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La contaminazione da cadmio (Cd) rappresenta una potenziale minaccia per la sicurezza della coltivazione della pianta medicinale Panax notoginseng nello Yunnan. In condizioni di stress da Cd esogeno, sono stati condotti esperimenti sul campo per comprendere gli effetti dell'applicazione di calce (0, 750, 2250 e 3750 kg/h/m²) e dell'irrorazione fogliare con acido ossalico (0, 0,1 e 0,2 mol/L) sull'accumulo di Cd e sugli antiossidanti. Componenti sistemici e medicinali di Panax notoginseng. I risultati hanno mostrato che in condizioni di stress da Cd, la calce e l'irrorazione fogliare con acido ossalico potrebbero aumentare il contenuto di Ca2+ di Panax notoginseng e ridurre la tossicità di Cd2+. L'aggiunta di calce e acido ossalico ha aumentato l'attività degli enzimi antiossidanti e modificato il metabolismo dei regolatori osmotici. Il più significativo è l'aumento dell'attività CAT di 2,77 volte. Sotto l'influenza dell'acido ossalico, l'attività della SOD è aumentata di 1,78 volte. Il contenuto di MDA è diminuito del 58,38%. Esiste una correlazione molto significativa con zuccheri solubili, amminoacidi liberi, prolina e proteine ​​solubili. Calce e acido ossalico possono aumentare il contenuto di ioni calcio (Ca2+) di Panax notoginseng, ridurre il contenuto di Cd, migliorare la resistenza allo stress di Panax notoginseng e aumentare la produzione di saponine e flavonoidi totali. Il contenuto di Cd è il più basso, inferiore del 68,57% rispetto al controllo, e corrisponde al valore standard (Cd≤0,5 mg kg-1, GB/T 19086-2008). La percentuale di SPN è stata del 7,73%, raggiungendo il livello più alto tra tutti i trattamenti, e il contenuto di flavonoidi è aumentato significativamente del 21,74%, raggiungendo valori medici standard e una resa ottimale.
Il cadmio (Cd) è un contaminante comune nei terreni coltivati, migra facilmente e ha una significativa tossicità biologica. El-Shafei et al.2 hanno riferito che la tossicità del cadmio influisce sulla qualità e sulla produttività delle piante utilizzate. Livelli eccessivi di cadmio nei terreni coltivati ​​nella Cina sud-occidentale sono diventati gravi negli ultimi anni. La provincia dello Yunnan è il regno della biodiversità cinese, con specie di piante medicinali al primo posto nel paese. Tuttavia, la provincia dello Yunnan è ricca di risorse minerarie e il processo di estrazione porta inevitabilmente all'inquinamento da metalli pesanti nel suolo, che influisce sulla produzione di piante medicinali locali.
Il Panax notoginseng (Burkill) Chen3) è una pianta erbacea perenne medicinale molto preziosa appartenente al genere Panax della famiglia delle Araliaceae. Il Panax notoginseng migliora la circolazione sanguigna, elimina il ristagno di sangue e allevia il dolore. La principale area di produzione è la prefettura di Wenshan, provincia dello Yunnan5. Oltre il 75% del terreno nelle aree di coltivazione locali del ginseng Panax notoginseng è contaminato da cadmio, con livelli che variano dall'81% a oltre il 100% in diverse aree6. L'effetto tossico del Cd riduce anche significativamente la produzione di componenti medicinali del Panax notoginseng, in particolare saponine e flavonoidi. Le saponine sono un tipo di composto glicosidico i cui agliconi sono triterpenoidi o spirostani. Sono i principali principi attivi di molte medicine tradizionali cinesi e contengono saponine. Alcune saponine possiedono anche attività antibatterica o preziose attività biologiche come effetti antipiretici, sedativi e antitumorali7. I flavonoidi si riferiscono generalmente a una serie di composti in cui due anelli benzenici con gruppi idrossilici fenolici sono collegati tramite tre atomi di carbonio centrali. Il nucleo principale è il 2-fenilcromanone 8. È un potente antiossidante in grado di eliminare efficacemente i radicali liberi dell'ossigeno nelle piante. Può anche inibire la penetrazione degli enzimi biologici infiammatori, promuovere la guarigione delle ferite e il sollievo dal dolore e abbassare i livelli di colesterolo. È uno dei principali ingredienti attivi del Panax notoginseng. È urgente affrontare il problema della contaminazione da cadmio nei terreni nelle aree di produzione del Panax ginseng e garantire la produzione dei suoi ingredienti medicinali essenziali.
La calce è uno dei passivatori ampiamente utilizzati per la purificazione stazionaria del suolo dalla contaminazione da cadmio10. Influisce sull'adsorbimento e la deposizione di Cd nel suolo riducendone la biodisponibilità attraverso l'aumento del pH e la modifica della capacità di scambio cationico (CSC), della saturazione salina (BS) e del potenziale redox (Eh) del suolo3, 11. Inoltre, la calce fornisce una grande quantità di Ca2+, forma un antagonismo ionico con Cd2+, compete per i siti di adsorbimento nelle radici, impedisce il trasporto di Cd nel suolo e ha una bassa tossicità biologica. Quando sono stati aggiunti 50 mmol L-1 di Ca in condizioni di stress da Cd, il trasporto di Cd nelle foglie di sesamo è stato inibito e l'accumulo di Cd è stato ridotto dell'80%. Numerosi studi simili sono stati riportati sul riso (Oryza sativa L.) e altre colture12,13.
L'irrorazione fogliare delle colture per controllare l'accumulo di metalli pesanti è un nuovo metodo per il controllo dei metalli pesanti negli ultimi anni. Il suo principio è principalmente legato alla reazione di chelazione nelle cellule vegetali, che provoca la deposizione di metalli pesanti sulla parete cellulare e inibisce l'assorbimento di metalli pesanti da parte delle piante14,15. Come agente chelante diacido stabile, l'acido ossalico può chelare direttamente gli ioni dei metalli pesanti nelle piante, riducendone così la tossicità. La ricerca ha dimostrato che l'acido ossalico nella soia può chelare il Cd2+ e rilasciare cristalli contenenti Cd attraverso le cellule superiori del tricoma, riducendo i livelli di Cd2+ nell'organismo16. L'acido ossalico può regolare il pH del terreno, migliorare l'attività della superossido dismutasi (SOD), della perossidasi (POD) e della catalasi (CAT) e regolare la penetrazione di zuccheri solubili, proteine ​​solubili, amminoacidi liberi e prolina. Regolatori metabolici17,18. L'acido e l'eccesso di Ca2+ nella pianta formano un precipitato di ossalato di calcio sotto l'azione delle proteine ​​nucleanti. Regolando la concentrazione di Ca2+ nelle piante si può ottenere efficacemente la regolazione dell'acido ossalico e del Ca2+ disciolti nelle piante, evitandone l'accumulo eccessivo19,20.
La quantità di calce applicata è uno dei fattori chiave che influenzano l'effetto riparativo. È stato riscontrato che il dosaggio di calce variava da 750 a 6000 kg/m². Per terreni acidi con un pH compreso tra 5,0 e 5,5, l'effetto dell'applicazione di calce a una dose di 3000-6000 kg/h/m² è significativamente superiore rispetto a una dose di 750 kg/h/m²21. Tuttavia, un'applicazione eccessiva di calce può provocare alcuni effetti negativi sul terreno, come variazioni significative del pH e compattazione del terreno22. Pertanto, abbiamo definito i livelli di trattamento con CaO come 0, 750, 2250 e 3750 kg hm-². Quando l'acido ossalico è stato applicato ad Arabidopsis thaliana, si è riscontrato che il Ca2+ è stato significativamente ridotto a una concentrazione di 10 mmol L-1 e che la famiglia genica CRT, che influenza la segnalazione del Ca2+, ha risposto in modo significativo20. L'accumulo di alcuni studi precedenti ci ha permesso di determinare la concentrazione di questo test e di approfondire l'effetto dell'interazione di integratori esogeni su Ca2+ e Cd2+23,24,25. Pertanto, questo studio mira a esplorare il meccanismo di regolazione della calce esogena e dell'acido ossalico spray fogliare sul contenuto di Cd e sulla tolleranza allo stress di Panax notoginseng in terreni contaminati da Cd e ad esplorare ulteriormente i modi per garantire al meglio la qualità e l'efficacia medicinale. Produzione di Panax notoginseng. Fornisce preziose indicazioni su come aumentare la scala di coltivazione di piante erbacee in terreni contaminati da cadmio e raggiungere la produzione sostenibile e di alta qualità richiesta dal mercato farmaceutico.
Utilizzando la varietà locale di ginseng Wenshan Panax notoginseng come materiale, è stato condotto un esperimento sul campo a Lannizhai, contea di Qiubei, prefettura di Wenshan, provincia dello Yunnan (24°11′N, 104°3′E, altitudine 1446 m). La temperatura media annua è di 17°C e la precipitazione media annua è di 1250 mm. I valori di fondo del suolo studiato erano TN 0,57 g kg-1, TP 1,64 g kg-1, TC 16,31 g kg-1, OM 31,86 g kg-1, N idrolizzato alcalino 88,82 mg kg-1, fosforo libero 18,55 mg kg-1, potassio libero 100,37 mg kg-1, cadmio totale 0,3 mg kg-1, pH 5,4.
Il 10 dicembre 2017, 6 mg/kg di Cd2+ (CdCl2·2,5H2O) e un trattamento a base di calce (0, 750, 2250 e 3750 kg/h/m2) sono stati miscelati e applicati sulla superficie del terreno in uno strato di 0~10 cm su ogni parcella. Ogni trattamento è stato ripetuto 3 volte. Le parcelle di prova sono state disposte in modo casuale, ciascuna con una superficie di 3 m2. Le piantine di Panax notoginseng di un anno sono state trapiantate dopo 15 giorni di lavorazione. Utilizzando una rete parasole, l'intensità luminosa del Panax notoginseng all'interno della rete è circa il 18% della normale intensità luminosa naturale. La coltivazione viene effettuata secondo i metodi di coltivazione tradizionali locali. Prima della fase di maturazione del Panax notoginseng nel 2019, spruzzare acido ossalico sotto forma di ossalato di sodio. Le concentrazioni di acido ossalico erano rispettivamente di 0, 0,1 e 0,2 mol L-1, e NaOH è stato utilizzato per regolare il pH a 5,16 per simulare il pH medio della soluzione di lisciviazione della lettiera. Spruzzare le superfici superiore e inferiore delle foglie una volta a settimana alle 8:00. Dopo 4 spruzzate nella quinta settimana, sono state raccolte le piante di Panax notoginseng di 3 anni.
Nel novembre 2019, piante di Panax notoginseng di tre anni sono state raccolte dal campo e irrorate con acido ossalico. Alcuni campioni di piante di Panax notoginseng di tre anni, di cui era necessario misurare il metabolismo fisiologico e l'attività enzimatica, sono stati inseriti in provette per il congelamento, rapidamente congelati con azoto liquido e quindi trasferiti in frigorifero a -80 °C. Alcuni campioni di radici, di cui si desiderava misurare il contenuto di Cd e di principio attivo a maturità, sono stati lavati con acqua di rubinetto, essiccati a 105 °C per 30 minuti, mantenuti a peso costante a 75 °C e macinati in un mortaio per la conservazione.
Pesare 0,2 g di campione vegetale secco, metterlo in una beuta, aggiungere 8 ml di HNO3 e 2 ml di HClO4 e coprire per una notte. Il giorno successivo, utilizzare un imbuto curvo inserito in una beuta per la digestione elettrotermica fino alla comparsa di fumo bianco e alla comparsa di succhi gastrici limpidi. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, la miscela è stata trasferita in un matraccio tarato da 10 ml. Il contenuto di Cd è stato determinato utilizzando uno spettrometro ad assorbimento atomico (Thermo ICE™ 3300 AAS, USA). (GB/T 23739-2009).
Pesare 0,2 g di campione vegetale secco, metterlo in una bottiglia di plastica da 50 ml, aggiungere 1 mol L-1 di HCl in 10 ml, tappare e agitare bene per 15 ore, quindi filtrare. Utilizzando una pipetta, prelevare la quantità necessaria di filtrato, diluirla opportunamente e aggiungere la soluzione di SrCl2 per portare la concentrazione di Sr2+ a 1 g L-1. Il contenuto di Ca è stato misurato utilizzando uno spettrometro ad assorbimento atomico (Thermo ICE™ 3300 AAS, USA).
Metodo del kit di riferimento per malondialdeide (MDA), superossido dismutasi (SOD), perossidasi (POD) e catalasi (CAT) (DNM-9602, Beijing Prong New Technology Co., Ltd., registrazione del prodotto), utilizzare il kit di misurazione corrispondente. N.: Beijing Pharmacopoeia (accurate) 2013 n. 2400147).
Pesare circa 0,05 g di campione di Panax notoginseng e aggiungere il reagente acido solforico-antrone lungo i lati della provetta. Agitare la provetta per 2-3 secondi per miscelare accuratamente il liquido. Posizionare la provetta su un portaprovette per sviluppare il colore per 15 minuti. Il contenuto di zucchero solubile è stato determinato mediante spettrofotometria ultravioletta-visibile (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Cina) a una lunghezza d'onda di 620 nm.
Pesare 0,5 g di un campione fresco di Panax notoginseng, macinarlo fino a ottenere un omogeneizzato con 5 ml di acqua distillata, quindi centrifugare a 10.000 g per 10 minuti. Il surnatante è stato diluito a volume fisso. È stato utilizzato il metodo Coomassie Brilliant Blue. Il contenuto proteico solubile è stato misurato utilizzando la spettrofotometria ultravioletta-visibile (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Cina) a una lunghezza d'onda di 595 nm e calcolato sulla base della curva standard dell'albumina sierica bovina.
Pesare 0,5 g di campione fresco, aggiungere 5 ml di acido acetico al 10%, macinare fino a ottenere un omogeneizzato, filtrare e diluire a volume costante. Il metodo di sviluppo del colore è stato utilizzato con una soluzione di ninidrina. Il contenuto di amminoacidi liberi è stato determinato mediante spettrofotometria UV-visibile (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Cina) a 570 nm e calcolato in base alla curva standard della leucina28.
Pesare 0,5 g di un campione fresco, aggiungere 5 ml di una soluzione al 3% di acido solfosalicilico, riscaldare a bagnomaria e agitare per 10 minuti. Dopo il raffreddamento, la soluzione è stata filtrata e portata a volume costante. È stato utilizzato il metodo colorimetrico con ninidrina acida. Il contenuto di prolina è stato determinato mediante spettrofotometria ultravioletta-visibile (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Cina) a una lunghezza d'onda di 520 nm e calcolato sulla base della curva standard della prolina29.
Il contenuto di saponina è stato determinato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HLP) con riferimento alla Farmacopea della Repubblica Popolare Cinese (edizione 2015). Il principio di base della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HLP) consiste nell'utilizzare un liquido ad alta pressione come fase mobile e applicare la tecnologia di separazione delle particelle ultrafini della cromatografia su colonna ad alte prestazioni alla fase stazionaria. La tecnica operativa è la seguente:
Condizioni HPLC e test di idoneità del sistema (Tabella 1): utilizzare gel di silice legato all'ottadecilsilano come riempitivo, acetonitrile come fase mobile A e acqua come fase mobile B. Eseguire l'eluizione in gradiente come mostrato nella tabella seguente. La lunghezza d'onda di rilevamento è 203 nm. In base al picco R1 delle saponine totali di Panax notoginseng, il numero teorico di piastre dovrebbe essere almeno 4000.
Preparazione della soluzione standard: pesare accuratamente ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 e notoginsenoside R1 e aggiungere metanolo per preparare una miscela contenente 0,4 mg di ginsenoside Rg1, 0,4 mg di ginsenoside Rb1 e 0,1 mg di notoginsenoside R1 per 1 ml di soluzione.
Preparazione della soluzione di prova: pesare 0,6 g di polvere di Panax ginseng e aggiungere 50 ml di metanolo. La soluzione miscelata è stata pesata (W1) e lasciata riposare per una notte. La soluzione miscelata è stata quindi fatta bollire lentamente a bagnomaria a 80 °C per 2 ore. Dopo il raffreddamento, pesare la soluzione miscelata e aggiungere il metanolo preparato alla prima massa W1. Quindi agitare bene e filtrare. Il filtrato viene lasciato per l'analisi.
Raccogliere accuratamente 10 μL della soluzione standard e 10 μL del filtrato e iniettarli in un cromatografo liquido ad alte prestazioni (Thermo HPLC-ultimate 3000, Seymour Fisher Technology Co., Ltd.) per determinare il contenuto di saponina 24.
Curva standard: misurazione di una soluzione standard mista di Rg1, Rb1 e R1. Le condizioni cromatografiche sono le stesse di cui sopra. Calcolare la curva standard riportando l'area del picco misurata sull'asse y e la concentrazione di saponina nella soluzione standard sull'asse x. La concentrazione di saponina può essere calcolata sostituendo l'area del picco misurata del campione nella curva standard.
Pesare 0,1 g di campione di P. notogensings e aggiungere 50 ml di soluzione di CH3OH al 70%. L'estrazione a ultrasuoni è stata effettuata per 2 ore, seguita da centrifugazione a 4000 giri/min per 10 minuti. Prelevare 1 ml di surnatante e diluirlo 12 volte. Il contenuto di flavonoidi è stato determinato utilizzando la spettrofotometria ultravioletta-visibile (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Cina) a una lunghezza d'onda di 249 nm. La quercetina è una delle sostanze comuni standard8.
I dati sono stati organizzati utilizzando il software Excel 2010. Per l'analisi della varianza dei dati è stato utilizzato il software statistico SPSS 20. Le immagini sono state disegnate utilizzando Origin Pro 9.1. I valori statistici calcolati includono media ± DS. Le affermazioni di significatività statistica si basano su P < 0,05.
Alla stessa concentrazione di acido ossalico spruzzato sulle foglie, il contenuto di Ca nelle radici di Panax notoginseng è aumentato significativamente con l'aumentare della quantità di calce applicata (Tabella 2). Rispetto all'assenza di calce, il contenuto di Ca è aumentato del 212% aggiungendo 3750 kg/h/m² di calce senza spruzzare acido ossalico. A parità di quantità di calce applicata, il contenuto di Ca è aumentato leggermente con l'aumentare della concentrazione di acido ossalico spruzzato.
Il contenuto di Cd nelle radici varia da 0,22 a 0,70 mg/kg. Alla stessa concentrazione di acido ossalico, all'aumentare della quantità di calce aggiunta, il contenuto di Cd di 2250 kg/h diminuisce significativamente. Rispetto al controllo, il contenuto di Cd nelle radici è diminuito del 68,57% dopo l'irrorazione con 2250 kg di calce hm-2 e 0,1 mol/l di acido ossalico. Con l'applicazione di calce senza calce e con 750 kg/h di calce, il contenuto di Cd nelle radici di Panax notoginseng è diminuito significativamente con l'aumentare della concentrazione di acido ossalico. Con l'applicazione di calce 2250 kg/m2 e calce 3750 kg/m2, il contenuto di Cd nelle radici è prima diminuito e poi aumentato con l'aumentare della concentrazione di acido ossalico. Inoltre, l'analisi bivariata ha mostrato che la calce ha avuto un effetto significativo sul contenuto di Ca delle radici di Panax notoginseng (F = 82,84**), la calce ha avuto un effetto significativo sul contenuto di Cd nelle radici di Panax notoginseng (F = 74,99**) e l'acido ossalico (F=7,72*).
Con l'aumentare della quantità di calce aggiunta e della concentrazione di acido ossalico spruzzato, il contenuto di MDA è diminuito significativamente. Non si è osservata alcuna differenza significativa nel contenuto di MDA nelle radici di Panax notoginseng senza aggiunta di calce e con l'aggiunta di 3750 kg/m² di calce. Con velocità di applicazione di 750 kg/h/m² e 2250 kg/h/m², il contenuto di calce del trattamento a spruzzo con acido ossalico 0,2 mol/L è diminuito rispettivamente del 58,38% e del 40,21%, rispetto al trattamento senza acido ossalico. Il contenuto di MDA più basso (7,57 nmol g-1) è stato osservato spruzzando 750 kg di calce hm-2 e 0,2 mol l-1 di acido ossalico (Fig. 1).
Effetto dell'irrorazione fogliare con acido ossalico sul contenuto di malondialdeide nelle radici di Panax notoginseng sottoposte a stress da cadmio. Nota: la legenda nella figura indica la concentrazione di acido ossalico al momento dell'irrorazione (mol L-1); lettere minuscole diverse indicano differenze significative tra i trattamenti della stessa applicazione di calce. numero (P < 0,05). Lo stesso di seguito.
Ad eccezione dell'applicazione di 3750 kg/h di calce, non si è osservata alcuna differenza significativa nell'attività della SOD nelle radici di Panax notoginseng. Aggiungendo 0, 750 e 2250 kg/h/m² di calce, l'attività della SOD trattata mediante irrorazione con acido ossalico a una concentrazione di 0,2 mol/l è risultata significativamente superiore rispetto a quella senza l'uso di acido ossalico, aumentando rispettivamente del 177,89%, del 61,62% e del 45,08%. L'attività della SOD nelle radici (598,18 U g-1) è risultata più elevata in assenza di applicazione di calce e quando trattate mediante irrorazione con acido ossalico a una concentrazione di 0,2 mol/l. Quando l'acido ossalico è stato spruzzato alla stessa concentrazione o a 0,1 mol L-1, l'attività della SOD è aumentata con l'aumentare della quantità di calce aggiunta. Dopo l'irrorazione con acido ossalico a 0,2 mol/L, l'attività della SOD è diminuita significativamente (Fig. 2).
Effetto della spruzzatura delle foglie con acido ossalico sull'attività della superossido dismutasi, perossidasi e catalasi nelle radici di Panax notoginseng sotto stress da cadmio
Analogamente all'attività della SOD nelle radici, l'attività della POD nelle radici trattate senza calce e irrorate con 0,2 mol L-1 di acido ossalico è stata la più elevata (63,33 µmol g-1), ovvero il 148,35% in più rispetto al controllo (25,50 µmol g-1). Con l'aumento della concentrazione di acido ossalico nebulizzato e il trattamento con 3750 kg/m2 di calce, l'attività della POD è prima aumentata e poi diminuita. Rispetto al trattamento con 0,1 mol L-1 di acido ossalico, l'attività della POD trattata con 0,2 mol L-1 di acido ossalico è diminuita del 36,31% (Fig. 2).
Ad eccezione dell'irrorazione di acido ossalico 0,2 mol/l e dell'aggiunta di 2250 kg/h/m2 o 3750 kg/h/m2 di calce, l'attività CAT è risultata significativamente più elevata rispetto al controllo. Con l'irrorazione di acido ossalico 0,1 mol/l e l'aggiunta di 0,2250 kg/m2 o 3750 kg/h/m2 di calce, l'attività CAT è aumentata rispettivamente del 276,08%, 276,69% ​​e 33,05%, rispetto al trattamento senza irrorazione di acido ossalico. L'attività CAT nelle radici è stata più elevata (803,52 μmol/g) nel trattamento senza calce e nel trattamento con acido ossalico 0,2 mol/L. L'attività CAT è risultata più bassa (172,88 μmol/g) quando trattata con 3750 kg/h/m di calce e 0,2 mol/L di acido ossalico (Fig. 2).
L'analisi bivariata ha mostrato che l'attività CAT e l'attività MDA delle radici di Panax notoginseng erano significativamente associate alla quantità di acido ossalico o calce spruzzata e ai due trattamenti (Tabella 3). L'attività SOD nelle radici era significativamente correlata al trattamento con calce e acido ossalico o alla concentrazione di acido ossalico spruzzato. L'attività POD delle radici era significativamente dipendente dalla quantità di calce applicata o dal trattamento con calce e acido ossalico.
Il contenuto di zuccheri solubili nelle radici è diminuito con l'aumentare della quantità di calce applicata e della concentrazione di acido ossalico spruzzato. Non si è osservata alcuna differenza significativa nel contenuto di zuccheri solubili nelle radici di Panax notoginseng senza applicazione di calce e con applicazione di 750 kg/h/m di calce. Con applicazione di 2250 kg/m² di calce, il contenuto di zuccheri solubili trattati con 0,2 mol/L di acido ossalico è risultato significativamente superiore rispetto a quello trattato senza applicazione di acido ossalico, con un aumento del 22,81%. Con applicazione di 3750 kg h/m² di calce, il contenuto di zuccheri solubili è diminuito significativamente all'aumentare della concentrazione di acido ossalico spruzzato. Il contenuto di zuccheri solubili trattati con 0,2 mol L-1 di acido ossalico è diminuito del 38,77% rispetto a quello senza applicazione di acido ossalico. Inoltre, il trattamento spray con acido ossalico da 0,2 mol·L-1 aveva il contenuto di zucchero solubile più basso, pari a 205,80 mg·g-1 (Fig. 3).
Effetto della nebulizzazione fogliare con acido ossalico sul contenuto di zuccheri totali solubili e proteine ​​solubili nelle radici di Panax notoginseng sotto stress da cadmio
Il contenuto di proteine ​​solubili nelle radici è diminuito con l'aumentare della quantità di calce applicata e del trattamento con acido ossalico spray. Senza l'aggiunta di calce, il contenuto di proteine ​​solubili trattato con acido ossalico spray a una concentrazione di 0,2 mol L-1 è stato significativamente ridotto del 16,20% rispetto al controllo. Non si sono osservate differenze significative nel contenuto di proteine ​​solubili delle radici di Panax notoginseng quando sono stati applicati 750 kg/h di calce. Nelle condizioni di applicazione di 2250 kg/h/m di calce, il contenuto di proteine ​​solubili del trattamento con acido ossalico spray a 0,2 mol/L è risultato significativamente superiore a quello del trattamento con acido non ossalico (35,11%). Quando sono stati applicati 3750 kg·h/m² di calce, il contenuto di proteine ​​solubili è diminuito significativamente all'aumentare della concentrazione di acido ossalico spray, con il contenuto di proteine ​​solubili più basso (269,84 μg·g-1) quando lo spray di acido ossalico era pari a 0,2 mol·L-1. trattamento (Fig. 3).
Non sono state rilevate differenze significative nel contenuto di amminoacidi liberi nella radice di Panax notoginseng in assenza di applicazione di calce. Con l'aumento della concentrazione di acido ossalico e l'aggiunta di 750 kg/h/m² di calce, il contenuto di amminoacidi liberi è prima diminuito e poi aumentato. Rispetto al trattamento senza acido ossalico, il contenuto di amminoacidi liberi è aumentato significativamente del 33,58% con l'applicazione di 2250 kg di calce hm-2 e 0,2 mol l-1 di acido ossalico. Il contenuto di amminoacidi liberi è diminuito significativamente con l'aumento della concentrazione di acido ossalico e l'aggiunta di 3750 kg/m² di calce. Il contenuto di amminoacidi liberi del trattamento con acido ossalico 0,2 mol l-1 è stato ridotto del 49,76% rispetto al trattamento con acido non ossalico. Il contenuto di amminoacidi liberi è stato più elevato senza acido ossalico ed è stato di 2,09 mg g-1. Il trattamento spray con acido ossalico 0,2 mol/L ha avuto il contenuto più basso di aminoacidi liberi (1,05 mg/g) (Fig. 4).
Effetto della spruzzatura di acido ossalico sulle foglie sul contenuto di aminoacidi liberi e prolina nelle radici di Panax notoginseng in condizioni di stress da cadmio
Il contenuto di prolina nelle radici è diminuito con l'aumento della quantità di calce applicata e della quantità di acido ossalico spruzzato. Non si sono osservate differenze significative nel contenuto di prolina della radice di Panax ginseng quando non è stata applicata calce. All'aumentare della concentrazione di acido ossalico spruzzato e dell'applicazione di 750 o 2250 kg/m² di calce, il contenuto di prolina è prima diminuito e poi aumentato. Il contenuto di prolina del trattamento spruzzato con acido ossalico a 0,2 mol L-1 è risultato significativamente superiore a quello del trattamento spruzzato con acido ossalico a 0,1 mol L-1, aumentando rispettivamente del 19,52% e del 44,33%. Con l'aggiunta di 3750 kg/m² di calce, il contenuto di prolina è diminuito significativamente all'aumentare della concentrazione di acido ossalico spruzzato. Dopo aver spruzzato acido ossalico a 0,2 mol L-1, il contenuto di prolina è diminuito del 54,68% rispetto a quello senza spruzzatura di acido ossalico. Il contenuto di prolina più basso si è riscontrato quando il prodotto è stato trattato con acido ossalico 0,2 mol/l e ammontava a 11,37 μg/g (Fig. 4).
Il contenuto totale di saponine nel Panax notoginseng è Rg1>Rb1>R1. Non si sono osservate differenze significative nel contenuto delle tre saponine con l'aumentare della concentrazione di acido ossalico spruzzato e con la concentrazione senza applicazione di calce (Tabella 4).
Il contenuto di R1 dopo l'irrorazione di 0,2 mol L-1 di acido ossalico era significativamente inferiore rispetto a quello senza irrorazione di acido ossalico e con l'applicazione di una dose di calce di 750 o 3750 kg/m². Con una concentrazione di acido ossalico irrorato di 0 o 0,1 mol/L, non si è osservata alcuna differenza significativa nel contenuto di R1 con l'aumentare della quantità di calce aggiunta. Con una concentrazione di irrorazione di 0,2 mol/L di acido ossalico, il contenuto di R1 in 3750 kg/h/m² di calce era significativamente inferiore al 43,84% senza aggiunta di calce (Tabella 4).
All'aumentare della concentrazione di acido ossalico e all'aggiunta di 750 kg/m² di calce, il contenuto di Rg1 è inizialmente aumentato e poi diminuito. Con velocità di applicazione della calce pari a 2250 e 3750 kg/h, il contenuto di Rg1 è diminuito con l'aumentare della concentrazione di acido ossalico. Alla stessa concentrazione di acido ossalico spruzzato, all'aumentare della quantità di calce, il contenuto di Rg1 è prima aumentato e poi diminuito. Rispetto al controllo, ad eccezione del contenuto di Rg1 in tre concentrazioni di acido ossalico e 750 kg/m² di calce, che era superiore al controllo, il contenuto di Rg1 nelle radici di Panax notoginseng in altri trattamenti era inferiore al controllo. Il contenuto massimo di Rg1 si è ottenuto con l'irrorazione di 750 kg/h/m² di calce e 0,1 mol/l di acido ossalico, che era superiore dell'11,54% rispetto al controllo (Tabella 4).
All'aumentare della concentrazione di acido ossalico e della quantità di calce applicata a una portata di 2250 kg/h, il contenuto di Rb1 è inizialmente aumentato e poi diminuito. Dopo aver spruzzato 0,1 mol L-1 di acido ossalico, il contenuto di Rb1 ha raggiunto un valore massimo del 3,46%, superiore del 74,75% rispetto al trattamento senza spruzzatura di acido ossalico. Per altri trattamenti con calce, non si sono osservate differenze significative tra le diverse concentrazioni di acido ossalico spruzzato. Dopo aver spruzzato 0,1 e 0,2 mol L-1 di acido ossalico, all'aumentare della quantità di calce, il contenuto di Rb1 è inizialmente diminuito e poi diminuito (Tabella 4).
Alla stessa concentrazione di nebulizzazione con acido ossalico, all'aumentare della quantità di calce aggiunta, il contenuto di flavonoidi è prima aumentato e poi diminuito. Non è stata rilevata alcuna differenza significativa nel contenuto di flavonoidi spruzzando diverse concentrazioni di acido ossalico senza calce e 3750 kg/m² di calce. Aggiungendo 750 e 2250 kg/m² di calce, all'aumentare della concentrazione di acido ossalico spruzzato, il contenuto di flavonoidi è prima aumentato e poi diminuito. Applicando 750 kg/m² e spruzzando acido ossalico a una concentrazione di 0,1 mol/l, il contenuto di flavonoidi è stato massimo: 4,38 mg/g, ovvero il 18,38% in più rispetto all'aggiunta della stessa quantità di calce, e non è stato necessario spruzzare acido ossalico. Il contenuto di flavonoidi dopo il trattamento con spray di acido ossalico 0,1 mol L-1 è aumentato del 21,74% rispetto al trattamento senza acido ossalico e al trattamento con calce alla dose di 2250 kg/m2 (Fig. 5).
Effetto della spruzzatura delle foglie con ossalato sul contenuto di flavonoidi nella radice di Panax notoginseng sotto stress da cadmio
L'analisi bivariata ha mostrato che il contenuto di zuccheri solubili nelle radici di Panax notoginseng dipendeva significativamente dalla quantità di calce applicata e dalla concentrazione di acido ossalico spruzzato. Il contenuto di proteine ​​solubili nelle radici era significativamente correlato al dosaggio di calce e acido ossalico. Il contenuto di amminoacidi liberi e prolina nelle radici era significativamente correlato alla quantità di calce applicata, alla concentrazione di acido ossalico spruzzato, alla calce e all'acido ossalico (Tabella 5).
Il contenuto di R1 nelle radici di Panax notoginseng dipendeva in modo significativo dalla concentrazione di acido ossalico spruzzato, dalla quantità di calce e di acido ossalico applicata. Il contenuto di flavonoidi dipendeva in modo significativo dalla concentrazione di acido ossalico spruzzato e dalla quantità di calce aggiunta.
Molti ammendanti sono stati utilizzati per ridurre i livelli di cadmio nelle piante fissandolo nel terreno, come la calce e l'acido ossalico30. La calce è ampiamente utilizzata come ammendante del terreno per ridurre i livelli di cadmio nelle colture31. Liang et al.32 hanno riportato che l'acido ossalico può essere utilizzato anche per bonificare il terreno contaminato da metalli pesanti. Dopo l'aggiunta di diverse concentrazioni di acido ossalico al terreno contaminato, il contenuto di sostanza organica è aumentato, la capacità di scambio cationico è diminuita e il pH è aumentato33. L'acido ossalico può anche reagire con gli ioni metallici presenti nel terreno. In condizioni di stress da Cd, il contenuto di Cd nel Panax notoginseng è aumentato significativamente rispetto al controllo. Tuttavia, se si utilizza la calce, il contenuto di Cd è significativamente ridotto. In questo studio, applicando 750 kg/h/m di calce, il contenuto di Cd nelle radici ha raggiunto lo standard nazionale (il limite di Cd è Cd≤0,5 mg/kg, AQSIQ, GB/T 19086-200834) e l'effetto è stato buono. L'effetto migliore si ottiene aggiungendo 2250 kg/m² di calce. L'aggiunta di calce crea un gran numero di siti di competizione per Ca2+ e Cd2+ nel terreno, mentre l'aggiunta di acido ossalico riduce il contenuto di Cd nelle radici di Panax notoginseng. Dopo aver miscelato calce e acido ossalico, il contenuto di Cd nella radice di Panax ginseng è diminuito significativamente e ha raggiunto lo standard nazionale. Il Ca2+ nel terreno viene adsorbito sulla superficie radicale attraverso un processo di flusso di massa e può essere assorbito nelle cellule radicali attraverso i canali del calcio (canali del Ca2+), le pompe del calcio (Ca2+-AT-Pasi) e gli antiporti Ca2+/H+, per poi essere trasportato orizzontalmente alle radici. Xylem23. È stata riscontrata una significativa correlazione negativa tra il contenuto di Ca e Cd nelle radici (P < 0,05). Il contenuto di Cd è diminuito con l'aumento del contenuto di Ca, il che è coerente con l'idea di antagonismo tra Ca e Cd. L'ANOVA ha mostrato che la quantità di calce ha avuto un effetto significativo sul contenuto di Ca nella radice di Panax notoginseng. Pongrack et al.35 hanno riportato che il Cd si lega all'ossalato nei cristalli di ossalato di calcio e compete con il Ca. Tuttavia, l'effetto regolatore dell'acido ossalico sul Ca è stato insignificante. Ciò dimostra che la precipitazione dell'ossalato di calcio dall'acido ossalico e dal Ca2+ non è una semplice precipitazione e che il processo di coprecipitazione può essere controllato da diverse vie metaboliche.
In condizioni di stress da cadmio, nelle piante si forma una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS), danneggiando la struttura delle membrane cellulari36. Il contenuto di malondialdeide (MDA) può essere utilizzato come indicatore per valutare il livello di ROS e il grado di danno alla membrana plasmatica delle piante37. Il sistema antiossidante è un importante meccanismo protettivo per la rimozione delle specie reattive dell'ossigeno38. Le attività degli enzimi antiossidanti (tra cui POD, SOD e CAT) sono tipicamente alterate dallo stress da cadmio. I risultati hanno mostrato che il contenuto di MDA era positivamente correlato alla concentrazione di Cd, indicando che l'entità della perossidazione lipidica della membrana vegetale si approfondiva con l'aumentare della concentrazione di Cd37. Ciò è coerente con i risultati dello studio di Ouyang et al.39. Questo studio mostra che il contenuto di MDA è significativamente influenzato da calce, acido ossalico, calce e acido ossalico. Dopo la nebulizzazione di 0,1 mol L-1 di acido ossalico, il contenuto di MDA di Panax notoginseng è diminuito, indicando che l'acido ossalico potrebbe ridurre la biodisponibilità di Cd e i livelli di ROS in Panax notoginseng. Il sistema enzimatico antiossidante è dove avviene la funzione di detossificazione della pianta. La SOD rimuove l'O₂ contenuto nelle cellule vegetali e produce O₂ non tossico e H₂O₂ a bassa tossicità. POD e CAT rimuovono H₂O₂ dai tessuti vegetali e catalizzano la decomposizione di H₂O₂ in H₂O. Sulla base dell'analisi del proteoma iTRAQ, è stato riscontrato che i livelli di espressione proteica di SOD e PAL erano diminuiti e il livello di espressione di POD era aumentato dopo l'applicazione di calce sotto stress da Cd40. Le attività di CAT, SOD e POD nella radice di Panax notoginseng sono state significativamente influenzate dal dosaggio di acido ossalico e calce. Il trattamento a spruzzo con acido ossalico 0,1 mol L-1 ha aumentato significativamente l'attività di SOD e CAT, ma l'effetto regolatore sull'attività POD non era evidente. Ciò dimostra che l'acido ossalico accelera la decomposizione dei ROS sotto stress da Cd e completa principalmente la rimozione di H₂O₂ regolando l'attività di CAT, il che è simile ai risultati della ricerca di Guo et al.41 sugli enzimi antiossidanti di Pseudospermum sibiricum. Kos. ). L'effetto dell'aggiunta di 750 kg/h/m2 di calce sull'attività degli enzimi del sistema antiossidante e sul contenuto di malondialdeide è simile all'effetto della nebulizzazione con acido ossalico. I risultati hanno mostrato che il trattamento a spruzzo con acido ossalico potrebbe migliorare più efficacemente le attività di SOD e CAT in Panax notoginseng e aumentare la resistenza allo stress di Panax notoginseng. Le attività di SOD e POD sono state ridotte dal trattamento con 0,2 mol L-1 di acido ossalico e 3750 kg di calce hm-2, indicando che l'eccessiva irrorazione di alte concentrazioni di acido ossalico e Ca2+ può causare stress alle piante, il che è coerente con lo studio di Luo e altri al. Wait 42.