo guidato dalla lunghezza dei lipidi. Quindi, abbiamo analizzato se la lunghezza della catena acilica della ceramide nella membrana del reticolo endoplasmatico è importante per l'efficace classificazione di Gas1-GFP come ERES selettivo. Poiché Gas1 nel ceppo GhLag1 con ceramide a catena corta lascia il reticolo endoplasmatico ed entra nella membrana plasmatica (Figura S5), riteniamo che se lo smistamento è guidato dalla lunghezza della catena acilica della ceramide, Gas1 nel ceppo GhLag1 può essere reindirizzato e attraversare le merci ERES con la stessa membrana.
(A) La membrana cellulare di GhLag1 contiene principalmente ceramidi C18-C16 più corte, mentre l'ancora GPI di Gas1-GFP ha ancora lo stesso IPC C26 delle cellule di tipo selvatico. Sopra: analisi della lunghezza della catena acilica della ceramide nella membrana cellulare dei ceppi di tipo selvatico (Wt) e GhLag1p mediante spettrometria di massa (MS). I dati rappresentano la percentuale di ceramide totale. Media di tre esperimenti indipendenti. Barra di errore = SD. Test t non accoppiato a due code. **** P <0,0001. Pannello inferiore: analisi MS della lunghezza della catena acilica dell'IPC presente nell'ancora GPI di Gas1-GFP (GPI-IPC) espressa nei ceppi di tipo selvatico e GhLag1p. I dati rappresentano la percentuale del segnale IPC totale. Media di cinque esperimenti indipendenti. Barra di errore = SD. Test t non accoppiato a due code. ns, non importante. P = 0,9134. (B) Micrografie a fluorescenza di cellule sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ e sec31-1lst1Δ che esprimono Gas1-GFP indotta da galattosio sono state incubate a 37 °C per 30 minuti e trasferite a Eseguire la microscopia a fluorescenza di routine dopo 24 °C. Freccia bianca: cluster di Gas1-GFP nel RE. Freccia vuota: Gas1-GFP non raggruppato è distribuito sull'intera membrana del RE, mostrando la caratteristica colorazione ad anello nucleare del RE. Barra di scala, 5 μm. (C) Quantificazione della microfotografia descritta in (B). Percentuale media di cellule con struttura puntiforme di Gas1-GFP. In tre esperimenti indipendenti, n ≥ 300 cellule. Barra di errore = DS. Test t non accoppiato a due code. **** P < 0,0001.
Per risolvere direttamente questo problema, abbiamo eseguito la visualizzazione SCLIM di Gas1-GFP e Mid2-iRFP in GhLag1 con l'allele mutante termosensibile sec31-1 (Figura 4 e Video S4). Dopo che il reticolo endoplasmatico (RE) è stato mantenuto a 37 °C e successivamente rilasciato a 24 °C, la maggior parte del Gas1-GFP di nuova sintesi non era aggregato e distribuito in tutta la membrana del RE, come osservato con microscopi convenzionali (Figura 4, A e B). Inoltre, un'ampia percentuale di ERES (67%) include due tipi di carico co-localizzati al suo interno (Figura 4D). I pannelli 1 e 2 della Figura 4C mostrano due esempi tipici di ERES con Gas1-GFP e Mid2-GFP sovrapposti. Inoltre, entrambi i carichi sono stati reclutati nello stesso ERES (Figura 4E, pannello 3 e video S4). Pertanto, i nostri risultati indicano che la lunghezza della catena acilica della ceramide nella membrana del RE è un determinante importante dell'aggregazione e della classificazione delle proteine ​​del RE.
Cellule Sec31-1 GhLag1 che esprimono secrezioni indotte dal galattosio, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e Mid2-iRFP (TMP, blu) e Sec13-mCherry marcato costitutivamente con ERES (ERES, magenta). Incubare a 37 °C. Continuare per 30 minuti, abbassare a 24 °C per rilasciare le secrezioni e acquisire immagini con SCLIM dopo 20 minuti. (Da A a C) Immagini di proiezione 2D rappresentative (A; barra di scala, 1 μm) o immagini 3D di emisferi cellulari (B e C; unità di scala, 0,45 μm) delle 10 sezioni z contrassegnate dal carico e dall'ERES. Il pannello inferiore in (B) e il pannello in (C) mostrano immagini elaborate per visualizzare solo i prodotti presenti nell'ERES (magenta) [Gas1-GFP (grigio) e Mid2-iRFP (azzurro)]. (C) Freccia bianca piena: ERES, sovrapposizione di merci. Freccia vuota: ERES contiene un solo elemento. Pannello inferiore: l'ERES selezionato ha merci sovrapposte (1 e 2) contrassegnate in (C). Barra di scala, 100 nm. (D) Quantificazione della microfotografia descritta in (C). Nelle unità sec31-1 e sec31-1 GhLag1, è incluso un solo carico (Gas1-GFP o Mid2-iRFP) e viene mostrata la percentuale media di ERES per il carico isolato e il carico sovrapposto. In tre esperimenti indipendenti, n = 432 in 54 cellule (sec31-1) e n = 430 in 47 cellule (sec31-1 GhLag1). Barra di errore = deviazione standard. Test t non accoppiato a due code. *** P = 0,0002 (sec31-1) e ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Immagine 3D di ERES selezionato con carico sovrapposto (3) contrassegnato in (C). Gas1-GFP (verde) e Mid2-iRFP (blu) si avvicinano a ERES (magenta) dallo stesso lato e rimangono nella stessa area ristretta di ERES. Barra di scala, 100 nm.
Questo studio fornisce prove dirette in vivo che i carichi proteici a base lipidica vengono classificati in siti di esportazione selettivi nella via secretoria e rivela l'importanza della lunghezza della catena acilica per la selettività della classificazione. Utilizzando una potente e innovativa tecnica di microscopia chiamata SCLIM, abbiamo dimostrato che la Gas1-GFP (una principale GPI-AP della membrana plasmatica con una porzione lipidica di ceramide a catena acilica molto lunga (C26)) di recente sintesi nel lievito, le regioni raggruppate in RE discreti sono associate a ERES specifici, mentre le proteine ​​secrete transmembrana sono distribuite in tutta la membrana del RE (Figura 1). Inoltre, questi due tipi di merci entrano selettivamente in ERES diversi (Figura 2). Quando la lunghezza della catena acilica della ceramide cellulare nella membrana si riduce da C26 a C18-C16, il cluster Gas1-GFP viene disgregato nella regione discreta del RE e la Gas1-GFP viene reindirizzata per lasciare il RE con la proteina transmembrana attraverso lo stesso ERES (Figura 3 e Figura 3). 4).
Sebbene GPI-AP utilizzi un meccanismo proteico specializzato per uscire dal reticolo endoplasmatico (RE), abbiamo scoperto che la separazione dipendente dalla ceramide C26 non si basa su interazioni proteiche differenziali che possono portare alla specializzazione dell'ERES (Figure S4 e S5). Al contrario, i nostri risultati supportano un meccanismo di classificazione alternativo guidato dall'aggregazione proteica basata sui lipidi e dalla successiva esclusione di altri carichi. Le nostre osservazioni indicano che la regione o il cluster Gas1-GFP associato a uno specifico ERES è privo della proteina secreta transmembrana Mid2-iRFP, il che indica che il cluster GPI-AP dipendente dalla ceramide C26 faciliterà il loro ingresso nel relativo ERES e, allo stesso tempo, escluderà le secrezioni transmembrana dall'ingresso in questo particolare ERES (Figure 1 e 2). Al contrario, la presenza di ceramidi C18-C16 nella membrana del RE non causa la formazione di regioni o cluster da parte di GPI-AP, quindi non escludono né sostituiscono le proteine ​​secrete transmembrana nello stesso ERES (Figure 3 e 4). Pertanto, proponiamo che la ceramide C26 favorisca la separazione e la classificazione facilitando il raggruppamento delle proteine ​​legate a specifici ERES.
Come si ottiene questo raggruppamento dipendente dalla ceramide C26 in una specifica area del RE? La tendenza della ceramide di membrana a separarsi lateralmente può far sì che GPI-AP e la ceramide C26 formino piccoli lipidi istantaneamente ordinati nell'ambiente lipidico più irregolare della membrana del RE contenente glicerolipidi più corti e insaturi. Cluster di qualità (17, 18). Questi piccoli cluster temporanei possono essere ulteriormente fusi in cluster più grandi e stabili dopo il legame con il complesso p24 (34). In linea con ciò, abbiamo dimostrato che C26 Gas1-GFP deve interagire con il complesso p24 per formare cluster visibili più grandi (Figura 3). Il complesso p24 è un oligomero eterozigote composto da quattro diverse proteine ​​transmembrana p24 nel lievito (35), che fornisce un legame multivalente, che può portare al cross-linking di piccoli cluster GPI-AP, generando così cluster stabili più grandi (34). L'interazione tra gli ectodomini proteici delle GPI-AP può anche contribuire alla loro aggregazione, come dimostrato durante il loro trasporto nel Golgi nelle cellule epiteliali polarizzate dei mammiferi (36). Tuttavia, quando la ceramide C18-C16 è presente nella membrana del RE, quando il complesso p24 si lega a Gas1-GFP, non si formeranno grandi cluster separati. Il meccanismo sottostante può dipendere dalle specifiche proprietà fisiche e chimiche della ceramide a catena acilica lunga. Studi biofisici di membrane artificiali mostrano che, sebbene sia le ceramidi a catena acilica lunga (C24) che quelle a catena corta (C18-C16) possano causare la separazione di fase, solo le ceramidi a catena acilica lunga (C24) possono promuovere un'elevata curvatura e flessione del film per rimodellare il film. Attraverso un riferimento reciproco (17, 37, 38). È stato dimostrato che l'elica transmembrana di TMED2, l'omologo umano di Emp24, interagisce selettivamente con la sfingomielina a base di ceramide C18 nei lobuli citoplasmatici (39). Utilizzando simulazioni di dinamica molecolare (MD), abbiamo scoperto che sia le ceramidi C18 che C26 si accumulano attorno ai lobuli citoplasmatici dell'elica transmembrana di Emp24 e presentano preferenze simili (Figura S6). Vale la pena notare che ciò indica che l'elica transmembrana di Emp24 può portare a una distribuzione asimmetrica dei lipidi nella membrana. Questo è un risultato recente basato su cellule di mammifero. Simili simulazioni MD mostrano anche la presenza di lipidi eterei (40). Pertanto, ipotizziamo che la ceramide C26 nei due lobuli di ER26 sia localmente arricchita. Quando il GPI-AP nei lobuli luminali si lega direttamente al p24 multivalente e l'accumulo di ceramide C26 attorno al p24 nei lobuli citoplasmatici, può promuovere l'aggregazione proteica e la curvatura della membrana che vengono generate attraverso le dita (41), causando la separazione del GPI-AP in regioni discrete adiacenti all'ERES, che favorisce anche le regioni altamente curve della membrana dell'ER (42). Precedenti rapporti hanno supportato il meccanismo proposto (43, 44). Il legame multivalente di oligolectine, patogeni o anticorpi ai glicosfingolipidi a base di ceramide (GSL) sulla membrana plasmatica innesca una grande aggregazione di GSL, aumenta la separazione di fase e causa la deformazione e l'internalizzazione della membrana (44). Iwabuchi ecc. (43) È stato scoperto che in presenza di catene aciliche lunghe (C24) ma non corte (C16), il ligando multivalente legato al lattosilceramide GSL induceva la formazione di grandi cluster e invaginazione della membrana, e la trasduzione del segnale mediata da Lyn nel citoplasma sui foglietti è interdigitata dalle catene aciliche nei neutrofili accoppiati.
Nelle cellule epiteliali polarizzate dei mammiferi, la concentrazione della rete anti-Golgi (TGN) a livello della membrana plasmatica apicale controlla la separazione e lo smistamento del GPI-AP (10, 45). Questa aggregazione è guidata dall'oligomerizzazione del GPI-AP (36), ma può anche dipendere dalla lunghezza della catena di ceramide che troviamo nel lievito. Sebbene il GPI-AP dei mammiferi abbia un'ancora a base di lipidi eterei e la sua struttura chimica sia molto diversa dalla ceramide a catena acilica molto lunga, uno studio recente ha scoperto che entrambi i lipidi hanno proprietà fisiche e chimiche e funzioni evolutivamente simili (40). Pertanto, la parte lipidica eterea nelle cellule dei mammiferi potrebbe essere simile alla ceramide C26 nel lievito e il suo ruolo è quello di associarsi alla ceramide a catena lunga nella membrana per promuovere l'aggregazione e lo smistamento del GPI-AP. Sebbene questa possibilità debba ancora essere verificata direttamente, precedenti studi suggeriscono che il trasporto della ceramide a catena acilica lunga all'apparato di Golgi non sia mediato da proteine ​​di trasferimento citoplasmatiche, ma dipenda dalla sintesi di ancore GPI, come nel lievito. Pertanto, il meccanismo evolutivamente conservato sembra essere in grado di co-trasportare selettivamente la ceramide a catena acilica molto lunga e il GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) nella stessa vescicola di trasporto.
Nei sistemi di cellule epiteliali polarizzate di lievito e mammiferi, l'aggregazione e la separazione del GPI-AP dalle altre proteine ​​della membrana plasmatica avvengono prima di raggiungere la superficie cellulare. Paladino et al. (48) hanno scoperto che sul TGN delle cellule epiteliali polarizzate di mammiferi, il clustering del GPI-AP non è solo necessario per la classificazione selettiva dei GPI-AP alla membrana plasmatica apicale, ma regola anche l'organizzazione del clustering dei GPI-AP e la sua attività biologica. Superficie cellulare. Nel lievito, questo studio ha dimostrato che il cluster di GPI-AP dipendente dalla ceramide C26 sul ER può regolare l'organizzazione del cluster e l'attività funzionale del GPI-AP sulla membrana plasmatica (24, 49). In linea con questo modello, le cellule GhLag1 sono allergiche agli inibitori del GPI o ai farmaci che influenzano l'integrità della parete cellulare (28), e la necessità di cluster Gas1-GFP funzionali (49) della ceramide apicale proiettata nell'accoppiamento delle cellule di lievito indica possibili conseguenze fisiologiche dell'errore GPI-AP nelle cellule hLag1. Tuttavia, ulteriori verifiche per accertare se l'organizzazione funzionale della superficie cellulare sia stata programmata dal reticolo endoplasmatico mediante un metodo di selezione basato sulla lunghezza dei lipidi saranno oggetto delle nostre future ricerche.
I ceppi di Saccharomyces cerevisiae utilizzati in questo lavoro sono elencati nella Tabella S1. I ceppi MMY1583 e MMY1635 di SCLIM per l'imaging di cellule vive sono stati costruiti nel background W303. Questi ceppi che esprimono Sec13-mCherry con un tag di proteina fluorescente sono stati costruiti utilizzando un metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) con il plasmide pFA6a come stampo (23). Il ceppo che esprime Mid2-iRFP marcato con proteina fluorescente sotto il controllo del promotore GAL1 è stato costruito come segue. Amplificazione PCR della sequenza iRFP-KanMx dal vettore pKTiRFP-KAN (dono di E. O'Shea, numero di plasmide Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificatore di risorsa di ricerca (RRID): Addgene_64687) e inserito nel C-terminale di Mid2 endogeno. Dopo l'amplificazione e la clonazione della sequenza genomica di Mid2-iRFP nel promotore GAL1, questa è stata integrata nel sito Not I-Sac I del plasmide di integrazione pRS306. Il plasmide risultante, pRGS7, è stato linearizzato con Pst I per integrarsi nel locus URA3.
Il gene di fusione Gas1-GFP è espresso sotto il controllo del promotore GAL1 nel plasmide centromerico (CEN), che è costruito come segue. La sequenza Gas1-GFP è stata amplificata tramite PCR dal plasmide pRS416-GAS1-GFP (24) (dono di L. Popolo) e clonata nel sito Xma I–Xho I del plasmide CEN pBEVY-GL LEU2 (dono di C) . Miller; numero di plasmide Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Il plasmide risultante è stato chiamato pRGS6. Il gene di fusione Axl2-GFP è espresso anche sotto il controllo del promotore GAL1 del vettore pBEVY-GL LEU2 e la sua costruzione è la seguente. La sequenza Axl2-GFP è stata amplificata dal plasmide pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) tramite PCR e clonata nel sito Bam HI-Pst I del vettore pBEVY-GL LEU2. Il plasmide risultante è stato denominato pRGS12. La sequenza degli oligonucleotidi utilizzati in questo studio è elencata nella Tabella S2.
Il ceppo è stato integrato con 0,2% di adenina e 2% di glucosio [YP-destrosio (YPD)], 2% di raffinosio [YP-raffinosio] terreno proteico p (YP) ricco di estratto di lievito (1% estratto di lievito e 2% ept proteico). (YPR)] o 2% di galattosio [YP-galattosio (YPG)] come fonte di carbonio, o in un terreno minimo sintetico (0,15% base azotata di lievito e 0,5% solfato di ammonio) per integrare gli amminoacidi e le basi appropriati richiesti per la nutrizione, e contenente 2% di glucosio (terreno minimo sintetico di glucosio) o 2% di galattosio (terreno minimo sintetico di galattosio) come fonte di carbonio.
Per l'imaging in tempo reale, le cellule mutanti sec31-1 termosensibili che esprimono il costrutto sotto il promotore GAL1 sono state coltivate in terreno YPR a 24 °C per tutta la notte fino alla fase di crescita esponenziale. Dopo l'induzione in YPG a 24 °C per 1 ora, le cellule sono state incubate in SG a 37 °C per 30 minuti e quindi trasferite a 24 °C per sbloccare la secrezione. La concanavalina A è stata utilizzata per fissare le cellule su un vetrino e l'immagine è stata acquisita tramite SCLIM. SCLIM è una combinazione di microscopio a fluorescenza invertito Olympus IX-71 e obiettivo a olio UPlanSApo 100×1.4 con apertura numerica (Olympus), scanner confocale a disco rotante ad alta velocità e alto rapporto segnale/rumore (Yokogawa Electric), spettrometro personalizzato e sistema di raffreddamento personalizzato. L'intensificatore di immagine del sistema (Hamamatsu Photonics) può fornire un sistema di lenti di ingrandimento con un ingrandimento finale di ×266,7 e una telecamera CCD che moltiplica gli elettroni (Hamamatsu Photonics) (21). L'acquisizione delle immagini viene eseguita da un software personalizzato (Yokogawa Electric). Per le immagini 3D, abbiamo utilizzato un attuatore piezoelettrico personalizzato per far vibrare verticalmente l'obiettivo e abbiamo raccolto le parti ottiche distanti 100 nm in uno stack. L'immagine Z-stack viene convertita in dati voxel 3D e la funzione di diffusione del punto teorica utilizzata per il microscopio confocale a disco rotante viene utilizzata per l'elaborazione di deconvoluzione dal software Volocity (PerkinElmer). Utilizzando il software Volocity per impostare automaticamente la soglia per l'analisi di co-localizzazione, è stato misurato l'ERES incluso il carico. L'analisi di scansione lineare è stata eseguita utilizzando il software MetaMorph (Molecular Devices).
Utilizzare il software GraphPad Prism per determinare la significatività statistica. Per il test t di Student a due code e l'analisi della varianza (ANOVA) a una via, le differenze tra i gruppi sono considerate significative per P <0,05 (*).
Per la microscopia a fluorescenza di Gas1-GFP, le cellule in fase logaritmica sono state coltivate per una notte in YPD e raccolte mediante centrifugazione, lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato e incubate su ghiaccio per almeno 15 minuti, quindi sono state osservate al microscopio come precedentemente descritto (24). Per l'acquisizione è stato utilizzato il microscopio Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) dotato di obiettivo, filtro L5 (GFP), telecamera Hamamatsu e software Application Suite X (LAS X).
I campioni sono stati denaturati con tampone di campionamento SDS a 65 °C per 10 minuti e successivamente separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (PAGE). Per l'analisi mediante immunoblotting, sono stati caricati 10 μl di campione per corsia. Anticorpo primario: utilizzare anticorpo policlonale di coniglio anti-Gas1 a una diluizione di 1:3000, anticorpo policlonale di coniglio anti-Emp24 a una diluizione di 1:500 e anticorpo policlonale di coniglio anti-GFP (gentile concessione di H. Riezman) a una diluizione di 1:3000. L'anticorpo monoclonale di topo anti-Pgk1 è stato utilizzato a una diluizione di 1:5000 (gentile concessione di J. de la Cruz). Anticorpo secondario: immunoglobulina G (IgG) di capra anti-coniglio coniugata con perossidasi di rafano (HRP) utilizzata a una diluizione di 1:3000 (Pierce). È stato utilizzato un anticorpo anti-IgG di capra coniugato con HRP a una diluizione di 1:3000 (Pierce). La zona di risposta immunitaria è stata osservata mediante il metodo di chemiluminescenza del reagente SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Come descritto in (31), è stato eseguito un esperimento di immunoprecipitazione naturale sulla frazione ER arricchita. In breve, lavare le cellule di lievito con tampone TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro e miscela di inibitori della proteasi] a 600 nm (OD600) a 100 di densità ottica due volte. Sono state rotte con microsfere di vetro, quindi i detriti cellulari e le microsfere di vetro sono stati rimossi mediante centrifugazione. Il supernatante è stato quindi centrifugato a 17.000 g per 15 minuti a 4°C. Il pellet è stato risospeso in TNE e la saponina digitale è stata aggiunta a una concentrazione finale dell'1%. La sospensione è stata incubata per 1 ora con rotazione a 4°C, quindi i componenti insolubili sono stati rimossi mediante centrifugazione a 13.000 g a 4°C per 60 minuti. Per l'immunoprecipitazione di Gas1-GFP, pre-incubare il campione con microsfere di agarosio vuote (ChromoTek) a 4°C per 1 ora, quindi incubare con GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C per 3 ore. Le microsfere immunoprecipitate sono state lavate cinque volte con TNE contenente digossigenina allo 0,2%, eluite con tampone di campionamento SDS, separate su SDS-PAGE e analizzate mediante immunoblotting.
Come descritto in (31), la determinazione del cross-linking è stata eseguita sulla frazione ER arricchita. In breve, la frazione ER arricchita è stata incubata con 0,5 mM ditiobis(succinimidil propionato) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). La reazione di cross-linking è stata bloccata aggiungendo glicina (concentrazione finale 50 mM, 5 minuti, 20°C).
Come precedentemente descritto (50), è stata eseguita l'analisi MS della ceramide nei ceppi wild-type e GhLag1. In breve, le cellule sono state coltivate fino alla fase esponenziale (da 3 a 4 unità OD600/ml) in YPD a 30°C e sono state raccolte 25×107 cellule. Il loro metabolismo è stato bloccato con acido tricloroacetico. Utilizzare il solvente di estrazione [etanolo, acqua, etere, piridina e idrossido di ammonio 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] e 1,2 nmol di standard interno C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) di qualità). Utilizzare il reagente monometilammina [metanolo, acqua, n-butanolo e soluzione di metilammina (4:3:1:5 v/v)] per eseguire una lieve idrolisi alcalina dell'estratto e quindi utilizzare n-butanolo saturo d'acqua per desalinizzare. Infine, l'estratto è stato risospeso in un solvente in modalità positiva [cloroformio/metanolo/acqua (2:7:1) + 5 mM di acetato di ammonio] e iniettato nello spettrometro di massa. Il monitoraggio multi-reazione (MRM) è stato utilizzato per l'identificazione e la quantificazione delle molecole di sfingolipidi. Lo spettrometro di massa a quadrupolo terziario TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) è dotato di una sorgente ionica a nanoflusso robotizzata Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) per l'analisi dei lipidi. L'energia di collisione è ottimizzata per ciascuna categoria di ceramide. I dati MS sono stati ottenuti in modalità positiva. Per ogni replica biologica, il segnale lipidico è la mediana di tre misurazioni indipendenti.
Come descritto in (31), le cellule (800×107) che esprimono Gas1-GFP sono state sottoposte a immunoprecipitazione naturale. Il Gas1-GFP purificato è stato separato mediante SDS-PAGE e trasferito su una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF). La proteina è stata visualizzata colorando il PVDF con nero ammidico. La banda di Gas1-GFP è stata tagliata dal PVDF e lavata 5 volte con metanolo e una volta con acqua di grado cromatografia liquida-MS (LC-MS). Incubando la striscia di membrana con 500μl di tampone NaOAc 0,3 M (pH 4,0) e 500μl di miscela di nitrito di sodio 1 M appena disciolta a 37°C per 3 ore, la frazione lipidica viene rilasciata da Gas1-GFP e lisata Rilascio di inosina fosfato ceramide tra glucosamina e inositolo (51). Dopodiché, la striscia di membrana è stata lavata quattro volte con acqua di grado LC-MS, asciugata a temperatura ambiente e conservata in atmosfera di azoto a -80 °C fino all'analisi. Come controllo, per ogni esperimento è stato utilizzato un campione vuoto di membrana PVDF. Il lipide estratto da Gas1-GFP è stato quindi analizzato mediante MS come descritto (50). In breve, le strisce di PVDF contenenti GPI-lipidi sono state risospese in 75 μl di solvente negativo per stampi [cloroformio/metanolo (1:2) + 5 mM di acetato di ammonio] e sottoposte ad analisi ESI-MRM/MS di specie di sfingolipidi (TSQ Vantage). In questo caso, i dati MS sono stati ottenuti in modalità ioni negativi.
Come menzionato in precedenza, la porzione lipidica dell'ancora GPI è stata separata dal GPI-AP marcato con [3H]-inositolo (16). I lipidi sono stati separati mediante cromatografia su strato sottile utilizzando un sistema di solventi (55:45:10 cloroformio-metanolo-0,25% KCl) e visualizzati utilizzando FLA-7000 (Fujifilm).
Le cellule che esprimono Gas1-GFP (600×10⁷) sono state lavate due volte con tampone TNE, lisate con microsfere di vetro e quindi centrifugate per rimuovere i detriti cellulari e le microsfere di vetro. Il surnatante è stato quindi centrifugato a 17.000 g per 1 ora a 4°C. Il pellet è stato lavato in TNE e incubato con 1 U di PI-PLC (Invitrogen) in TNE contenente 0,2% di saponina digitale per 1 ora a 37°C. Dopo il trattamento enzimatico, la membrana è stata rimossa mediante centrifugazione a 17.000 g a 4°C per 1 ora. Per immunoprecipitare Gas1-GFP, il surnatante è stato incubato con GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C per tutta la notte. La proteina Gas1-GFP purificata, separata mediante SDS-PAGE, è stata colorata con blu di Coomassie brillante. La banda di colorazione Gas1-GFP è stata ritagliata dalla zona grigia circostante l'acquedotto, quindi, dopo alchilazione con iodoacetamide e riduzione con ditiotreitolo, è stata eseguita la digestione in gel con tripsina. Estrazione e essiccazione dei peptidi triptici e dei peptidi con glicani GPI. Il peptide essiccato è stato disciolto in 20 μl di acqua. Iniettare una porzione (8 μl) nella LC. Una colonna di ottadecilsilano (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diametro interno 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Prefettura di Aichi, Giappone) è stata utilizzata per separare i peptidi in condizioni di gradiente specifiche. La fase mobile è costituita dal solvente A (acido formico allo 0,08%) e dal solvente B (acido formico allo 0,15% in acetonitrile all'80%). Un sistema HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) è stato utilizzato per eluire la colonna con il solvente A entro 55 minuti a una velocità di flusso di 50 μl min-1 per 5 minuti, dopodiché la concentrazione del solvente B è stata aumentata al 40%. L'eluato è stato introdotto continuamente nella sorgente di ioni ESI e i peptidi triptici e i peptidi con glicani GPI sono stati analizzati mediante LTQ Orbitrap XL (spettrometro di massa ibrido a trappola ionica lineare-Orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Nella configurazione MS, la tensione della sorgente capillare è stata impostata a 4,5 kV e la temperatura del capillare di trasferimento è stata mantenuta a 300 °C. La tensione capillare e la tensione della lente del tubo sono state impostate rispettivamente a 15 V e 50 V. I dati MS sono stati ottenuti in modalità ioni positivi (risoluzione di 60.000; accuratezza di massa di 10 parti per milione) in un intervallo di massa di 300/m/z rapporto massa/carica (m/z) 3000. I dati MS/MS sono ottenuti tramite la trappola ionica nell'LTQ Orbitrap XL [le prime 3 cifre da cui dipendono i dati, dissociazione indotta da collisione (CID)].
Le simulazioni MD sono state eseguite utilizzando il software GROMACS (52) e il campo di forza MARTINI 2 (53-55). Il CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) è stato quindi utilizzato per costruire un doppio strato contenente dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) e Cer C18 o DOPC e Cer C26. La topologia e le coordinate di Cer C26 sono derivate da DXCE rimuovendo le sfere extra dalla coda di sfingosina. Utilizzare il processo descritto di seguito per bilanciare il doppio strato ed eseguirlo, quindi utilizzare le ultime coordinate del sistema per costruire un sistema contenente Emp24. Il dominio transmembrana di Emp24 di lievito (residui da 173 a 193) è stato costruito come un'α-elica utilizzando la struttura molecolare dello strumento visual MD (VMD) (58). Quindi, dopo aver rimosso i lipidi sovrapposti, la proteina è stata granulata grossolanamente e inserita nel doppio strato utilizzando CHARMM GUI. Il sistema finale contiene 1202 DOPC e 302 Cer C26 oppure 1197 DOPC e 295 Cer C18 e Emp24. Ionizzare il sistema fino a una concentrazione di 0,150 M. Sono state effettuate quattro repliche indipendenti per due composizioni del doppio strato.
Il doppio strato lipidico viene bilanciato utilizzando il processo CHARMM GUI, che prevede la minimizzazione e il successivo bilanciamento di 405.000 passaggi, durante i quali i vincoli di posizione vengono gradualmente ridotti ed eliminati e il passo temporale viene aumentato da 0,005 ps a 0,02 ps. Dopo l'equilibrazione, si ottengono 6 µs con un passo temporale di 0,02 ps. Dopo l'inserimento di Emp24, si utilizza lo stesso processo CHARMM GUI per minimizzare e bilanciare il sistema, quindi si esegue l'operazione per 8 s in produzione.
Per tutti i sistemi, durante il processo di bilanciamento, la pressione è controllata dal barostato di Berendsen (59), e durante il processo di produzione, la pressione è controllata dal barostato di Parrinello-Rahman (60). In tutti i casi, la pressione media è di 1 bar e viene utilizzato uno schema di accoppiamento della pressione semi-isotropico. Nel processo di bilanciamento e di produzione, viene utilizzato un termostato (61) con ricalibrazione della velocità per accoppiare rispettivamente la temperatura delle particelle di proteina, lipidi e solvente. Durante l'intera operazione, la temperatura target è di 310 K. L'interazione non legante viene calcolata generando un elenco di accoppiamenti utilizzando lo schema di Verlet con una tolleranza del buffer di 0,005. Il termine di Coulomb viene calcolato utilizzando il campo di reazione e una distanza di cutoff di 1,1 nm. Il termine di Vander Waals utilizza uno schema di cutoff con una distanza di cutoff di 1,1 nm e lo schema di cutoff di Verlet viene utilizzato per la deriva del potenziale (62).
Utilizzando VMD, la lunghezza d'onda di cutoff tra le microsfere di fosfato DOPC o le microsfere di ceramide AM1 e la proteina è di 0,7 nm e viene calcolato il numero di lipidi che interagiscono con la proteina. Secondo la seguente formula, calcolare il fattore di deplezione-arricchimento (DE) come in (63): Fattore DE = (quantità di lipidi totali nella proteina 0,7) nella proteina 0,7 (quantità di Cer nei lipidi totali)
Il valore riportato è ottenuto come media e le barre di errore sono quattro copie indipendenti di SE. La significatività statistica del fattore DE è calcolata tramite test t [(fattore DE medio-1)/SE]. Calcola il valore P dalla distribuzione unilaterale.
Lo strumento GROMACS è stato utilizzato per calcolare la mappa di densità laterale 2D del sistema contenente Emp24 negli ultimi 250 ns della traccia. Per ottenere la mappa di arricchimento/deplezione della ceramide, la mappa di densità di Cer viene divisa per la somma delle mappe di Cer e DOPC, e quindi divisa per la concentrazione di Cer nell'organismo. Viene utilizzata la stessa scala di colori della mappa.
Per consultare il materiale supplementare relativo a questo articolo, visitare il sito http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
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