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La contaminazione da cadmio (Cd) rappresenta una potenziale minaccia per la sicurezza della coltivazione della pianta medicinale Panax notoginseng nello Yunnan. In condizioni di stress esogeno da Cd, sono stati condotti esperimenti sul campo per comprendere gli effetti dell'applicazione di calce (0, 750, 2250 e 3750 kg/h/m2) e della nebulizzazione fogliare con acido ossalico (0, 0,1 e 0,2 mol/L) sull'accumulo di Cd e sui componenti antiossidanti, sistemici e medicinali del Panax notoginseng. I risultati hanno mostrato che, in condizioni di stress da Cd, la calce e la nebulizzazione fogliare con acido ossalico possono aumentare il contenuto di Ca2+ nel Panax notoginseng e ridurre la tossicità del Cd2+. L'aggiunta di calce e acido ossalico ha aumentato l'attività degli enzimi antiossidanti e modificato il metabolismo dei regolatori osmotici. L'aumento più significativo è stato quello dell'attività della CAT di 2,77 volte. Sotto l'influenza dell'acido ossalico, l'attività della SOD è aumentata di 1,78 volte. Il contenuto di MDA è diminuito del 58,38%. Esiste una correlazione molto significativa con zuccheri solubili, aminoacidi liberi, prolina e proteine ​​solubili. La calce e l'acido ossalico possono aumentare il contenuto di ioni calcio (Ca2+) di Panax notoginseng, ridurre il contenuto di Cd, migliorare la resistenza allo stress di Panax notoginseng e aumentare la produzione di saponine totali e flavonoidi. Il contenuto di Cd è il più basso, inferiore del 68,57% rispetto al controllo, e corrisponde al valore standard (Cd≤0,5 mg kg-1, GB/T 19086-2008). La proporzione di SPN era del 7,73%, raggiungendo il livello più alto tra tutti i trattamenti, e il contenuto di flavonoidi è aumentato significativamente del 21,74%, raggiungendo i valori medici standard e la resa ottimale.
Il cadmio (Cd) è un contaminante comune dei terreni coltivati, migra facilmente e presenta una significativa tossicità biologica. El-Shafei et al.² hanno riportato che la tossicità del cadmio influisce sulla qualità e sulla produttività delle piante utilizzate. Negli ultimi anni, i livelli eccessivi di cadmio nei terreni coltivati ​​nella Cina sud-occidentale sono diventati un problema serio. La provincia dello Yunnan è il regno della biodiversità in Cina, con le specie di piante medicinali che si classificano al primo posto nel paese. Tuttavia, la provincia dello Yunnan è ricca di risorse minerarie e il processo di estrazione mineraria porta inevitabilmente all'inquinamento del suolo da metalli pesanti, che influisce sulla produzione di piante medicinali locali.
Il Panax notoginseng (Burkill) Chen3) è una pianta medicinale erbacea perenne di grande valore, appartenente al genere Panax della famiglia delle Araliaceae. Il Panax notoginseng migliora la circolazione sanguigna, elimina la stasi ematica e allevia il dolore. La principale area di produzione è la prefettura di Wenshan, nella provincia dello Yunnan5. Oltre il 75% del suolo nelle aree locali di coltivazione del Panax notoginseng è contaminato da cadmio, con livelli che variano dall'81% a oltre il 100% in diverse zone6. L'effetto tossico del cadmio riduce significativamente anche la produzione di componenti medicinali del Panax notoginseng, in particolare saponine e flavonoidi. Le saponine sono un tipo di composto glicosidico i cui agliconi sono triterpenoidi o spirostani. Sono i principali principi attivi di molte medicine tradizionali cinesi e contengono saponine. Alcune saponine possiedono anche attività antibatterica o preziose attività biologiche come effetti antipiretici, sedativi e antitumorali7. I flavonoidi si riferiscono generalmente a una serie di composti in cui due anelli benzenici con gruppi idrossilici fenolici sono collegati attraverso tre atomi di carbonio centrali. Il nucleo principale è il 2-fenilcromanone8. È un potente antiossidante in grado di neutralizzare efficacemente i radicali liberi dell'ossigeno nelle piante. Può anche inibire la penetrazione degli enzimi biologici infiammatori, promuovere la guarigione delle ferite e alleviare il dolore, e abbassare i livelli di colesterolo. È uno dei principali ingredienti attivi del Panax notoginseng. È urgente affrontare il problema della contaminazione da cadmio nei suoli delle aree di produzione del Panax ginseng e garantire la produzione dei suoi ingredienti medicinali essenziali.
La calce è uno dei passivanti più utilizzati per la purificazione stazionaria del suolo dalla contaminazione da cadmio10. Essa influenza l'adsorbimento e la deposizione di Cd nel suolo riducendo la biodisponibilità di Cd, aumentando il valore del pH e modificando la capacità di scambio cationico (CSC), la saturazione salina (BS) e il potenziale redox (Eh)3, 11 del suolo. Inoltre, la calce fornisce una grande quantità di Ca2+, forma un antagonismo ionico con Cd2+, compete per i siti di adsorbimento nelle radici, impedisce il trasporto di Cd nel suolo e ha una bassa tossicità biologica. Quando sono stati aggiunti 50 mmol L-1 di Ca in condizioni di stress da Cd, il trasporto di Cd nelle foglie di sesamo è stato inibito e l'accumulo di Cd è stato ridotto dell'80%. Numerosi studi simili sono stati riportati nel riso (Oryza sativa L.) e in altre colture12,13.
La nebulizzazione fogliare delle colture per il controllo dell'accumulo di metalli pesanti è un nuovo metodo introdotto negli ultimi anni. Il suo principio si basa principalmente sulla reazione di chelazione nelle cellule vegetali, che determina la deposizione dei metalli pesanti sulla parete cellulare e inibisce l'assorbimento degli stessi da parte delle piante14,15. L'acido ossalico, un agente chelante diacido stabile, può chelare direttamente gli ioni di metalli pesanti nelle piante, riducendone la tossicità. La ricerca ha dimostrato che l'acido ossalico nella soia può chelare il Cd2+ e rilasciare cristalli contenenti Cd attraverso le cellule dei tricomi superiori, riducendo i livelli di Cd2+ nell'organismo16. L'acido ossalico può regolare il pH del suolo, potenziare l'attività della superossido dismutasi (SOD), della perossidasi (POD) e della catalasi (CAT) e regolare la penetrazione di zuccheri solubili, proteine ​​solubili, aminoacidi liberi e prolina, regolatori metabolici17,18. L'acido e l'eccesso di Ca2+ nella pianta formano un precipitato di ossalato di calcio sotto l'azione di proteine ​​nucleanti. Regolare la concentrazione di Ca2+ nelle piante può consentire di regolare efficacemente l'acido ossalico disciolto e il Ca2+ nelle piante ed evitare l'eccessivo accumulo di acido ossalico e Ca2+19,20.
La quantità di calce applicata è uno dei fattori chiave che influenzano l'effetto riparatore. È stato riscontrato che il dosaggio di calce variava da 750 a 6000 kg/m2. Per terreni acidi con un pH di 5,0~5,5, l'effetto dell'applicazione di calce a una dose di 3000~6000 kg/h/m è significativamente maggiore rispetto a una dose di 750 kg/h/m221. Tuttavia, un'applicazione eccessiva di calce comporterà alcuni effetti negativi sul terreno, come cambiamenti significativi nel pH del terreno e compattazione del terreno22. Pertanto, abbiamo definito i livelli di trattamento con CaO come 0, 750, 2250 e 3750 kg hm-2. Quando l'acido ossalico è stato applicato ad Arabidopsis thaliana, è stato riscontrato che il Ca2+ è stato significativamente ridotto a una concentrazione di 10 mmol L-1 e la famiglia di geni CRT, che influenza la segnalazione del Ca2+, ha risposto fortemente20. L'accumulo di alcuni studi precedenti ci ha permesso di determinare la concentrazione di questo test e di studiare ulteriormente l'effetto dell'interazione di integratori esogeni su Ca2+ e Cd2+23,24,25. Pertanto, questo studio mira a esplorare il meccanismo di regolazione della calce esogena e dello spray fogliare di acido ossalico sul contenuto di Cd e sulla tolleranza allo stress del Panax notoginseng in un terreno contaminato da Cd e ad esplorare ulteriormente i modi per garantire meglio la qualità medicinale e l'efficacia della produzione di Panax notoginseng. Fornisce una preziosa guida per aumentare la scala della coltivazione di piante erbacee in terreni contaminati da cadmio e per raggiungere la produzione sostenibile di alta qualità richiesta dal mercato farmaceutico.
Utilizzando la varietà locale di ginseng Wenshan Panax notoginseng come materiale, è stato condotto un esperimento in campo a Lannizhai, nella contea di Qiubei, prefettura di Wenshan, provincia dello Yunnan (24°11′N, 104°3′E, altitudine 1446 m). La temperatura media annua è di 17°C e le precipitazioni medie annue sono di 1250 mm. I valori di fondo del suolo studiato erano: TN 0,57 g kg-1, TP 1,64 g kg-1, TC 16,31 g kg-1, OM 31,86 g kg-1, N idrolizzato alcalino 88,82 mg kg-1, fosforo libero 18,55 mg kg-1, potassio libero 100,37 mg kg-1, cadmio totale 0,3 mg kg-1, pH 5,4.
Il 10 dicembre 2017, 6 mg/kg di Cd2+ (CdCl2·2.5H2O) e un trattamento con calce (0, 750, 2250 e 3750 kg/h/m2) sono stati miscelati e applicati sulla superficie del terreno in uno strato di 0-10 cm in ciascuna parcella. Ogni trattamento è stato ripetuto 3 volte. Le parcelle sperimentali sono state posizionate in modo casuale, ciascuna con una superficie di 3 m2. Le piantine di Panax notoginseng di un anno sono state trapiantate dopo 15 giorni dalla lavorazione del terreno. Utilizzando una rete ombreggiante, l'intensità luminosa del Panax notoginseng all'interno della rete è pari a circa il 18% della normale intensità luminosa naturale. La coltivazione è stata effettuata secondo i metodi tradizionali locali. Prima della fase di maturazione del Panax notoginseng nel 2019, è stato spruzzato acido ossalico sotto forma di ossalato di sodio. Le concentrazioni di acido ossalico erano rispettivamente di 0, 0,1 e 0,2 mol L-1, e l'NaOH è stato utilizzato per regolare il pH a 5,16 per simulare il pH medio della soluzione di lisciviazione della lettiera. Spruzzare la superficie superiore e inferiore delle foglie una volta alla settimana alle 8:00 del mattino. Dopo 4 spruzzature nella quinta settimana, le piante di Panax notoginseng di 3 anni sono state raccolte.
Nel novembre 2019, sono state raccolte sul campo piante di Panax notoginseng di tre anni, trattate con acido ossalico. Alcuni campioni di piante di Panax notoginseng di tre anni, destinati ad essere analizzati per il metabolismo fisiologico e l'attività enzimatica, sono stati congelati rapidamente in azoto liquido e successivamente trasferiti in un frigorifero a -80 °C. Alcuni campioni di radici, destinati ad essere analizzati per il contenuto di Cd e di principi attivi allo stadio di maturazione, sono stati lavati con acqua di rubinetto, essiccati a 105 °C per 30 minuti, mantenuti a peso costante a 75 °C e macinati in un mortaio per la conservazione.
Pesare 0,2 g di campione vegetale essiccato, collocarlo in una beuta, aggiungere 8 ml di HNO3 e 2 ml di HClO4 e coprire per una notte. Il giorno successivo, utilizzare un imbuto curvo posto in una beuta per la digestione elettrotermica fino alla comparsa di fumo bianco e al rilascio di succhi digestivi limpidi. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, la miscela è stata trasferita in un matraccio volumetrico da 10 ml. Il contenuto di Cd è stato determinato mediante spettrometria di assorbimento atomico (Thermo ICE™ 3300 AAS, USA). (GB/T 23739-2009).
Pesare 0,2 g di campione vegetale essiccato, metterlo in una bottiglia di plastica da 50 ml, aggiungere 1 mol L-1 di HCl in 10 ml, chiudere con il tappo e agitare bene per 15 ore, quindi filtrare. Utilizzando una pipetta, prelevare la quantità necessaria di filtrato, diluirla di conseguenza e aggiungere la soluzione di SrCl2 per portare la concentrazione di Sr2+ a 1 g L-1. Il contenuto di Ca è stato misurato utilizzando uno spettrometro ad assorbimento atomico (Thermo ICE™ 3300 AAS, USA).
Metodo del kit di riferimento per malondialdeide (MDA), superossido dismutasi (SOD), perossidasi (POD) e catalasi (CAT) (DNM-9602, Beijing Prong New Technology Co., Ltd., registrazione del prodotto), utilizzare il kit di misurazione corrispondente. N.: Farmacopea di Pechino (accurata) 2013 n. 2400147).
Pesare circa 0,05 g di campione di Panax notoginseng e aggiungere il reagente antrone-acido solforico lungo le pareti della provetta. Agitare la provetta per 2-3 secondi per miscelare accuratamente il liquido. Posizionare la provetta su un supporto per provette per 15 minuti per lo sviluppo del colore. Il contenuto di zuccheri solubili è stato determinato mediante spettrofotometria ultravioletta-visibile (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Cina) a una lunghezza d'onda di 620 nm.
Pesare 0,5 g di un campione fresco di Panax notoginseng, macinarlo fino a ottenere un omogeneizzato con 5 ml di acqua distillata e quindi centrifugare a 10.000 g per 10 minuti. Il surnatante è stato diluito fino a un volume fisso. È stato utilizzato il metodo del Coomassie Brilliant Blue. Il contenuto di proteine ​​solubili è stato misurato mediante spettrofotometria ultravioletta-visibile (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Cina) a una lunghezza d'onda di 595 nm e calcolato in base alla curva standard dell'albumina sierica bovina.
Pesare 0,5 g di campione fresco, aggiungere 5 ml di acido acetico al 10%, macinare fino a ottenere un omogeneizzato, filtrare e diluire fino a volume costante. Il metodo di sviluppo del colore è stato utilizzato con una soluzione di ninidrina. Il contenuto di aminoacidi liberi è stato determinato mediante spettrofotometria UV-visibile (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Cina) a 570 nm e calcolato in base alla curva standard della leucina28.
Pesare 0,5 g di un campione fresco, aggiungere 5 ml di una soluzione al 3% di acido solfosalicilico, riscaldare a bagnomaria e agitare per 10 minuti. Dopo il raffreddamento, la soluzione è stata filtrata e portata a volume costante. È stato utilizzato il metodo colorimetrico con ninidrina acida. Il contenuto di prolina è stato determinato mediante spettrofotometria ultravioletta-visibile (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Cina) a una lunghezza d'onda di 520 nm e calcolato in base alla curva standard della prolina29.
Il contenuto di saponine è stato determinato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) facendo riferimento alla Farmacopea della Repubblica Popolare Cinese (edizione 2015). Il principio di base della cromatografia liquida ad alta prestazione consiste nell'utilizzare un liquido ad alta pressione come fase mobile e nell'applicare la tecnologia di separazione di particelle ultrafini della cromatografia su colonna ad alta prestazione (HPLC) alla fase stazionaria. La tecnica operativa è la seguente:
Condizioni HPLC e test di idoneità del sistema (Tabella 1): Utilizzare gel di silice legato con ottadecilsilano come riempitivo, acetonitrile come fase mobile A e acqua come fase mobile B. Eseguire l'eluizione a gradiente come mostrato nella tabella sottostante. La lunghezza d'onda di rilevamento è 203 nm. In base al picco R1 delle saponine totali di Panax notoginseng, il numero di piatti teorici dovrebbe essere almeno 4000.
Preparazione della soluzione standard: pesare accuratamente il ginsenoside Rg1, il ginsenoside Rb1 e il notoginsenoside R1 e aggiungere metanolo per preparare una miscela contenente 0,4 mg di ginsenoside Rg1, 0,4 mg di ginsenoside Rb1 e 0,1 mg di notoginsenoside R1 per 1 ml di soluzione.
Preparazione della soluzione di prova: pesare 0,6 g di polvere di Panax ginseng e aggiungere 50 ml di metanolo. La soluzione risultante è stata pesata (W1) e lasciata riposare per una notte. Successivamente, la soluzione è stata delicatamente fatta bollire a bagnomaria a 80 °C per 2 ore. Dopo il raffreddamento, pesare nuovamente la soluzione e aggiungere il metanolo preparato alla prima massa W1. Agitare bene e filtrare. Il filtrato è stato conservato per l'analisi.
Prelevare con precisione 10 μL della soluzione standard e 10 μL del filtrato e iniettarli in un cromatografo liquido ad alte prestazioni (Thermo HPLC-ultimate 3000, Seymour Fisher Technology Co., Ltd.) per determinare il contenuto di saponina 24.
Curva standard: misurazione di una soluzione standard mista di Rg1, Rb1 e R1. Le condizioni cromatografiche sono le stesse di cui sopra. Calcolare la curva standard riportando l'area del picco misurata sull'asse y e la concentrazione di saponina nella soluzione standard sull'asse x. La concentrazione di saponina può essere calcolata sostituendo l'area del picco misurata del campione nella curva standard.
Pesare 0,1 g di campione di P. notogensings e aggiungere 50 ml di soluzione di CH3OH al 70%. L'estrazione a ultrasuoni è stata effettuata per 2 ore, seguita da centrifugazione a 4000 rpm per 10 minuti. Prelevare 1 ml di surnatante e diluirlo 12 volte. Il contenuto di flavonoidi è stato determinato mediante spettrofotometria ultravioletta-visibile (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Cina) a una lunghezza d'onda di 249 nm. La quercetina è una delle sostanze comuni standard8.
I dati sono stati organizzati utilizzando il software Excel 2010. Il software statistico SPSS 20 è stato utilizzato per condurre l'analisi della varianza sui dati. Le immagini sono state create utilizzando Origin Pro 9.1. I valori statistici calcolati includono la media ± deviazione standard. Le dichiarazioni di significatività statistica si basano su P < 0,05.
Alla stessa concentrazione di acido ossalico spruzzato sulle foglie, il contenuto di Ca nelle radici di Panax notoginseng è aumentato significativamente all'aumentare della quantità di calce applicata (Tabella 2). Rispetto all'assenza di calce, il contenuto di Ca è aumentato del 212% con l'aggiunta di 3750 kg/h/m2 di calce senza spruzzare acido ossalico. Per la stessa quantità di calce applicata, il contenuto di Ca è aumentato leggermente all'aumentare della concentrazione di acido ossalico spruzzato.
Il contenuto di Cd nelle radici varia da 0,22 a 0,70 mg kg-1. Alla stessa concentrazione di acido ossalico nebulizzato, all'aumentare della quantità di calce aggiunta, il contenuto di Cd di 2250 kg/h diminuisce significativamente. Rispetto al controllo, il contenuto di Cd nelle radici è diminuito del 68,57% dopo la nebulizzazione con 2250 kg hm-2 di calce e 0,1 mol l-1 di acido ossalico. Quando sono stati applicati 750 kg/h di calce e senza calce, il contenuto di Cd nelle radici di Panax notoginseng è diminuito significativamente con l'aumentare della concentrazione di acido ossalico nebulizzato. Quando sono stati applicati 2250 kg/m2 di calce e 3750 kg/m2 di calce, il contenuto di Cd nelle radici è prima diminuito e poi aumentato con l'aumentare della concentrazione di acido ossalico. Inoltre, l'analisi bivariata ha mostrato che la calce ha avuto un effetto significativo sul contenuto di Ca nelle radici di Panax notoginseng (F = 82,84**), la calce ha avuto un effetto significativo sul contenuto di Cd nelle radici di Panax notoginseng (F = 74,99**) e l'acido ossalico (F=7,72*).
Con l'aumentare della quantità di calce aggiunta e della concentrazione di acido ossalico spruzzato, il contenuto di MDA è diminuito significativamente. Non si è riscontrata alcuna differenza significativa nel contenuto di MDA nelle radici di Panax notoginseng senza aggiunta di calce e con l'aggiunta di 3750 kg/m2 di calce. A tassi di applicazione di 750 kg/h/m2 e 2250 kg/h/m2, il contenuto di calce del trattamento con irrorazione di acido ossalico 0,2 mol/L è diminuito rispettivamente del 58,38% e del 40,21% rispetto al trattamento senza irrorazione di acido ossalico. Il contenuto di MDA più basso (7,57 nmol g-1) è stato osservato quando sono stati spruzzati 750 kg hm-2 di calce e 0,2 mol l-1 di acido ossalico (Fig. 1).
Effetto della nebulizzazione fogliare con acido ossalico sul contenuto di malondialdeide nelle radici di Panax notoginseng in condizioni di stress da cadmio. Nota: la legenda nella figura indica la concentrazione di acido ossalico nello spray (mol L-1), lettere minuscole diverse indicano differenze significative tra i trattamenti della stessa applicazione di calce. numero (P < 0,05). Lo stesso vale di seguito.
Ad eccezione dell'applicazione di 3750 kg/h di calce, non si sono riscontrate differenze significative nell'attività SOD nelle radici di Panax notoginseng. Con l'aggiunta di 0, 750 e 2250 kg/h/m2 di calce, l'attività SOD, in seguito al trattamento con irrorazione di acido ossalico a una concentrazione di 0,2 mol/l, è risultata significativamente più elevata rispetto al trattamento senza acido ossalico, con un aumento rispettivamente del 177,89%, 61,62% e 45,08%. L'attività SOD nelle radici (598,18 U g-1) è risultata massima in assenza di applicazione di calce e in seguito al trattamento con irrorazione di acido ossalico a una concentrazione di 0,2 mol/l. Quando l'acido ossalico è stato irrorato alla stessa concentrazione o a 0,1 mol L-1, l'attività SOD è aumentata con l'aumentare della quantità di calce aggiunta. Dopo l'irrorazione con acido ossalico a 0,2 mol/L, l'attività SOD è diminuita significativamente (Fig. 2).
Effetto della nebulizzazione delle foglie con acido ossalico sull'attività della superossido dismutasi, della perossidasi e della catalasi nelle radici di Panax notoginseng in condizioni di stress da cadmio.
Analogamente all'attività SOD nelle radici, l'attività POD nelle radici trattate senza calce e irrorate con acido ossalico 0,2 mol L-1 è risultata la più elevata (63,33 µmol g-1), ovvero il 148,35% superiore al controllo (25,50 µmol g-1). Con l'aumentare della concentrazione di acido ossalico irrorato e del trattamento con calce a 3750 kg/m2, l'attività POD è prima aumentata e poi diminuita. Rispetto al trattamento con acido ossalico 0,1 mol L-1, l'attività POD nel caso del trattamento con acido ossalico 0,2 mol L-1 è diminuita del 36,31% (Fig. 2).
Ad eccezione della nebulizzazione di acido ossalico 0,2 mol/l e dell'aggiunta di 2250 kg/h/m2 o 3750 kg/h/m2 di calce, l'attività CAT è risultata significativamente più elevata rispetto al controllo. Quando si è nebulizzato acido ossalico 0,1 mol/l e si sono aggiunti 0,2250 kg/m2 o 3750 kg/h/m2 di calce, l'attività CAT è aumentata rispettivamente del 276,08%, 276,69% ​​e 33,05% rispetto al trattamento senza nebulizzazione di acido ossalico. L'attività CAT nelle radici è risultata massima (803,52 μmol/g) nel trattamento senza calce e nel trattamento con acido ossalico 0,2 mol/L. L'attività CAT è risultata minima (172,88 μmol/g) nel trattamento con 3750 kg/h/m di calce e acido ossalico 0,2 mol/L (Fig. 2).
L'analisi bivariata ha mostrato che l'attività CAT e l'attività MDA delle radici di Panax notoginseng erano significativamente associate alla quantità di acido ossalico o calce spruzzata e ai due trattamenti (Tabella 3). L'attività SOD nelle radici era significativamente correlata al trattamento con calce e acido ossalico o alla concentrazione di acido ossalico spruzzato. L'attività POD nelle radici dipendeva significativamente dalla quantità di calce applicata o dal trattamento con calce e acido ossalico.
Il contenuto di zuccheri solubili nelle radici è diminuito con l'aumentare della quantità di calce applicata e della concentrazione di acido ossalico nebulizzato. Non si sono riscontrate differenze significative nel contenuto di zuccheri solubili nelle radici di Panax notoginseng senza applicazione di calce e con l'applicazione di 750 kg/h/m di calce. Con l'applicazione di 2250 kg/m2 di calce, il contenuto di zuccheri solubili, trattato con acido ossalico 0,2 mol/L, è risultato significativamente più elevato rispetto al trattamento senza nebulizzazione di acido ossalico, con un incremento del 22,81%. Con l'applicazione di 3750 kg h/m2 di calce, il contenuto di zuccheri solubili è diminuito significativamente all'aumentare della concentrazione di acido ossalico nebulizzato. Il contenuto di zuccheri solubili, trattato con acido ossalico 0,2 mol L-1, è diminuito del 38,77% rispetto al trattamento senza nebulizzazione di acido ossalico. Inoltre, il trattamento con spray di acido ossalico a 0,2 mol·L-1 ha mostrato il contenuto di zuccheri solubili più basso, pari a 205,80 mg·g-1 (Fig. 3).
Effetto della nebulizzazione fogliare con acido ossalico sul contenuto di zuccheri totali solubili e proteine ​​solubili nelle radici di Panax notoginseng in condizioni di stress da cadmio.
Il contenuto di proteine ​​solubili nelle radici è diminuito con l'aumentare delle quantità di calce applicata e del trattamento con irrorazione di acido ossalico. Senza l'aggiunta di calce, il contenuto di proteine ​​solubili trattato con irrorazione di acido ossalico a una concentrazione di 0,2 mol L-1 è risultato significativamente ridotto del 16,20% rispetto al controllo. Non sono state riscontrate differenze significative nel contenuto di proteine ​​solubili nelle radici di Panax notoginseng quando sono stati applicati 750 kg/h di calce. Nelle condizioni di applicazione di 2250 kg/h/m di calce, il contenuto di proteine ​​solubili del trattamento con irrorazione di acido ossalico a 0,2 mol/L è risultato significativamente superiore a quello del trattamento senza irrorazione di acido ossalico (35,11%). Quando sono stati applicati 3750 kg·h/m2 di calce, il contenuto di proteine ​​solubili è diminuito significativamente all'aumentare della concentrazione di irrorazione di acido ossalico, con il contenuto di proteine ​​solubili più basso (269,84 μg·g-1) quando l'acido ossalico era a 0,2 mol·L-1. trattamento (Fig. 3).
Non sono state riscontrate differenze significative nel contenuto di aminoacidi liberi nella radice di Panax notoginseng in assenza di applicazione di calce. Con l'aumento della concentrazione di acido ossalico nebulizzato e l'aggiunta di 750 kg/h/m2 di calce, il contenuto di aminoacidi liberi è inizialmente diminuito per poi aumentare. Rispetto al trattamento senza nebulizzazione di acido ossalico, il contenuto di aminoacidi liberi è aumentato significativamente del 33,58% con la nebulizzazione di 2250 kg hm-2 di calce e 0,2 mol l-1 di acido ossalico. Il contenuto di aminoacidi liberi è diminuito significativamente con l'aumento della concentrazione di acido ossalico nebulizzato e l'aggiunta di 3750 kg/m2 di calce. Il contenuto di aminoacidi liberi del trattamento con nebulizzazione di acido ossalico a 0,2 mol L-1 è risultato ridotto del 49,76% rispetto al trattamento senza nebulizzazione di acido ossalico. Il contenuto di aminoacidi liberi più elevato è stato riscontrato senza nebulizzazione di acido ossalico, pari a 2,09 mg g-1. Il trattamento con spray di acido ossalico 0,2 mol/L ha mostrato il contenuto più basso di aminoacidi liberi (1,05 mg/g) (Fig. 4).
Effetto della nebulizzazione delle foglie con acido ossalico sul contenuto di aminoacidi liberi e prolina nelle radici di Panax notoginseng in condizioni di stress da cadmio.
Il contenuto di prolina nelle radici è diminuito con l'aumento della quantità di calce applicata e della quantità di acido ossalico spruzzato. Non sono state riscontrate differenze significative nel contenuto di prolina nelle radici di Panax ginseng in assenza di applicazione di calce. Con l'aumento della concentrazione di acido ossalico spruzzato e dell'applicazione di 750 o 2250 kg/m2 di calce, il contenuto di prolina è prima diminuito e poi aumentato. Il contenuto di prolina del trattamento con acido ossalico a 0,2 mol L-1 è risultato significativamente superiore a quello del trattamento con acido ossalico a 0,1 mol L-1, con un aumento rispettivamente del 19,52% e del 44,33%. Con l'aggiunta di 3750 kg/m2 di calce, il contenuto di prolina è diminuito significativamente con l'aumento della concentrazione di acido ossalico spruzzato. Dopo aver spruzzato acido ossalico a 0,2 mol L-1, il contenuto di prolina è diminuito del 54,68% rispetto al trattamento senza spruzzatura di acido ossalico. Il contenuto di prolina più basso è stato riscontrato con il trattamento con acido ossalico 0,2 mol/l, pari a 11,37 μg/g (Fig. 4).
Il contenuto totale di saponine nel Panax notoginseng è Rg1>Rb1>R1. Non si è riscontrata alcuna differenza significativa nel contenuto delle tre saponine con l'aumento della concentrazione di acido ossalico nebulizzato e la concentrazione senza applicazione di calce (Tabella 4).
Il contenuto di R1 dopo la nebulizzazione di acido ossalico 0,2 mol L-1 era significativamente inferiore rispetto al caso senza nebulizzazione di acido ossalico e con l'applicazione di una dose di calce di 750 o 3750 kg/m2. A una concentrazione di acido ossalico nebulizzato di 0 o 0,1 mol/L, non si è riscontrata alcuna differenza significativa nel contenuto di R1 con l'aumento della quantità di calce aggiunta. A una concentrazione di nebulizzazione di acido ossalico di 0,2 mol/L, il contenuto di R1 in 3750 kg/h/m2 di calce era significativamente inferiore al 43,84% senza aggiunta di calce (Tabella 4).
All'aumentare della concentrazione di acido ossalico nebulizzato e con l'aggiunta di 750 kg/m2 di calce, il contenuto di Rg1 è prima aumentato e poi diminuito. A velocità di applicazione della calce di 2250 e 3750 kg/h, il contenuto di Rg1 è diminuito con l'aumentare della concentrazione di acido ossalico nebulizzato. Alla stessa concentrazione di acido ossalico nebulizzato, all'aumentare della quantità di calce, il contenuto di Rg1 prima aumenta e poi diminuisce. Rispetto al controllo, ad eccezione del contenuto di Rg1 nei tre trattamenti con concentrazioni di acido ossalico e 750 kg/m2 di calce, che era superiore al controllo, il contenuto di Rg1 nelle radici di Panax notoginseng negli altri trattamenti era inferiore al controllo. Il contenuto massimo di Rg1 è stato ottenuto con la nebulizzazione di 750 kg/h/m2 di calce e 0,1 mol/l di acido ossalico, che era superiore dell'11,54% rispetto al controllo (Tabella 4).
All'aumentare della concentrazione di acido ossalico nebulizzato e della quantità di calce applicata, con una portata di 2250 kg/h, il contenuto di Rb1 è prima aumentato e poi diminuito. Dopo la nebulizzazione di acido ossalico a 0,1 mol L-1, il contenuto di Rb1 ha raggiunto un valore massimo del 3,46%, che era superiore del 74,75% rispetto al caso senza nebulizzazione di acido ossalico. Per gli altri trattamenti con calce, non sono state riscontrate differenze significative tra le diverse concentrazioni di acido ossalico nebulizzato. Dopo la nebulizzazione con acido ossalico a 0,1 e 0,2 mol L-1, all'aumentare della quantità di calce, il contenuto di Rb1 è prima diminuito e poi diminuito (Tabella 4).
A parità di concentrazione di acido ossalico nebulizzato, all'aumentare della quantità di calce aggiunta, il contenuto di flavonoidi è prima aumentato e poi diminuito. Non è stata rilevata alcuna differenza significativa nel contenuto di flavonoidi nebulizzando diverse concentrazioni di acido ossalico senza calce e con 3750 kg/m2 di calce. Aggiungendo 750 e 2250 kg/m2 di calce, all'aumentare della concentrazione di acido ossalico nebulizzato, il contenuto di flavonoidi è prima aumentato e poi diminuito. Applicando 750 kg/m2 e nebulizzando acido ossalico a una concentrazione di 0,1 mol/l, il contenuto di flavonoidi ha raggiunto il valore massimo di 4,38 mg/g, ovvero il 18,38% in più rispetto all'aggiunta della stessa quantità di calce, e in questo caso non è stato necessario nebulizzare acido ossalico. Il contenuto di flavonoidi, quando trattato con uno spray di acido ossalico 0,1 mol L-1, è aumentato del 21,74% rispetto al trattamento senza acido ossalico e al trattamento con calce a una dose di 2250 kg/m2 (Fig. 5).
Effetto della nebulizzazione delle foglie con ossalato sul contenuto di flavonoidi nella radice di Panax notoginseng in condizioni di stress da cadmio
L'analisi bivariata ha mostrato che il contenuto di zuccheri solubili nelle radici di Panax notoginseng dipendeva significativamente dalla quantità di calce applicata e dalla concentrazione di acido ossalico spruzzato. Il contenuto di proteine ​​solubili nelle radici era significativamente correlato al dosaggio di calce e acido ossalico. Il contenuto di aminoacidi liberi e prolina nelle radici era significativamente correlato alla quantità di calce applicata, alla concentrazione di acido ossalico spruzzato, alla calce e all'acido ossalico (Tabella 5).
Il contenuto di R1 nelle radici di Panax notoginseng dipendeva significativamente dalla concentrazione di acido ossalico spruzzato, dalla quantità di calce e dalla combinazione di calce e acido ossalico applicati. Il contenuto di flavonoidi dipendeva significativamente dalla concentrazione di acido ossalico spruzzato e dalla quantità di calce aggiunta.
Sono stati utilizzati molti ammendanti per ridurre i livelli di cadmio nelle piante fissando il cadmio nel terreno, come la calce e l'acido ossalico30. La calce è ampiamente utilizzata come ammendante del terreno per ridurre i livelli di cadmio nelle colture31. Liang et al. 32 hanno riportato che l'acido ossalico può essere utilizzato anche per bonificare terreni contaminati da metalli pesanti. Dopo l'aggiunta di diverse concentrazioni di acido ossalico al terreno contaminato, il contenuto di sostanza organica del suolo è aumentato, la capacità di scambio cationico è diminuita e il pH è aumentato33. L'acido ossalico può anche reagire con gli ioni metallici nel terreno. In condizioni di stress da Cd, il contenuto di Cd nel Panax notoginseng è aumentato significativamente rispetto al controllo. Tuttavia, se si utilizza la calce, si riduce significativamente. Quando in questo studio sono stati applicati 750 kg/h/m di calce, il contenuto di Cd nelle radici ha raggiunto lo standard nazionale (limite di Cd ≤ 0,5 mg/kg, AQSIQ, GB/T 19086-200834) e l'effetto è stato buono. L'effetto migliore si ottiene aggiungendo 2250 kg/m2 di calce. L'aggiunta di calce crea un gran numero di siti di competizione per Ca2+ e Cd2+ nel terreno e l'aggiunta di acido ossalico riduce il contenuto di Cd nelle radici di Panax notoginseng. Dopo la miscelazione di calce e acido ossalico, il contenuto di Cd nelle radici di Panax ginseng è diminuito significativamente e ha raggiunto lo standard nazionale. Il Ca2+ nel terreno viene adsorbito sulla superficie delle radici attraverso un processo di flusso di massa e può essere assorbito nelle cellule delle radici attraverso i canali del calcio (canali Ca2+), le pompe del calcio (Ca2+-AT-Pasi) e gli antiportatori Ca2+/H+, e quindi trasportato orizzontalmente alle radici. Xylem23. C'era una correlazione negativa significativa tra il contenuto di Ca e Cd nelle radici (P < 0,05). Il contenuto di Cd diminuiva con l'aumentare del contenuto di Ca, il che è coerente con l'idea di antagonismo tra Ca e Cd. L'ANOVA ha mostrato che la quantità di calce aveva un effetto significativo sul contenuto di Ca nella radice di Panax notoginseng. Pongrack et al. 35 hanno riportato che il Cd si lega all'ossalato nei cristalli di ossalato di calcio e compete con il Ca. Tuttavia, l'effetto regolatore dell'acido ossalico sul Ca era insignificante. Ciò mostra che la precipitazione dell'ossalato di calcio dall'acido ossalico e Ca2+ non è una semplice precipitazione e il processo di coprecipitazione può essere controllato da diverse vie metaboliche.
In condizioni di stress da cadmio, nelle piante si forma una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS), danneggiando la struttura delle membrane cellulari36. Il contenuto di malondialdeide (MDA) può essere utilizzato come indicatore per valutare il livello di ROS e il grado di danno alla membrana plasmatica delle piante37. Il sistema antiossidante è un importante meccanismo di protezione per neutralizzare le specie reattive dell'ossigeno38. Le attività degli enzimi antiossidanti (tra cui POD, SOD e CAT) sono tipicamente alterate dallo stress da cadmio. I risultati hanno mostrato che il contenuto di MDA era correlato positivamente con la concentrazione di Cd, indicando che l'entità della perossidazione lipidica della membrana vegetale si è aggravata con l'aumentare della concentrazione di Cd37. Ciò è coerente con i risultati dello studio di Ouyang et al.39. Questo studio mostra che il contenuto di MDA è significativamente influenzato da calce, acido ossalico, calce e acido ossalico. Dopo la nebulizzazione di acido ossalico 0,1 mol L-1, il contenuto di MDA nel Panax notoginseng è diminuito, indicando che l'acido ossalico potrebbe ridurre la biodisponibilità di Cd e i livelli di ROS nel Panax notoginseng. Il sistema enzimatico antiossidante è dove avviene la funzione di detossificazione della pianta. La SOD rimuove l'O2- contenuto nelle cellule vegetali e produce O2 non tossico e H2O2 a bassa tossicità. La POD e la CAT rimuovono l'H2O2 dai tessuti vegetali e catalizzano la decomposizione dell'H2O2 in H2O. Sulla base dell'analisi proteomica iTRAQ, è stato riscontrato che i livelli di espressione proteica di SOD e PAL erano diminuiti e il livello di espressione di POD era aumentato dopo l'applicazione di calce in condizioni di stress da Cd40. Le attività di CAT, SOD e POD nella radice di Panax notoginseng sono state influenzate significativamente dal dosaggio di acido ossalico e calce. Il trattamento con irrorazione di acido ossalico 0,1 mol L-1 ha aumentato significativamente l'attività di SOD e CAT, ma l'effetto regolatore sull'attività di POD non è stato evidente. Ciò dimostra che l'acido ossalico accelera la decomposizione delle ROS sotto stress da Cd e completa principalmente la rimozione di H2O2 regolando l'attività di CAT, il che è simile ai risultati della ricerca di Guo et al.41 sugli enzimi antiossidanti di Pseudospermum sibiricum. Kos. ). L'effetto dell'aggiunta di 750 kg/h/m2 di calce sull'attività degli enzimi del sistema antiossidante e sul contenuto di malondialdeide è simile all'effetto dell'irrorazione con acido ossalico. I risultati hanno mostrato che il trattamento con irrorazione di acido ossalico potrebbe migliorare più efficacemente le attività di SOD e CAT in Panax notoginseng e aumentare la resistenza allo stress di Panax notoginseng. Le attività di SOD e POD sono diminuite con il trattamento con acido ossalico 0,2 mol L-1 e calce 3750 kg hm-2, indicando che l'eccessiva irrorazione di alte concentrazioni di acido ossalico e Ca2+ può causare stress alle piante, il che è coerente con lo studio di Luo et al. Wait 42.