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L'acido solfidrico (H2S) ha molteplici effetti fisiologici e patologici sul corpo umano. L'idrosolfuro di sodio (NaHS) è ampiamente utilizzato come strumento farmacologico per valutare gli effetti dell'H2S negli esperimenti biologici. Sebbene la perdita di H2S dalle soluzioni di NaHS avvenga in pochi minuti, le soluzioni di NaHS sono state utilizzate come composti donatori di H2S nell'acqua potabile in alcuni studi su animali. Questo studio ha indagato se l'acqua potabile con una concentrazione di NaHS di 30 μM, preparata in bottiglie per ratti/topi, potesse rimanere stabile per almeno 12-24 ore, come suggerito da alcuni autori. Preparare una soluzione di NaHS (30 μM) in acqua potabile e versarla immediatamente nelle bottiglie per ratti/topi. Campioni sono stati prelevati dalla punta e dall'interno della bottiglia d'acqua a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 e 24 ore per misurare il contenuto di solfuro utilizzando il metodo del blu di metilene. Inoltre, ratti maschi e femmine sono stati iniettati con NaHS (30 μM) per due settimane e le concentrazioni sieriche di solfuro sono state misurate a giorni alterni durante la prima settimana e alla fine della seconda settimana. La soluzione di NaHS nel campione ottenuto dalla punta della bottiglia d'acqua era instabile; è diminuita del 72% e del 75% dopo 12 e 24 ore, rispettivamente. Nei campioni ottenuti dall'interno delle bottiglie d'acqua, la diminuzione di NaHS non è stata significativa entro 2 ore; tuttavia, è diminuita del 47% e del 72% dopo 12 e 24 ore, rispettivamente. L'iniezione di NaHS non ha influenzato il livello sierico di solfuro nei ratti maschi e femmine. In conclusione, le soluzioni di NaHS preparate dall'acqua potabile non dovrebbero essere utilizzate per la donazione di H2S perché la soluzione è instabile. Questa via di somministrazione esporrà gli animali a quantità irregolari e inferiori al previsto di NaHS.
L'acido solfidrico (H2S) è stato utilizzato come tossina fin dal 1700; tuttavia, il suo possibile ruolo come molecola endogena di biosignalazione è stato descritto da Abe e Kimura nel 1996. Negli ultimi tre decenni, sono state chiarite numerose funzioni dell'H2S in diversi sistemi umani, portando alla consapevolezza che le molecole donatrici di H2S potrebbero avere applicazioni cliniche nel trattamento o nella gestione di determinate malattie; si veda Chirino et al. per una recente revisione.
L'idrosolfuro di sodio (NaHS) è stato ampiamente utilizzato come strumento farmacologico per valutare gli effetti dell'H2S in molti studi su colture cellulari e animali5,6,7,8. Tuttavia, il NaHS non è un donatore di H2S ideale perché si converte rapidamente in H2S/HS- in soluzione, si contamina facilmente con polisolfuri e si ossida e volatilizza facilmente4,9. In molti esperimenti biologici, il NaHS viene disciolto in acqua, con conseguente volatilizzazione passiva e perdita di H2S10,11,12, ossidazione spontanea di H2S11,12,13 e fotolisi14. Il solfuro nella soluzione originale si perde molto rapidamente a causa della volatilizzazione dell'H2S11. In un contenitore aperto, l'emivita (t1/2) dell'H2S è di circa 5 minuti e la sua concentrazione diminuisce di circa il 13% al minuto10. Sebbene la perdita di idrogeno solforato dalle soluzioni di NaHS avvenga in pochi minuti, alcuni studi su animali hanno utilizzato soluzioni di NaHS come fonte di idrogeno solforato nell'acqua potabile per 1-21 settimane, sostituendo la soluzione contenente NaHS ogni 12-24 ore.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Questa pratica non è coerente con i principi della ricerca scientifica, poiché i dosaggi dei farmaci dovrebbero essere basati sul loro utilizzo in altre specie, in particolare nell'uomo.27
La ricerca preclinica in biomedicina mira a migliorare la qualità dell'assistenza ai pazienti o gli esiti dei trattamenti. Tuttavia, i risultati della maggior parte degli studi sugli animali non sono ancora stati traslati all'uomo28,29,30. Una delle ragioni di questo fallimento traslazionale è la scarsa attenzione alla qualità metodologica degli studi sugli animali30. Pertanto, lo scopo di questo studio era di verificare se soluzioni di NaHS a 30 μM preparate in bottiglie d'acqua per ratti/topi potessero rimanere stabili nell'acqua potabile per 12-24 ore, come affermato o suggerito in alcuni studi.
Tutti gli esperimenti di questo studio sono stati condotti in conformità con le linee guida pubblicate per la cura e l'uso degli animali da laboratorio in Iran31. Tutti i rapporti sperimentali di questo studio hanno inoltre seguito le linee guida ARRIVE32. Il Comitato Etico dell'Istituto di Scienze Endocrine dell'Università di Scienze Mediche Shahid Beheshti ha approvato tutte le procedure sperimentali di questo studio.
L'acetato di zinco diidrato (CAS: 5970-45-6) e il cloruro ferrico anidro (CAS: 7705-08-0) sono stati acquistati da Biochem, Chemopharama (Cosne-sur-Loire, Francia). L'idrato di idrosolfuro di sodio (CAS: 207683-19-0) e la N,N-dimetil-p-fenilendiammina (DMPD) (CAS: 535-47-0) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). L'isoflurano è stato acquistato da Piramal (Bethlehem, PA, USA). L'acido cloridrico (HCl) è stato acquistato da Merck (Darmstadt, Germania).
Preparare una soluzione di NaHS (30 μM) in acqua potabile e versarla immediatamente nelle bottiglie d'acqua dei ratti/topi. Questa concentrazione è stata scelta sulla base di numerose pubblicazioni che utilizzano NaHS come fonte di H2S; vedere la sezione Discussione. NaHS è una molecola idratata che può contenere quantità variabili di acqua di idratazione (ovvero NaHS•xH2O); secondo il produttore, la percentuale di NaHS utilizzata nel nostro studio era del 70,7% (ovvero NaHS•1,3 H2O), e abbiamo tenuto conto di questo valore nei nostri calcoli, dove abbiamo utilizzato un peso molecolare di 56,06 g/mol, che è il peso molecolare di NaHS anidro. L'acqua di idratazione (chiamata anche acqua di cristallizzazione) è costituita dalle molecole d'acqua che compongono la struttura cristallina33. Gli idrati hanno proprietà fisiche e termodinamiche diverse rispetto agli anidri34.
Prima di aggiungere NaHS all'acqua potabile, misurare il pH e la temperatura del solvente. Versare immediatamente la soluzione di NaHS nella bottiglia d'acqua per ratti/topi nella gabbia degli animali. Campioni sono stati prelevati dalla punta e dall'interno della bottiglia d'acqua a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 e 24 ore per misurare il contenuto di solfuro. Le misurazioni del solfuro sono state effettuate immediatamente dopo ogni campionamento. Abbiamo prelevato campioni dalla punta del tubo perché alcuni studi hanno dimostrato che la piccola dimensione dei pori del tubo dell'acqua può ridurre al minimo l'evaporazione di H2S15,19. Questo problema sembra applicarsi anche alla soluzione nella bottiglia. Tuttavia, questo non era il caso per la soluzione nel collo della bottiglia d'acqua, che aveva un tasso di evaporazione più elevato ed era auto-ossidante; infatti, gli animali bevevano prima quest'acqua.
Nello studio sono stati utilizzati ratti Wistar maschi e femmine. I ratti sono stati alloggiati in gabbie di polipropilene (2-3 ratti per gabbia) in condizioni standard (temperatura 21-26 °C, umidità 32-40%) con 12 ore di luce (dalle 7:00 alle 19:00) e 12 ore di buio (dalle 19:00 alle 7:00). I ratti avevano libero accesso all'acqua del rubinetto e venivano alimentati con mangime standard (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Ratti Wistar femmine (n=10, peso corporeo: 190-230 g) e maschi (n=10, peso corporeo: 320-370 g) di pari età (6 mesi) sono stati suddivisi casualmente in gruppi di controllo e trattati con NaHS (30 μM) (n=5 per gruppo). Per determinare la dimensione del campione, abbiamo utilizzato l'approccio KISS (Keep It Simple, Stupid), che combina l'esperienza precedente e l'analisi di potenza35. Abbiamo innanzitutto condotto uno studio pilota su 3 ratti e determinato il livello medio di solfuro totale nel siero e la deviazione standard (8,1 ± 0,81 μM). Quindi, considerando una potenza dell'80% e assumendo un livello di significatività bilaterale del 5%, abbiamo determinato una dimensione preliminare del campione (n = 5 sulla base della letteratura precedente) che corrispondeva a una dimensione dell'effetto standardizzata di 2,02 con il valore predefinito suggerito da Festing per il calcolo della dimensione del campione di animali sperimentali35. Dopo aver moltiplicato questo valore per la SD (2,02 × 0,81), la dimensione dell'effetto rilevabile prevista (1,6 μM) era del 20%, che è accettabile. Ciò significa che n = 5/gruppo è sufficiente per rilevare una variazione media del 20% tra i gruppi. I ratti sono stati divisi casualmente in gruppi di controllo e trattati con NaSH utilizzando la funzione casuale del software Excel 36 (Figura supplementare 1). Il mascheramento è stato effettuato a livello di esito e i ricercatori che hanno eseguito le misurazioni biochimiche non erano a conoscenza dell'assegnazione ai gruppi.
I gruppi di ratti di entrambi i sessi trattati con NaHS sono stati sottoposti a una soluzione di NaHS 30 μM preparata in acqua potabile per 2 settimane; la soluzione fresca veniva fornita ogni 24 ore, durante le quali veniva misurato il peso corporeo. Campioni di sangue sono stati prelevati dalla punta della coda di tutti i ratti, in anestesia con isoflurano, a giorni alterni al termine della prima e della seconda settimana. I campioni di sangue sono stati centrifugati a 3000 g per 10 minuti, il siero è stato separato e conservato a –80 °C per la successiva misurazione di urea sierica, creatinina (Cr) e solfuro totale. L'urea sierica è stata determinata con il metodo enzimatico dell'ureasi e la creatinina sierica con il metodo fotometrico di Jaffe utilizzando kit disponibili in commercio (Man Company, Teheran, Iran) e un analizzatore automatico (Selectra E, numero di serie 0-2124, Paesi Bassi). I coefficienti di variazione intra- e inter-saggio per urea e Cr erano inferiori al 2,5%.
Il metodo del blu di metilene (MB) viene utilizzato per misurare il solfuro totale nell'acqua potabile e nel siero contenente NaHS; il MB è il metodo più comunemente utilizzato per misurare il solfuro in soluzioni di massa e campioni biologici11,37. Il metodo MB può essere utilizzato per stimare il pool totale di solfuro38 e misurare i solfuri inorganici sotto forma di H2S, HS- e S2 nella fase acquosa39. In questo metodo, lo zolfo viene precipitato come solfuro di zinco (ZnS) in presenza di acetato di zinco11,38. La precipitazione con acetato di zinco è il metodo più ampiamente utilizzato per separare i solfuri da altri cromofori11. Lo ZnS è stato ridisciolto utilizzando HCl11 in condizioni fortemente acide. Il solfuro reagisce con DMPD in un rapporto stechiometrico di 1:2 in una reazione catalizzata dal cloruro ferrico (Fe3+ agisce come agente ossidante) per formare il colorante MB, che viene rilevato spettrofotometricamente a 670 nm40,41. Il limite di rilevamento del metodo MB è di circa 1 μM11.
In questo studio, 100 μL di ciascun campione (soluzione o siero) sono stati aggiunti a una provetta; quindi sono stati aggiunti 200 μL di acetato di zinco (1% p/v in acqua distillata), 100 μL di DMPD (20 mM in HCl 7,2 M) e 133 μL di FeCl3 (30 mM in HCl 1,2 M). La miscela è stata incubata a 37 °C al buio per 30 minuti. La soluzione è stata centrifugata a 10.000 g per 10 minuti e l'assorbanza del surnatante è stata letta a 670 nm utilizzando un lettore di micropiastre (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Le concentrazioni di solfuro sono state determinate utilizzando una curva di calibrazione di NaHS (0–100 μM) in ddH2O (Figura supplementare 2). Tutte le soluzioni utilizzate per le misurazioni sono state preparate al momento. I coefficienti di variazione intra- e inter-saggio per le misurazioni del solfuro erano rispettivamente del 2,8% e del 3,4%. Abbiamo anche determinato il solfuro totale recuperato da campioni di acqua potabile e siero contenenti tiosolfato di sodio utilizzando il metodo del campione fortificato42. I recuperi per i campioni di acqua potabile e siero contenenti tiosolfato di sodio erano rispettivamente del 91 ± 1,1% (n = 6) e del 93 ± 2,4% (n = 6).
L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism versione 8.0.2 per Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). È stato utilizzato un test t appaiato per confrontare la temperatura e il pH dell'acqua potabile prima e dopo l'aggiunta di NaHS. La perdita di H2S nella soluzione contenente NaHS è stata calcolata come percentuale di diminuzione rispetto all'assorbimento basale e, per valutare se la perdita fosse statisticamente significativa, è stata eseguita un'ANOVA a una via per misure ripetute seguita dal test di confronto multiplo di Dunnett. Il peso corporeo, l'urea sierica, la creatinina sierica e il solfuro sierico totale nel tempo sono stati confrontati tra ratti di controllo e ratti trattati con NaHS di sesso diverso utilizzando un'ANOVA a due vie mista (tra e entro) seguita da un test post hoc di Bonferroni. I valori di P a due code < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
Il pH dell'acqua potabile era 7,60 ± 0,01 prima dell'aggiunta di NaHS e 7,71 ± 0,03 dopo l'aggiunta di NaHS (n = 13, p = 0,0029). La temperatura dell'acqua potabile era 26,5 ± 0,2 ed è diminuita a 26,2 ± 0,2 dopo l'aggiunta di NaHS (n = 13, p = 0,0128). Preparare una soluzione di NaHS 30 μM in acqua potabile e conservarla in una bottiglia d'acqua. La soluzione di NaHS è instabile e la sua concentrazione diminuisce nel tempo. Quando si preleva un campione dal collo della bottiglia d'acqua, è stata osservata una diminuzione significativa (68,0%) entro la prima ora e il contenuto di NaHS nella soluzione è diminuito del 72% e del 75% dopo 12 e 24 ore, rispettivamente. Nei campioni prelevati dalle bottiglie d'acqua, la riduzione di NaHS non è risultata significativa fino a 2 ore, ma dopo 12 e 24 ore si è ridotta rispettivamente del 47% e del 72%. Questi dati indicano che la percentuale di NaHS in una soluzione a 30 μM preparata in acqua potabile si è ridotta a circa un quarto del valore iniziale dopo 24 ore, indipendentemente dal punto di campionamento (Figura 1).
Stabilità della soluzione di NaHS (30 μM) nell'acqua potabile in bottiglie per ratti/topi. Dopo la preparazione della soluzione, sono stati prelevati campioni dalla punta e dall'interno della bottiglia d'acqua. I dati sono presentati come media ± DS (n = 6/gruppo). * e #, P < 0,05 rispetto al tempo 0. La fotografia della bottiglia d'acqua mostra la punta (con l'apertura) e il corpo della bottiglia. Il volume della punta è di circa 740 μL.
La concentrazione di NaHS nella soluzione appena preparata a 30 μM era di 30,3 ± 0,4 μM (intervallo: 28,7–31,9 μM, n = 12). Tuttavia, dopo 24 ore, la concentrazione di NaHS è diminuita a un valore inferiore (media: 3,0 ± 0,6 μM). Come mostrato nella Figura 2, le concentrazioni di NaHS a cui sono stati esposti i ratti non sono rimaste costanti durante il periodo di studio.
Il peso corporeo delle ratte femmine è aumentato significativamente nel tempo (da 205,2 ± 5,2 g a 213,8 ​​± 7,0 g nel gruppo di controllo e da 204,0 ± 8,6 g a 211,8 ± 7,5 g nel gruppo trattato con NaHS); tuttavia, il trattamento con NaHS non ha avuto alcun effetto sul peso corporeo (Fig. 3). Il peso corporeo dei ratti maschi è aumentato significativamente nel tempo (da 338,6 ± 8,3 g a 352,4 ± 6,0 g nel gruppo di controllo e da 352,4 ± 5,9 g a 363,2 ± 4,3 g nel gruppo trattato con NaHS); tuttavia, il trattamento con NaHS non ha avuto alcun effetto sul peso corporeo (Fig. 3).
Variazioni del peso corporeo in ratti femmine e maschi dopo somministrazione di NaHS (30 μM). I dati sono presentati come media ± errore standard (SEM) e sono stati confrontati utilizzando un'analisi della varianza mista a due vie (entro e tra gruppi) con test post hoc di Bonferroni. n = 5 per ciascun sesso in ogni gruppo.
Le concentrazioni sieriche di urea e creatina fosfato sono risultate comparabili nei ratti di controllo e in quelli trattati con NaSH per tutta la durata dello studio. Inoltre, il trattamento con NaSH non ha influenzato le concentrazioni sieriche di urea e creatinecromo (Tabella 1).
Le concentrazioni sieriche basali di solfuro totale erano comparabili tra ratti maschi (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) e femmine (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM) del gruppo di controllo e ratti trattati con NaHS. La somministrazione di NaHS per 14 giorni non ha avuto alcun effetto sui livelli sierici di solfuro totale né nei ratti maschi né in quelli femmine (Fig. 4).
Variazioni delle concentrazioni sieriche totali di solfuro in ratti maschi e femmine dopo somministrazione di NaHS (30 μM). I dati sono presentati come media ± errore standard (SEM) e sono stati confrontati utilizzando un'analisi della varianza mista a due vie (entro-entro) con test post hoc di Bonferroni. Per ciascun sesso, n = 5/gruppo.
La conclusione principale di questo studio è che l'acqua potabile contenente NaHS è instabile: solo circa un quarto del contenuto totale iniziale di solfuro può essere rilevato 24 ore dopo il prelievo di campioni dalla punta e dall'interno delle bottiglie d'acqua per ratti/topi. Inoltre, i ratti sono stati esposti a concentrazioni instabili di NaHS a causa della perdita di H2S nella soluzione di NaHS, e l'aggiunta di NaHS all'acqua potabile non ha influenzato il peso corporeo, l'urea e la creatinina sierica, né il solfuro sierico totale.
In questo studio, la velocità di perdita di H2S da soluzioni di NaHS a 30 μM preparate in acqua potabile è stata di circa il 3% all'ora. In una soluzione tampone (100 μM di solfuro di sodio in PBS 10 mM, pH 7,4), è stato riportato che la concentrazione di solfuro diminuisce del 7% nel tempo nell'arco di 8 ore11. Abbiamo precedentemente difeso la somministrazione intraperitoneale di NaHS riportando che la velocità di perdita di solfuro da una soluzione di NaHS a 54 μM in acqua potabile era di circa il 2,3% all'ora (4%/ora nelle prime 12 ore e 1,4%/ora nelle ultime 12 ore dopo la preparazione)8. Studi precedenti43 hanno riscontrato una perdita costante di H2S da soluzioni di NaHS, principalmente dovuta a volatilizzazione e ossidazione. Anche senza l'aggiunta di bolle, il solfuro nella soluzione madre viene rapidamente perso a causa della volatilizzazione dell'H2S11. Studi hanno dimostrato che durante il processo di diluizione, che richiede circa 30-60 secondi, circa il 5-10% di H2S viene perso per evaporazione6. Per prevenire l'evaporazione di H2S dalla soluzione, i ricercatori hanno adottato diverse misure, tra cui l'agitazione delicata della soluzione12, la copertura della soluzione madre con una pellicola di plastica6 e la minimizzazione dell'esposizione della soluzione all'aria, poiché la velocità di evaporazione di H2S dipende dall'interfaccia aria-liquido.13 L'ossidazione spontanea di H2S avviene principalmente a causa degli ioni dei metalli di transizione, in particolare del ferro ferrico, che sono impurità nell'acqua.13 L'ossidazione di H2S porta alla formazione di polisolfuri (atomi di zolfo legati da legami covalenti)11. Per evitare la sua ossidazione, le soluzioni contenenti H2S vengono preparate in solventi deossigenati44,45 e quindi spurgate con argon o azoto per 20-30 minuti per garantire la deossigenazione.11,12,37,44,45,46 L'acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA) è un chelante metallico (10–4 M) che previene l'autoossidazione di HS- in soluzioni aerobiche. In assenza di DTPA, il tasso di autoossidazione di HS- è di circa il 50% in circa 3 ore a 25°C37,47. Inoltre, poiché l'ossidazione del solfuro 1e- è catalizzata dalla luce ultravioletta, la soluzione deve essere conservata in ghiaccio e protetta dalla luce11.
Come mostrato in Figura 5, NaHS si dissocia in Na+ e HS-6 quando disciolto in acqua; questa dissociazione è determinata dal pK1 della reazione, che dipende dalla temperatura: pK1 = 3,122 + 1132/T, dove T varia da 5 a 30 °C ed è misurato in gradi Kelvin (K), K = °C + 273,1548. HS- ha un pK2 elevato (pK2 = 19), quindi a pH < 96,49, S2- non si forma o si forma in quantità molto piccole. Al contrario, HS- agisce da base e accetta H+ da una molecola di H2O, e H2O agisce da acido e viene convertita in H2S e OH-.
Formazione di gas H2S disciolto in soluzione di NaHS (30 µM). aq, soluzione acquosa; g, gas; l, liquido. Tutti i calcoli presuppongono un pH dell'acqua pari a 7,0 e una temperatura dell'acqua pari a 20 °C. Creato con BioRender.com.
Nonostante le prove che le soluzioni di NaHS siano instabili, diversi studi su animali hanno utilizzato soluzioni di NaHS nell'acqua potabile come composto donatore di H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 con durate di intervento che vanno da 1 a 21 settimane (Tabella 2). Durante questi studi, la soluzione di NaHS è stata rinnovata ogni 12 h, 15, 17, 18, 24, 25 h o 24 h, 19, 20, 21, 22, 23 h. I nostri risultati hanno mostrato che i ratti sono stati esposti a concentrazioni di farmaco instabili a causa della perdita di H2S dalla soluzione di NaHS e il contenuto di NaHS nell'acqua potabile dei ratti ha fluttuato significativamente nell'arco di 12 o 24 ore (vedi Figura 2). Due di questi studi hanno riportato che i livelli di H2S nell'acqua sono rimasti stabili per 24 ore22 o che sono state osservate perdite di H2S pari solo al 2-3% in 12 ore15, ma non hanno fornito dati a supporto o dettagli di misurazione. Due studi hanno dimostrato che il piccolo diametro delle bottiglie d'acqua può ridurre al minimo l'evaporazione di H2S15,19. Tuttavia, i nostri risultati hanno mostrato che ciò potrebbe ritardare la perdita di H2S da una bottiglia d'acqua solo di 2 ore anziché di 12-24 ore. Entrambi gli studi notano che abbiamo ipotizzato che il livello di NaHS nell'acqua potabile non sia cambiato perché non abbiamo osservato un cambiamento di colore nell'acqua; pertanto, l'ossidazione di H2S da parte dell'aria non è stata significativa19,20. Sorprendentemente, questo metodo soggettivo valuta la stabilità di NaHS nell'acqua piuttosto che misurare la variazione della sua concentrazione nel tempo.
La perdita di H2S in soluzione di NaHS è correlata al pH e alla temperatura. Come osservato nel nostro studio, la dissoluzione di NaHS in acqua determina la formazione di una soluzione alcalina50. Quando NaHS viene disciolto in acqua, la formazione di gas H2S disciolto dipende dal valore del pH6. Più basso è il pH della soluzione, maggiore è la proporzione di NaHS presente come molecole di gas H2S e maggiore è la quantità di solfuro persa dalla soluzione acquosa11. Nessuno di questi studi ha riportato il pH dell'acqua potabile utilizzata come solvente per NaHS. Secondo le raccomandazioni dell'OMS, adottate dalla maggior parte dei paesi, il pH dell'acqua potabile dovrebbe essere compreso tra 6,5 ​​e 8,551. In questo intervallo di pH, la velocità di ossidazione spontanea di H2S aumenta di circa dieci volte13. La dissoluzione di NaHS in acqua in questo intervallo di pH comporterà una concentrazione di gas H2S disciolto da 1 a 22,5 μM, il che sottolinea l'importanza di monitorare il pH dell'acqua prima di sciogliere NaHS. Inoltre, l'intervallo di temperatura riportato nello studio sopra citato (18–26 °C) comporterebbe una variazione della concentrazione di gas H2S disciolto nella soluzione di circa il 10%, poiché le variazioni di temperatura modificano il pK1 e piccole variazioni del pK1 possono avere un impatto significativo sulla concentrazione di gas H2S disciolto48. In aggiunta, la lunga durata di alcuni studi (5 mesi)22, durante la quale è prevista un'ampia variabilità di temperatura, aggrava ulteriormente questo problema.
Tutti gli studi, tranne uno21, hanno utilizzato una soluzione di NaHS a 30 μM nell'acqua potabile. Per spiegare la dose utilizzata (ovvero 30 μM), alcuni autori hanno sottolineato che l'NaHS in fase acquosa produce esattamente la stessa concentrazione di gas H2S e che l'intervallo fisiologico di H2S è compreso tra 10 e 100 μM, quindi questa dose rientra nell'intervallo fisiologico15,16. Altri hanno spiegato che 30 μM di NaHS possono mantenere il livello plasmatico di H2S entro l'intervallo fisiologico, ovvero 5-300 μM19,20. Consideriamo la concentrazione di NaHS in acqua di 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), che è stata utilizzata in alcuni studi per studiare gli effetti dell'H2S. Possiamo calcolare che la concentrazione di gas H2S disciolto è di 14,7 μM, che è circa il 50% della concentrazione iniziale di NaHS. Questo valore è simile al valore calcolato da altri autori nelle stesse condizioni13,48.
Nel nostro studio, la somministrazione di NaHS non ha modificato il peso corporeo; questo risultato è coerente con i risultati di altri studi su topi maschi22,23 e ratti maschi18; tuttavia, due studi hanno riportato che NaSH ha ripristinato il peso corporeo ridotto nei ratti nefrectomizzati24,26, mentre altri studi non hanno riportato l'effetto della somministrazione di NaSH sul peso corporeo15,16,17,19,20,21,25. Inoltre, nel nostro studio, la somministrazione di NaSH non ha influenzato i livelli sierici di urea e creatina cromo, il che è coerente con i risultati di un altro rapporto25.
Lo studio ha rilevato che l'aggiunta di NaHS all'acqua potabile per 2 settimane non ha influenzato le concentrazioni sieriche totali di solfuro nei ratti maschi e femmine. Questo risultato è coerente con i risultati di Sen et al. (16): 8 settimane di trattamento con 30 μM di NaHS nell'acqua potabile non hanno influenzato i livelli plasmatici di solfuro nei ratti di controllo; tuttavia, hanno riportato che questo intervento ha ripristinato i livelli ridotti di H2S nel plasma dei topi nefrectomizzati. Anche Li et al. (22) hanno riportato che il trattamento con 30 μM di NaHS nell'acqua potabile per 5 mesi ha aumentato i livelli plasmatici di solfuro libero nei topi anziani di circa il 26%. Altri studi non hanno riportato cambiamenti nel solfuro circolante dopo l'aggiunta di NaHS all'acqua potabile.
Sette studi hanno riportato l'utilizzo di NaHS Sigma15,16,19,20,21,22,23 ma non hanno fornito ulteriori dettagli sull'acqua di idratazione, e cinque studi non hanno menzionato la fonte di NaHS utilizzata nei loro metodi di preparazione17,18,24,25,26. Il NaHS è una molecola idratata e il suo contenuto di acqua di idratazione può variare, il che influisce sulla quantità di NaHS necessaria per preparare una soluzione di una data molarità. Ad esempio, il contenuto di NaHS nel nostro studio era NaHS•1,3 H2O. Pertanto, le concentrazioni effettive di NaHS in questi studi potrebbero essere inferiori a quelle riportate.
"Come può un composto dalla vita così breve avere un effetto così duraturo?" Pozgay et al.21 si sono posti questa domanda valutando gli effetti del NaHS sulla colite nei topi. Sperano che studi futuri possano rispondere a questo quesito e ipotizzano che le soluzioni di NaHS possano contenere polisolfuri più stabili, oltre all'H2S e ai disolfuri che mediano l'effetto del NaHS21. Un'altra possibilità è che concentrazioni molto basse di NaHS che rimangono in soluzione possano avere un effetto benefico. Infatti, Olson et al. hanno fornito prove che livelli micromolari di H2S nel sangue non sono fisiologici e dovrebbero essere nell'intervallo nanomolare o del tutto assenti13. L'H2S può agire attraverso la solfatazione delle proteine, una modificazione post-traduzionale reversibile che influenza la funzione, la stabilità e la localizzazione di molte proteine52,53,54. Infatti, in condizioni fisiologiche, circa il 10-25% di molte proteine ​​epatiche sono solfilate53. Entrambi gli studi riconoscono la rapida distruzione del NaHS19,23 ma sorprendentemente affermano che "abbiamo controllato la concentrazione di NaHS nell'acqua potabile sostituendola quotidianamente".23 Uno studio ha accidentalmente affermato che "il NaHS è un donatore standard di H2S ed è comunemente usato nella pratica clinica per sostituire l'H2S stesso".18
La discussione precedente mostra che il NaHS si perde dalla soluzione per volatilizzazione, ossidazione e fotolisi, e pertanto vengono forniti alcuni suggerimenti per ridurre la perdita di H2S dalla soluzione. In primo luogo, l'evaporazione dell'H2S dipende dall'interfaccia gas-liquido13 e dal pH della soluzione11; pertanto, per minimizzare la perdita per evaporazione, il collo della bottiglia d'acqua può essere reso il più piccolo possibile come descritto in precedenza15,19, e il pH dell'acqua può essere regolato a un limite superiore accettabile (ovvero 6,5–8,551) per minimizzare la perdita per evaporazione11. In secondo luogo, l'ossidazione spontanea dell'H2S si verifica a causa degli effetti dell'ossigeno e della presenza di ioni di metalli di transizione nell'acqua potabile13, quindi la deossigenazione dell'acqua potabile con argon o azoto44,45 e l'uso di chelanti metallici37,47 possono ridurre l'ossidazione dei solfuri. In terzo luogo, per prevenire la fotodecomposizione dell'H2S, le bottiglie d'acqua possono essere avvolte con un foglio di alluminio; Questa pratica si applica anche a materiali fotosensibili come la streptozotocina55. Infine, i sali di solfuro inorganico (NaHS, Na2S e CaS) possono essere somministrati tramite sondino gastrico anziché disciolti nell'acqua potabile come precedentemente riportato56,57,58; studi hanno dimostrato che il solfuro di sodio radioattivo somministrato tramite sondino gastrico ai ratti viene ben assorbito e distribuito praticamente in tutti i tessuti59. Ad oggi, la maggior parte degli studi ha somministrato sali di solfuro inorganico per via intraperitoneale; tuttavia, questa via è raramente utilizzata in ambito clinico60. D'altra parte, la via orale è la via di somministrazione più comune e preferita nell'uomo61. Pertanto, raccomandiamo di valutare gli effetti dei donatori di H2S nei roditori tramite sondino gastrico.
Un limite è rappresentato dal fatto che abbiamo misurato il solfuro in soluzione acquosa e nel siero utilizzando il metodo MB. I metodi per la misurazione del solfuro includono la titolazione con iodio, la spettrofotometria, il metodo elettrochimico (potenziometria, amperometria, metodo coulometrico e metodo amperometrico) e la cromatografia (cromatografia gassosa e cromatografia liquida ad alta prestazione), tra i quali il metodo più comunemente utilizzato è il metodo spettrofotometrico MB62. Un limite del metodo MB per la misurazione dell'H2S nei campioni biologici è che misura tutti i composti contenenti zolfo e non l'H2S libero63 perché viene eseguito in condizioni acide, il che comporta l'estrazione dello zolfo dalla fonte biologica64. Tuttavia, secondo l'American Public Health Association, MB è il metodo standard per la misurazione del solfuro nell'acqua65. Pertanto, questo limite non influenza i nostri risultati principali sull'instabilità delle soluzioni contenenti NaHS. Inoltre, nel nostro studio, il recupero delle misurazioni del solfuro in campioni di acqua e siero contenenti NaHS è stato rispettivamente del 91% e del 93%. Questi valori sono in linea con gli intervalli precedentemente riportati (77–92)66, indicando una precisione analitica accettabile42. Vale la pena notare che abbiamo utilizzato sia ratti maschi che femmine in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH) per evitare un eccessivo affidamento su studi su animali solo maschi negli studi preclinici67 e per includere sia ratti maschi che femmine quando possibile68. Questo punto è stato sottolineato da altri69,70,71.
In conclusione, i risultati di questo studio indicano che le soluzioni di NaHS preparate a partire da acqua potabile non possono essere utilizzate per generare H2S a causa della loro instabilità. Questa via di somministrazione esporrebbe gli animali a livelli di NaHS instabili e inferiori a quelli previsti; pertanto, i risultati potrebbero non essere applicabili agli esseri umani.
I set di dati utilizzati e/o analizzati nel corso del presente studio sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta motivata.
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