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L'idrogeno solforato (H₂S) ha molteplici effetti fisiologici e patologici sul corpo umano. L'idrosolfuro di sodio (NaHS) è ampiamente utilizzato come strumento farmacologico per valutare gli effetti dell'H₂S negli esperimenti biologici. Sebbene la perdita di H₂S dalle soluzioni di NaHS richieda solo pochi minuti, le soluzioni di NaHS sono state utilizzate come composti donatori di H₂S nell'acqua potabile in alcuni studi su animali. Questo studio ha valutato se l'acqua potabile con una concentrazione di NaHS di 30 μM preparata in bottiglie per ratti/topi potesse rimanere stabile per almeno 12-24 ore, come suggerito da alcuni autori. Preparare una soluzione di NaHS (30 μM) in acqua potabile e versarla immediatamente in bottiglie per ratti/topi. Campioni sono stati raccolti dalla punta e dall'interno della bottiglia d'acqua a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 e 24 ore per misurare il contenuto di solfuro utilizzando il metodo del blu di metilene. Inoltre, ratti maschi e femmine sono stati iniettati con NaHS (30 μM) per due settimane e le concentrazioni sieriche di solfuro sono state misurate a giorni alterni durante la prima settimana e alla fine della seconda settimana. La soluzione di NaHS nel campione ottenuto dalla punta della bottiglia d'acqua era instabile; è diminuita del 72% e del 75% rispettivamente dopo 12 e 24 ore. Nei campioni ottenuti dall'interno delle bottiglie d'acqua, la diminuzione di NaHS non è stata significativa entro 2 ore; tuttavia, è diminuita del 47% e del 72% rispettivamente dopo 12 e 24 ore. L'iniezione di NaHS non ha influenzato il livello sierico di solfuro nei ratti maschi e femmine. In conclusione, le soluzioni di NaHS preparate da acqua potabile non devono essere utilizzate per la donazione di H₂S perché la soluzione è instabile. Questa via di somministrazione esporrà gli animali a quantità irregolari e inferiori al previsto di NaHS.
L'idrogeno solforato (H2S) è stato utilizzato come tossina fin dal 1700; tuttavia, il suo possibile ruolo come molecola di biosegnalazione endogena è stato descritto da Abe e Kimura nel 1996. Negli ultimi tre decenni, sono state chiarite numerose funzioni dell'H2S in vari sistemi umani, portando alla conclusione che le molecole donatrici di H2S potrebbero avere applicazioni cliniche nel trattamento o nella gestione di alcune malattie; vedere Chirino et al. per una recente revisione.
L'idrosolfuro di sodio (NaHS) è stato ampiamente utilizzato come strumento farmacologico per valutare gli effetti dell'H₂S in numerosi studi su colture cellulari e animali5,6,7,8. Tuttavia, l'NaHS non è un donatore ideale di H₂S perché viene rapidamente convertito in H₂S/HS- in soluzione, è facilmente contaminato da polisolfuri ed è facilmente ossidato e volatilizzato4,9. In molti esperimenti biologici, l'NaHS viene disciolto in acqua, con conseguente volatilizzazione passiva e perdita di H₂S10,11,12, ossidazione spontanea di H₂S11,12,13 e fotolisi14. Il solfuro nella soluzione originale viene perso molto rapidamente a causa della volatilizzazione di H₂S11. In un contenitore aperto, l'emivita (t1/2) dell'H₂S è di circa 5 minuti e la sua concentrazione diminuisce di circa il 13% al minuto10. Sebbene la perdita di idrogeno solforato dalle soluzioni di NaHS richieda solo pochi minuti, alcuni studi sugli animali hanno utilizzato soluzioni di NaHS come fonte di idrogeno solforato nell'acqua potabile per 1-21 settimane, sostituendo la soluzione contenente NaHS ogni 12-24 ore.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Questa pratica non è coerente con i principi della ricerca scientifica, poiché i dosaggi dei farmaci dovrebbero essere basati sul loro utilizzo in altre specie, in particolare negli esseri umani.27
La ricerca preclinica in biomedicina mira a migliorare la qualità dell'assistenza ai pazienti o i risultati dei trattamenti. Tuttavia, i risultati della maggior parte degli studi sugli animali non sono ancora stati trasferiti all'uomo28,29,30. Una delle ragioni di questo fallimento traslazionale è la scarsa attenzione alla qualità metodologica degli studi sugli animali30. Pertanto, l'obiettivo di questo studio era di verificare se le soluzioni di NaHS 30 μM preparate in bottiglie d'acqua per ratti/topi potessero rimanere stabili nell'acqua potabile per 12-24 ore, come affermato o suggerito in alcuni studi.
Tutti gli esperimenti di questo studio sono stati condotti in conformità con le linee guida pubblicate per la cura e l'uso di animali da laboratorio in Iran31. Tutti i rapporti sperimentali di questo studio hanno inoltre seguito le linee guida ARRIVE32. Il Comitato Etico dell'Istituto di Scienze Endocrine, Università di Scienze Mediche Shahid Beheshti, ha approvato tutte le procedure sperimentali di questo studio.
L'acetato di zinco diidrato (CAS: 5970-45-6) e il cloruro ferrico anidro (CAS: 7705-08-0) sono stati acquistati da Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Francia). L'idrato di sodio idrosolfuro (CAS: 207683-19-0) e la N,N-dimetil-p-fenilendiammina (DMPD) (CAS: 535-47-0) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). L'isoflurano è stato acquistato da Piramal (Bethlehem, PA, USA). L'acido cloridrico (HCl) è stato acquistato da Merck (Darmstadt, Germania).
Preparare una soluzione di NaHS (30 μM) in acqua potabile e versarla immediatamente nelle bottiglie d'acqua per ratti/topi. Questa concentrazione è stata scelta sulla base di numerose pubblicazioni che utilizzano NaHS come fonte di H₂S; vedere la sezione Discussione. NaHS è una molecola idrata che può contenere quantità variabili di acqua di idratazione (ovvero, NaHS•xH₂O); secondo il produttore, la percentuale di NaHS utilizzata nel nostro studio era del 70,7% (ovvero, NaHS•1,3H₂O), e abbiamo tenuto conto di questo valore nei nostri calcoli, dove abbiamo utilizzato un peso molecolare di 56,06 g/mol, che è il peso molecolare di NaHS anidro. L'acqua di idratazione (detta anche acqua di cristallizzazione) è costituita dalle molecole d'acqua che compongono la struttura cristallina33. Gli idrati hanno proprietà fisiche e termodinamiche diverse rispetto agli anidri34.
Prima di aggiungere NaHS all'acqua potabile, misurare il pH e la temperatura del solvente. Versare immediatamente la soluzione di NaHS nella bottiglia d'acqua per ratti/topi nella gabbia degli animali. Sono stati raccolti campioni dalla punta e dall'interno della bottiglia d'acqua a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 e 24 ore per misurare il contenuto di solfuri. Le misurazioni dei solfuri sono state effettuate immediatamente dopo ogni campionamento. Abbiamo ottenuto campioni dalla punta della provetta perché alcuni studi hanno dimostrato che le piccole dimensioni dei pori della provetta d'acqua possono ridurre al minimo l'evaporazione di H₂S15,19. Questo problema sembra applicarsi anche alla soluzione nella bottiglia. Tuttavia, questo non si è verificato per la soluzione nel collo della bottiglia d'acqua, che aveva una velocità di evaporazione più elevata ed era autoossidante; infatti, gli animali hanno bevuto quest'acqua per prima.
Nello studio sono stati utilizzati ratti Wistar maschi e femmine. I ratti sono stati alloggiati in gabbie di polipropilene (2-3 ratti per gabbia) in condizioni standard (temperatura 21-26 °C, umidità 32-40%) con 12 ore di luce (dalle 7:00 alle 19:00) e 12 ore di buio (dalle 19:00 alle 7:00). I ratti avevano libero accesso all'acqua del rubinetto e venivano nutriti con cibo standard (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Ratti Wistar di sesso femminile (n=10, peso corporeo: 190-230 g) e maschi (n=10, peso corporeo: 320-370 g) di pari età (6 mesi) sono stati divisi casualmente in gruppi di controllo e trattati con NaHS (30 μM) (n=5 per gruppo). Per determinare la dimensione del campione, abbiamo utilizzato l'approccio KISS (Keep It Simple, Stupid), che combina l'esperienza pregressa e l'analisi di potenza35. Abbiamo inizialmente condotto uno studio pilota su 3 ratti e determinato il livello medio di solfuro totale nel siero e la deviazione standard (8,1 ± 0,81 μM). Quindi, considerando una potenza dell'80% e assumendo un livello di significatività bilaterale del 5%, abbiamo determinato una dimensione preliminare del campione (n = 5 in base alla letteratura precedente) che corrispondeva a una dimensione dell'effetto standardizzata di 2,02 con il valore predefinito suggerito da Festing per il calcolo della dimensione del campione degli animali da esperimento35. Dopo aver moltiplicato questo valore per la deviazione standard (DS) (2,02 × 0,81), la dimensione dell'effetto rilevabile prevista (1,6 μM) era del 20%, il che è accettabile. Ciò significa che n = 5/gruppo è sufficiente per rilevare una variazione media del 20% tra i gruppi. I ratti sono stati divisi casualmente in gruppi di controllo e trattati con NaSH utilizzando la funzione casuale del software Excel36 (Figura 1 supplementare). Il mascheramento è stato effettuato a livello di esito e i ricercatori che hanno eseguito le misurazioni biochimiche non erano a conoscenza delle assegnazioni di gruppo.
I gruppi NaHS di entrambi i sessi sono stati trattati con una soluzione di NaHS 30 μM preparata in acqua potabile per 2 settimane; la soluzione fresca è stata fornita ogni 24 ore, durante le quali è stato misurato il peso corporeo. Campioni di sangue sono stati raccolti dalle punte della coda di tutti i ratti sotto anestesia con isoflurano a giorni alterni alla fine della prima e della seconda settimana. I campioni di sangue sono stati centrifugati a 3000 g per 10 minuti, il siero è stato separato e conservato a -80 °C per la successiva misurazione di urea sierica, creatinina (Cr) e solfuro totale. L'urea sierica è stata determinata con il metodo enzimatico dell'ureasi e la creatinina sierica è stata determinata con il metodo fotometrico di Jaffe utilizzando kit disponibili in commercio (Man Company, Teheran, Iran) e un analizzatore automatico (Selectra E, numero di serie 0-2124, Paesi Bassi). I coefficienti di variazione intra- e inter-test per urea e Cr erano inferiori al 2,5%.
Il metodo del blu di metilene (MB) viene utilizzato per misurare il solfuro totale nell'acqua potabile e nel siero contenente NaHS; il MB è il metodo più comunemente utilizzato per misurare il solfuro in soluzioni in massa e campioni biologici11,37. Il metodo MB può essere utilizzato per stimare il pool di solfuri totali38 e misurare i solfuri inorganici sotto forma di H₂S, HS₂ e S₂ nella fase acquosa39. In questo metodo, lo zolfo viene precipitato come solfuro di zinco (ZnS) in presenza di acetato di zinco11,38. La precipitazione con acetato di zinco è il metodo più utilizzato per separare i solfuri da altri cromofori11. Lo ZnS è stato ridisciolto utilizzando HCl11 in condizioni fortemente acide. Il solfuro reagisce con il DMPD in un rapporto stechiometrico di 1:2 in una reazione catalizzata dal cloruro ferrico (Fe3+ agisce come agente ossidante) per formare il colorante MB, che viene rilevato spettrofotometricamente a 670 nm40,41. Il limite di rilevamento del metodo MB è di circa 1 μM11.
In questo studio, 100 μL di ciascun campione (soluzione o siero) sono stati aggiunti a una provetta; sono stati quindi aggiunti 200 μL di acetato di zinco (1% p/v in acqua distillata), 100 μL di DMPD (20 mM in HCl 7,2 M) e 133 μL di FeCl3 (30 mM in HCl 1,2 M). La miscela è stata incubata a 37 °C al buio per 30 minuti. La soluzione è stata centrifugata a 10.000 g per 10 minuti e l'assorbanza del surnatante è stata letta a 670 nm utilizzando un lettore di micropiastre (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Le concentrazioni di solfuro sono state determinate utilizzando una curva di calibrazione di NaHS (0–100 μM) in ddH2O (Figura 2 supplementare). Tutte le soluzioni utilizzate per le misurazioni sono state preparate al momento. I coefficienti di variazione intra- e inter-saggio per le misurazioni dei solfuri sono stati rispettivamente del 2,8% e del 3,4%. Abbiamo anche determinato il solfuro totale recuperato da campioni di acqua potabile e siero contenenti tiosolfato di sodio utilizzando il metodo del campione fortificato42. I recuperi per i campioni di acqua potabile e siero contenenti tiosolfato di sodio sono stati rispettivamente del 91 ± 1,1% (n = 6) e del 93 ± 2,4% (n = 6).
L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism versione 8.0.2 per Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). È stato utilizzato un t-test per dati appaiati per confrontare la temperatura e il pH dell'acqua potabile prima e dopo l'aggiunta di NaHS. La perdita di H₂S nella soluzione contenente NaHS è stata calcolata come diminuzione percentuale rispetto all'assorbimento basale e, per valutare se la perdita fosse statisticamente significativa, abbiamo eseguito un'ANOVA a misure ripetute a un fattore seguita dal test di confronto multiplo di Dunnett. Peso corporeo, urea sierica, creatinina sierica e solfuro sierico totale sono stati confrontati nel tempo tra ratti di controllo e trattati con NaHS di sessi diversi utilizzando un'ANOVA mista a due fattori (between-within) seguita da un test post hoc di Bonferroni. I valori di P a due code < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
Il pH dell'acqua potabile era 7,60 ± 0,01 prima dell'aggiunta di NaHS e 7,71 ± 0,03 dopo l'aggiunta di NaHS (n = 13, p = 0,0029). La temperatura dell'acqua potabile era 26,5 ± 0,2 ed è scesa a 26,2 ± 0,2 dopo l'aggiunta di NaHS (n = 13, p = 0,0128). Preparare una soluzione di NaHS 30 μM in acqua potabile e conservarla in una bottiglia d'acqua. La soluzione di NaHS è instabile e la sua concentrazione diminuisce nel tempo. Quando si prelevava il campione dal collo della bottiglia d'acqua, si è osservata una diminuzione significativa (68,0%) entro la prima ora, e il contenuto di NaHS nella soluzione è diminuito del 72% e del 75% dopo 12 e 24 ore, rispettivamente. Nei campioni ottenuti da bottiglie d'acqua, la riduzione di NaHS non è stata significativa fino a 2 ore, ma dopo 12 e 24 ore è diminuita rispettivamente del 47% e del 72%. Questi dati indicano che la percentuale di NaHS in una soluzione 30 μM preparata in acqua potabile è diminuita a circa un quarto del valore iniziale dopo 24 ore, indipendentemente dal punto di campionamento (Figura 1).
Stabilità della soluzione di NaHS (30 μM) in acqua potabile in bottiglie per ratti/topi. Dopo la preparazione della soluzione, sono stati prelevati campioni dalla punta e dall'interno della bottiglia d'acqua. I dati sono presentati come media ± DS (n = 6/gruppo). * e #, P < 0,05 rispetto al tempo 0. La fotografia della bottiglia d'acqua mostra la punta (con apertura) e il corpo della bottiglia. Il volume della punta è di circa 740 μL.
La concentrazione di NaHS nella soluzione 30 μM appena preparata era pari a 30,3 ± 0,4 μM (intervallo: 28,7–31,9 μM, n = 12). Tuttavia, dopo 24 ore, la concentrazione di NaHS è scesa a un valore inferiore (media: 3,0 ± 0,6 μM). Come mostrato nella Figura 2, le concentrazioni di NaHS a cui sono stati esposti i ratti non sono rimaste costanti durante il periodo di studio.
Il peso corporeo dei ratti femmina è aumentato significativamente nel tempo (da 205,2 ± 5,2 g a 213,8 ​​± 7,0 g nel gruppo di controllo e da 204,0 ± 8,6 g a 211,8 ± 7,5 g nel gruppo trattato con NaHS); tuttavia, il trattamento con NaHS non ha avuto alcun effetto sul peso corporeo (Fig. 3). Il peso corporeo dei ratti maschi è aumentato significativamente nel tempo (da 338,6 ± 8,3 g a 352,4 ± 6,0 g nel gruppo di controllo e da 352,4 ± 5,9 g a 363,2 ± 4,3 g nel gruppo trattato con NaHS); tuttavia, il trattamento con NaHS non ha avuto alcun effetto sul peso corporeo (Fig. 3).
Variazioni del peso corporeo in ratti femmine e maschi dopo somministrazione di NaHS (30 μM). I dati sono presentati come media ± SEM e sono stati confrontati utilizzando l'analisi della varianza mista a due vie (entro-tra) con test post hoc di Bonferroni. n = 5 per ciascun sesso in ciascun gruppo.
Le concentrazioni sieriche di urea e creatinfosfato sono risultate comparabili nei ratti di controllo e in quelli trattati con NaSH durante l'intero studio. Inoltre, il trattamento con NaSH non ha influenzato le concentrazioni sieriche di urea e creatincromo (Tabella 1).
Le concentrazioni sieriche totali di solfuro basale erano comparabili tra ratti maschi (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) e femmine (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM) di controllo e trattati con NaHS. La somministrazione di NaHS per 14 giorni non ha avuto alcun effetto sui livelli sierici totali di solfuro né nei ratti maschi né nelle femmine (Fig. 4).
Variazioni nelle concentrazioni sieriche totali di solfuro in ratti maschi e femmine dopo somministrazione di NaHS (30 μM). I dati sono presentati come media ± SEM e sono stati confrontati utilizzando un'analisi della varianza mista a due vie (entro-entro) con test post hoc di Bonferroni. Per ciascun sesso, n = 5/gruppo.
La conclusione principale di questo studio è che l'acqua potabile contenente NaHS è instabile: solo circa un quarto del contenuto totale iniziale di solfuri può essere rilevato 24 ore dopo il campionamento dalla punta e dall'interno delle bottiglie d'acqua di ratti/topi. Inoltre, i ratti sono stati esposti a concentrazioni instabili di NaHS a causa della perdita di H₂S nella soluzione di NaHS e l'aggiunta di NaHS all'acqua potabile non ha influenzato il peso corporeo, l'urea sierica e la creatina-cromo, né il solfuro sierico totale.
In questo studio, il tasso di perdita di H₂S da soluzioni di NaHS 30 μM preparate in acqua potabile è stato di circa il 3% all'ora. In una soluzione tamponata (100 μM di solfuro di sodio in 10 mM di PBS, pH 7,4), è stato riportato che la concentrazione di solfuro è diminuita del 7% nel tempo, nell'arco di 8 ore11. Abbiamo precedentemente difeso la somministrazione intraperitoneale di NaHS segnalando che il tasso di perdita di solfuro da una soluzione di NaHS 54 μM in acqua potabile è stato di circa il 2,3% all'ora (4%/ora nelle prime 12 ore e 1,4%/ora nelle ultime 12 ore dopo la preparazione)8. Studi precedenti43 hanno riscontrato una perdita costante di H₂S dalle soluzioni di NaHS, principalmente dovuta a volatilizzazione e ossidazione. Anche senza l'aggiunta di bolle, il solfuro nella soluzione madre viene rapidamente perso a causa della volatilizzazione di H₂S11. Studi hanno dimostrato che durante il processo di diluizione, che dura circa 30-60 secondi, circa il 5-10% di H2S viene perso a causa dell'evaporazione6. Per prevenire l'evaporazione di H2S dalla soluzione, i ricercatori hanno adottato diverse misure, tra cui la delicata agitazione della soluzione12, la copertura della soluzione madre con pellicola di plastica6 e la riduzione al minimo dell'esposizione della soluzione all'aria, poiché la velocità di evaporazione di H2S dipende dall'interfaccia aria-liquido.13 L'ossidazione spontanea di H2S si verifica principalmente a causa di ioni di metalli di transizione, in particolare ferro ferrico, che sono impurità nell'acqua.13 L'ossidazione di H2S provoca la formazione di polisolfuri (atomi di zolfo legati da legami covalenti)11. Per evitarne l'ossidazione, soluzioni contenenti H₂S vengono preparate in solventi deossigenati44,45 e quindi spurgate con argon o azoto per 20-30 minuti per garantire la deossigenazione.11,12,37,44,45,46 L'acido dietilentriamminopentaacetico (DTPA) è un chelante dei metalli (10-4 M) che previene l'autossidazione di HS₂ in soluzioni aerobiche. In assenza di DTPA, la velocità di autossidazione di HS₂ è di circa il 50% in circa 3 ore a 25 °C37,47. Inoltre, poiché l'ossidazione dell'1e-solfuro è catalizzata dalla luce ultravioletta, la soluzione deve essere conservata su ghiaccio e protetta dalla luce11.
Come mostrato in Figura 5, NaHS si dissocia in Na+ e HS-6 quando disciolto in acqua; questa dissociazione è determinata dal pK1 della reazione, che dipende dalla temperatura: pK1 = 3,122 + 1132/T, dove T varia da 5 a 30 °C ed è misurata in gradi Kelvin (K), K = °C + 273,1548. HS- ha un pK2 elevato (pK2 = 19), quindi a pH < 96,49, S2- non si forma o si forma in quantità molto piccole. Al contrario, HS- agisce come una base e accetta H+ da una molecola di H2O, e H2O agisce come un acido e viene convertita in H2S e OH-.
Formazione di gas H₂S disciolto in una soluzione di NaHS (30 µM). aq, soluzione acquosa; g, gas; l, liquido. Tutti i calcoli presuppongono che il pH dell'acqua sia 7,0 e la temperatura dell'acqua sia 20 °C. Creato con BioRender.com.
Nonostante le prove che le soluzioni di NaHS siano instabili, diversi studi sugli animali hanno utilizzato soluzioni di NaHS nell'acqua potabile come composto donatore di H₂S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 con durate di intervento che vanno da 1 a 21 settimane (Tabella 2). Durante questi studi, la soluzione di NaHS è stata rinnovata ogni 12 ore, 15, 17, 18, 24, 25 ore o 24 ore, 19, 20, 21, 22, 23 ore. I nostri risultati hanno mostrato che i ratti erano esposti a concentrazioni instabili del farmaco a causa della perdita di H₂S dalla soluzione di NaHS e il contenuto di NaHS nell'acqua potabile dei ratti ha oscillato significativamente nell'arco di 12 o 24 ore (vedere Figura 2). Due di questi studi hanno riportato che i livelli di H₂S nell'acqua sono rimasti stabili per 24 ore 22 o che sono state osservate solo perdite di H₂S del 2-3% per 12 ore 15, ma non hanno fornito dati a supporto o dettagli sulle misurazioni. Due studi hanno dimostrato che il piccolo diametro delle bottiglie d'acqua può ridurre al minimo l'evaporazione di H₂S15,19. Tuttavia, i nostri risultati hanno mostrato che questo può ritardare la perdita di H₂S da una bottiglia d'acqua solo di 2 ore anziché di 12-24 ore. Entrambi gli studi sottolineano che presumiamo che il livello di NaHS nell'acqua potabile non sia cambiato perché non abbiamo osservato un cambiamento di colore nell'acqua; pertanto, l'ossidazione di H₂S da parte dell'aria non è stata significativa19,20. Sorprendentemente, questo metodo soggettivo valuta la stabilità di NaHS nell'acqua piuttosto che misurare la variazione della sua concentrazione nel tempo.
La perdita di H₂S nella soluzione di NaHS è correlata al pH e alla temperatura. Come osservato nel nostro studio, la dissoluzione di NaHS in acqua determina la formazione di una soluzione alcalina50. Quando NaHS viene disciolto in acqua, la formazione di gas H₂S disciolto dipende dal valore del pH6. Più basso è il pH della soluzione, maggiore è la proporzione di NaHS presente come molecole di gas H₂S e maggiore è la perdita di solfuro dalla soluzione acquosa11. Nessuno di questi studi ha riportato il pH dell'acqua potabile utilizzata come solvente per NaHS. Secondo le raccomandazioni dell'OMS, adottate dalla maggior parte dei paesi, il pH dell'acqua potabile dovrebbe essere compreso tra 6,5 ​​e 8,551. In questo intervallo di pH, il tasso di ossidazione spontanea di H₂S aumenta di circa dieci volte13. La dissoluzione di NaHS in acqua in questo intervallo di pH si tradurrà in una concentrazione di gas H₂S disciolto compresa tra 1 e 22,5 μM, il che sottolinea l'importanza di monitorare il pH dell'acqua prima di sciogliere NaHS. Inoltre, l'intervallo di temperatura riportato nello studio sopra citato (18–26 °C) comporterebbe una variazione della concentrazione di gas H2S disciolto nella soluzione di circa il 10%, poiché le variazioni di temperatura alterano il pK1 e piccole variazioni del pK1 possono avere un impatto significativo sulla concentrazione di gas H2S disciolto48. Inoltre, la lunga durata di alcuni studi (5 mesi)22, durante la quale è prevista un'ampia variabilità di temperatura, aggrava ulteriormente questo problema.
Tutti gli studi, tranne uno21, hanno utilizzato una soluzione di NaHS 30 μM in acqua potabile. Per spiegare la dose utilizzata (ovvero 30 μM), alcuni autori hanno sottolineato che il NaHS in fase acquosa produce esattamente la stessa concentrazione di H₂S gassoso e che l'intervallo fisiologico di H₂S è compreso tra 10 e 100 μM, quindi questa dose rientra nell'intervallo fisiologico15,16. Altri hanno spiegato che 30 μM di NaHS possono mantenere il livello plasmatico di H₂S entro l'intervallo fisiologico, ovvero 5–300 μM19,20. Consideriamo la concentrazione di NaHS in acqua di 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), utilizzata in alcuni studi per studiare gli effetti dell'H₂S. Possiamo calcolare che la concentrazione di H₂S gassoso disciolto è di 14,7 μM, che rappresenta circa il 50% della concentrazione iniziale di NaHS. Questo valore è simile al valore calcolato da altri autori nelle stesse condizioni13,48.
Nel nostro studio, la somministrazione di NaHS non ha modificato il peso corporeo; questo risultato è coerente con i risultati di altri studi su topi maschi22,23 e ratti maschi18; tuttavia, due studi hanno riportato che NaSH ha ripristinato il peso corporeo diminuito nei ratti nefrectomizzati24,26, mentre altri studi non hanno riportato l'effetto della somministrazione di NaSH sul peso corporeo15,16,17,19,20,21,25. Inoltre, nel nostro studio, la somministrazione di NaSH non ha influenzato i livelli sierici di urea e creatina cromo, il che è coerente con i risultati di un altro rapporto25.
Lo studio ha rilevato che l'aggiunta di NaHS all'acqua potabile per 2 settimane non ha influenzato le concentrazioni sieriche totali di solfuro nei ratti maschi e femmine. Questo risultato è coerente con i risultati di Sen et al. (16): 8 settimane di trattamento con 30 μM di NaHS nell'acqua potabile non hanno influenzato i livelli plasmatici di solfuro nei ratti di controllo; tuttavia, hanno riferito che questo intervento ha ripristinato i livelli ridotti di H2S nel plasma dei topi nefrectomizzati. Li et al. (22) hanno anche riferito che il trattamento con 30 μM di NaHS nell'acqua potabile per 5 mesi ha aumentato i livelli plasmatici di solfuro libero nei topi anziani di circa il 26%. Altri studi non hanno riportato cambiamenti nel solfuro circolante dopo l'aggiunta di NaHS all'acqua potabile.
Sette studi hanno riportato l'utilizzo di Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 ma non hanno fornito ulteriori dettagli sull'acqua di idratazione, e cinque studi non hanno menzionato la fonte di NaHS utilizzata nei loro metodi di preparazione17,18,24,25,26. NaHS è una molecola idrata e il suo contenuto di acqua di idratazione può variare, il che influenza la quantità di NaHS necessaria per preparare una soluzione di una data molarità. Ad esempio, il contenuto di NaHS nel nostro studio era NaHS•1,3 H2O. Pertanto, le concentrazioni effettive di NaHS in questi studi potrebbero essere inferiori a quelle riportate.
"Come può un composto dalla vita così breve avere un effetto così duraturo?" Pozgay et al.21 si sono posti questa domanda quando hanno valutato gli effetti dell'NaHS sulla colite nei topi. Sperano che studi futuri possano rispondere a questa domanda e ipotizzano che le soluzioni di NaHS possano contenere polisolfuri più stabili oltre all'H₂S e ai disolfuri che mediano l'effetto dell'NaHS21. Un'altra possibilità è che anche concentrazioni molto basse di NaHS rimanenti in soluzione possano avere un effetto benefico. Infatti, Olson et al. hanno dimostrato che i livelli micromolari di H₂S nel sangue non sono fisiologici e dovrebbero essere nell'ordine dei nanomolari o del tutto assenti13. L'H₂S può agire attraverso la solfatazione proteica, una modifica post-traduzionale reversibile che influenza la funzione, la stabilità e la localizzazione di molte proteine52,53,54. Infatti, in condizioni fisiologiche, circa il 10-25% di molte proteine ​​epatiche è solfilato53. Entrambi gli studi riconoscono la rapida distruzione di NaHS19,23 ma sorprendentemente affermano che “abbiamo controllato la concentrazione di NaHS nell’acqua potabile sostituendola quotidianamente”.23 Uno studio ha accidentalmente affermato che “NaHS è un donatore standard di H2S ed è comunemente utilizzato nella pratica clinica per sostituire l’H2S stesso”.18
La discussione precedente mostra che l'NaHS viene perso dalla soluzione attraverso volatilizzazione, ossidazione e fotolisi, e pertanto vengono forniti alcuni suggerimenti per ridurre la perdita di H₂S dalla soluzione. In primo luogo, l'evaporazione di H₂S dipende dall'interfaccia gas-liquido13 e dal pH della soluzione11; pertanto, per ridurre al minimo la perdita per evaporazione, il collo della bottiglia d'acqua può essere ridotto al minimo come descritto in precedenza15,19, e il pH dell'acqua può essere regolato a un limite superiore accettabile (ovvero, 6,5-8,551) per ridurre al minimo la perdita per evaporazione11. In secondo luogo, l'ossidazione spontanea di H₂S si verifica a causa degli effetti dell'ossigeno e della presenza di ioni di metalli di transizione nell'acqua potabile13, quindi la deossigenazione dell'acqua potabile con argon o azoto44,45 e l'uso di chelanti metallici37,47 possono ridurre l'ossidazione dei solfuri. In terzo luogo, per prevenire la fotodecomposizione di H₂S, le bottiglie d'acqua possono essere avvolte con un foglio di alluminio; Questa pratica si applica anche a materiali fotosensibili come la streptozotocina55. Infine, i sali di solfuro inorganico (NaHS, Na2S e CaS) possono essere somministrati tramite sondino gastrico anziché disciolti in acqua potabile come precedentemente riportato56,57,58; studi hanno dimostrato che il solfuro di sodio radioattivo somministrato tramite sondino gastrico ai ratti è ben assorbito e distribuito praticamente a tutti i tessuti59. Ad oggi, la maggior parte degli studi ha somministrato sali di solfuro inorganico per via intraperitoneale; tuttavia, questa via è raramente utilizzata in ambito clinico60. D'altra parte, la via orale è la via di somministrazione più comune e preferita negli esseri umani61. Pertanto, raccomandiamo di valutare gli effetti dei donatori di H2S nei roditori mediante sondino orale.
Un limite è che abbiamo misurato il solfuro in soluzione acquosa e siero utilizzando il metodo MB. I metodi per la misurazione del solfuro includono la titolazione con iodio, la spettrofotometria, il metodo elettrochimico (potenziometria, amperometria, metodo coulometrico e metodo amperometrico) e la cromatografia (gascromatografia e cromatografia liquida ad alte prestazioni), tra cui il metodo più comunemente utilizzato è il metodo spettrofotometrico MB62. Un limite del metodo MB per la misurazione di H₂S in campioni biologici è che misura tutti i composti contenenti zolfo e non l'H₂S libero63, poiché viene eseguito in condizioni acide, il che comporta l'estrazione di zolfo dalla fonte biologica64. Tuttavia, secondo l'American Public Health Association, MB è il metodo standard per la misurazione del solfuro in acqua65. Pertanto, questa limitazione non influisce sui nostri risultati principali sull'instabilità delle soluzioni contenenti NaHS. Inoltre, nel nostro studio, il recupero delle misurazioni del solfuro in campioni di acqua e siero contenenti NaHS è stato rispettivamente del 91% e del 93%. Questi valori sono in linea con gli intervalli precedentemente riportati (77–92)66, indicando una precisione analitica accettabile42. Vale la pena notare che abbiamo utilizzato ratti sia maschi che femmine in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH) per evitare un eccessivo affidamento su studi su animali solo maschi negli studi preclinici67 e per includere ratti sia maschi che femmine ove possibile68. Questo punto è stato sottolineato da altri69,70,71.
In conclusione, i risultati di questo studio indicano che le soluzioni di NaHS preparate da acqua potabile non possono essere utilizzate per generare H₂S a causa della loro instabilità. Questa via di somministrazione esporrebbe gli animali a livelli di NaHS instabili e inferiori al previsto; pertanto, i risultati potrebbero non essere applicabili agli esseri umani.
I set di dati utilizzati e/o analizzati durante lo studio attuale sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta ragionevole.
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