In precedenza avevamo riportato che i livelli sierici dell'acido indol-3-propionico (IPA), un metabolita del triptofano di origine intestinale, sono inferiori nei pazienti con fibrosi epatica. In questo studio, abbiamo analizzato il trascrittoma e il metiloma del DNA nei fegati di soggetti obesi in relazione ai livelli sierici di IPA, nonché il ruolo dell'IPA nell'induzione dell'inattivazione fenotipica delle cellule stellate epatiche (HSC) in vitro.
Lo studio ha incluso 116 pazienti obesi senza diabete mellito di tipo 2 (T2DM) (età 46,8 ± 9,3 anni; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) sottoposti a chirurgia bariatrica presso il Centro di Chirurgia Bariatrica di Kuopio (KOBS). I livelli circolanti di IPA sono stati misurati mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), l'analisi del trascrittoma epatico è stata eseguita mediante sequenziamento dell'RNA totale e l'analisi della metilazione del DNA è stata eseguita utilizzando l'Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Per gli esperimenti in vitro sono state utilizzate cellule stellate epatiche umane (LX-2).
I livelli sierici di IPA erano correlati all'espressione di geni coinvolti nei processi apoptotici, mitofagici e di longevità nel fegato. Il gene AKT1 (AKT1, serina/treonina chinasi 1) era il gene interagente più abbondante e dominante nei profili di trascrizione e metilazione del DNA nel fegato. Il trattamento con IPA ha indotto apoptosi, ridotto la respirazione mitocondriale e alterato la morfologia cellulare e la dinamica mitocondriale modulando l'espressione di geni noti per regolare la fibrosi, l'apoptosi e la sopravvivenza delle cellule LX-2.
Nel complesso, questi dati supportano l'ipotesi che l'IPA abbia potenziali effetti terapeutici e possa indurre apoptosi e spostare il fenotipo delle cellule stellate epatiche (HSC) verso uno stato inattivo, ampliando così la possibilità di inibire la fibrosi epatica interferendo con l'attivazione delle HSC e il metabolismo mitocondriale.
La prevalenza dell'obesità e della sindrome metabolica è stata associata a un'incidenza crescente della steatosi epatica metabolicamente associata (MASLD); la malattia colpisce dal 25% al ​​30% della popolazione generale [1]. La principale conseguenza dell'eziologia della MASLD è la fibrosi epatica, un processo dinamico caratterizzato dal continuo accumulo di matrice extracellulare fibrosa (ECM) [2]. Le principali cellule coinvolte nella fibrosi epatica sono le cellule stellate epatiche (HSC), che presentano quattro fenotipi noti: quiescenti, attivate, inattivate e senescenti [3, 4]. Le HSC possono essere attivate e transdifferenziarsi da una forma quiescente in cellule proliferative simili a fibroblasti con elevate richieste energetiche, con una maggiore espressione di α-actina del muscolo liscio (α-SMA) e collagene di tipo I (Col-I) [5, 6]. Durante la regressione della fibrosi epatica, le HSC attivate vengono eliminate tramite apoptosi o inattivazione. Questi processi includono la downregulation dei geni fibrogenici e la modulazione dei geni pro-sopravvivenza (come le vie di segnalazione NF-κB e PI3K/Akt) [7, 8], nonché cambiamenti nella dinamica e nella funzione mitocondriale [9].
È stato riscontrato che i livelli sierici del metabolita del triptofano acido indol-3-propionico (IPA), prodotto nell'intestino, sono diminuiti nelle malattie metaboliche umane, tra cui la MASLD [10–13]. L'IPA è associato all'assunzione di fibre alimentari, è noto per i suoi effetti antiossidanti e antinfiammatori e attenua il fenotipo della steatoepatite non alcolica (NASH) indotta dalla dieta in vivo e in vitro [11–14]. Alcune prove provengono dal nostro precedente studio, che ha dimostrato che i livelli sierici di IPA erano inferiori nei pazienti con fibrosi epatica rispetto ai pazienti obesi senza fibrosi epatica nello studio di chirurgia bariatrica di Kuopio (KOBS). Inoltre, abbiamo dimostrato che il trattamento con IPA potrebbe ridurre l'espressione di geni che sono marcatori classici dell'adesione cellulare, della migrazione cellulare e dell'attivazione delle cellule staminali ematopoietiche in un modello di cellule stellate epatiche umane (LX-2) ed è un potenziale metabolita epatoprotettivo [15]. Tuttavia, non è ancora chiaro come l'IPA induca la regressione della fibrosi epatica attivando l'apoptosi delle cellule stellate epatiche e la bioenergetica mitocondriale.
In questo studio, dimostriamo che l'IPA sierico è associato all'espressione di geni arricchiti nei percorsi di apoptosi, mitofagia e longevità nel fegato di individui obesi ma non affetti da diabete di tipo 2 (KOBS). Inoltre, abbiamo scoperto che l'IPA può indurre la rimozione e la degradazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) attivate attraverso il percorso di inattivazione. Questi risultati rivelano un nuovo ruolo per l'IPA, rendendolo un potenziale bersaglio terapeutico per promuovere la regressione della fibrosi epatica.
Uno studio precedente nella coorte KOBS ha mostrato che i pazienti con fibrosi epatica avevano livelli circolanti di IPA più bassi rispetto ai pazienti senza fibrosi epatica [15]. Per escludere il potenziale effetto confondente del diabete di tipo 2, abbiamo reclutato 116 pazienti obesi senza diabete di tipo 2 (età media ± DS: 46,8 ± 9,3 anni; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabella 1) dallo studio KOBS in corso come popolazione di studio [16]. Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto e il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale della Contea di Savo Nord in conformità con la Dichiarazione di Helsinki (54/2005, 104/2008 e 27/2010).
I campioni di biopsia epatica sono stati ottenuti durante la chirurgia bariatrica e valutati istologicamente da patologi esperti secondo criteri precedentemente descritti [17, 18]. I criteri di valutazione sono riassunti nella Tabella supplementare S1 e sono stati descritti in precedenza [19].
Campioni di siero a digiuno sono stati analizzati mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa non mirata (LC-MS) per l'analisi metabolomica (n = 116). I campioni sono stati analizzati utilizzando un sistema UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germania) come descritto in precedenza19. L'identificazione dell'alcol isopropilico (IPA) si è basata sul tempo di ritenzione e sul confronto dello spettro MS/MS con standard puri. L'intensità del segnale IPA (area del picco) è stata considerata in tutte le analisi successive [20].
Il sequenziamento dell'RNA dell'intero fegato è stato eseguito utilizzando Illumina HiSeq 2500 e i dati sono stati pre-elaborati come descritto in precedenza [19, 21, 22]. Abbiamo eseguito un'analisi mirata dell'espressione differenziale dei trascritti che influenzano la funzione/biogenesi mitocondriale utilizzando 1957 geni selezionati dal database MitoMiner 4.0 [ 23 ]. L'analisi della metilazione del DNA epatico è stata eseguita utilizzando Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) utilizzando la stessa metodologia descritta in precedenza [24, 25 ].
Le cellule stellate epatiche umane (LX-2) sono state gentilmente fornite dal Prof. Stefano Romeo e coltivate e mantenute in terreno DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Per selezionare la dose di lavoro di IPA, le cellule LX-2 sono state trattate con diverse concentrazioni di IPA (10 μM, 100 μM e 1 mM; Sigma, 220027) in terreno DMEM/F12 per 24 ore. Inoltre, per studiare la capacità dell'IPA di inattivare le HSC, le cellule LX-2 sono state co-trattate con 5 ng/ml di TGF-β1 (R&D Systems, 240-B-002/CF) e 1 mM di IPA in terreno privo di siero per 24 ore. Per i corrispondenti controlli del veicolo, è stato utilizzato HCl 4 nM contenente BSA allo 0,1% per il trattamento con TGF-β1 e DMSO allo 0,05% per il trattamento con IPA, ed entrambi sono stati utilizzati insieme per il trattamento combinato.
L'apoptosi è stata valutata utilizzando il kit di rilevamento dell'apoptosi FITC Annexin V con 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) secondo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule LX-2 (1 × 10⁵ cellule/pozzetto) sono state coltivate per una notte in piastre a 12 pozzetti e quindi trattate con dosi multiple di IPA o IPA e TGF-β1. Il giorno seguente, le cellule in sospensione e aderenti sono state raccolte, tripsinizzate, lavate con PBS, risospese in tampone di legame per Annexin V e incubate con FITC-Annexin V e 7-AAD per 15 minuti.
I mitocondri nelle cellule viventi sono stati colorati per l'attività ossidativa utilizzando Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Per i test MTR, le cellule LX-2 sono state incubate a densità uguali con IPA e TGF-β1. Dopo 24 ore, le cellule viventi sono state tripsinizzate, lavate con PBS e quindi incubate con 100 μM di MTR in terreno privo di siero a 37 °C per 20 minuti come descritto in precedenza [ 26 ]. Per l'analisi della morfologia delle cellule viventi, le dimensioni cellulari e la complessità citoplasmatica sono state analizzate utilizzando rispettivamente i parametri di diffusione frontale (FSC) e diffusione laterale (SSC).
Tutti i dati (30.000 eventi) sono stati acquisiti utilizzando NovoCyte Quanteon (Agilent) e analizzati con i software NovoExpress® 1.4.1 o FlowJo V.10.
Il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) sono stati misurati in tempo reale utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) dotato di un Seahorse XF Cell Mito Stress secondo le istruzioni del produttore. In breve, 2 × 104 cellule LX-2/pozzetto sono state seminate su piastre di coltura cellulare XF96. Dopo l'incubazione notturna, le cellule sono state trattate con isopropanolo (IPA) e TGF-β1 (Metodi supplementari 1). L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il software Seahorse XF Wave, che include il generatore di report del test del fenotipo energetico cellulare Seahorse XF. Da questo, è stato calcolato un indice di salute bioenergetica (BHI) [27].
L'RNA totale è stato trascritto in cDNA. Per i metodi specifici, vedere il riferimento [15]. I livelli di mRNA della proteina acida ribosomiale 60S umana P0 (RPLP0) e della ciclofilina A1 (PPIA) sono stati utilizzati come controlli genici costitutivi. Il sistema QuantStudio 6 pro Real-Time PCR (Thermo Fisher, Landsmeer, Paesi Bassi) è stato utilizzato con il kit TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) o il kit Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), e il fold dell'espressione genica relativa è stato calcolato utilizzando i parametri di ciclizzazione del valore Ct comparativo (ΔΔCt) e il metodo ∆∆Ct. I dettagli dei primer sono forniti nelle tabelle supplementari S2 e S3.
Il DNA nucleare (ncDNA) e il DNA mitocondriale (mtDNA) sono stati estratti utilizzando il kit DNeasy blood and tissue (Qiagen) come descritto in precedenza [28]. La quantità relativa di mtDNA è stata calcolata calcolando il rapporto di ciascuna regione target di mtDNA rispetto alla media geometrica delle tre regioni di DNA nucleare (mtDNA/ncDNA), come dettagliato nei Metodi supplementari 2. I dettagli dei primer per mtDNA e ncDNA sono forniti nella Tabella supplementare S4.
Le cellule vive sono state colorate con Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) per visualizzare le reti mitocondriali intercellulari e intracellulari. Le cellule LX-2 (1 × 104 cellule/pozzetto) sono state coltivate su vetrini in piastre di coltura con fondo in vetro corrispondenti (Ibidi GmbH, Martinsried, Germania). Dopo 24 ore, le cellule LX-2 vive sono state incubate con 100 μM di MTR per 20 minuti a 37 °C e i nuclei cellulari sono stati colorati con DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) come descritto in precedenza [29]. Le reti mitocondriali sono state visualizzate utilizzando un microscopio invertito Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germania) dotato di un modulo confocale Zeiss LSM 800 a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2 utilizzando un obiettivo 63×NA 1.3. Abbiamo acquisito dieci immagini della serie Z per ogni tipo di campione. Ogni serie Z contiene 30 sezioni, ciascuna con uno spessore di 9,86 μm. Per ogni campione, sono state acquisite immagini di dieci diversi campi visivi utilizzando il software ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germania) e l'analisi della morfologia mitocondriale è stata eseguita utilizzando il software ImageJ (v1.54d) [30, 31] secondo i parametri dettagliati nei Metodi supplementari 3.
Le cellule sono state fissate con glutaraldeide al 2% in tampone fosfato 0,1 M, seguita da fissazione con soluzione di tetrossido di osmio all'1% (Sigma Aldrich, MO, USA), disidratate gradualmente con acetone (Merck, Darmstadt, Germania) e infine incluse in resina epossidica. Sono state preparate sezioni ultrasottili e colorate con acetato di uranile all'1% (Merck, Darmstadt, Germania) e citrato di piombo all'1% (Merck, Darmstadt, Germania). Le immagini ultrastrutturali sono state ottenute utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Giappone) a una tensione di accelerazione di 80 kV.
La morfologia delle cellule LX-2 trattate con IPA per 24 ore è stata analizzata mediante microscopia a contrasto di fase a 50 ingrandimenti utilizzando un microscopio ottico invertito Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 e AxioCam MRm, Jena, Germania).
I dati clinici sono stati espressi come media ± deviazione standard o mediana (intervallo interquartile: IQR). Per confrontare le differenze tra i tre gruppi di studio è stata utilizzata l'analisi della varianza a una via (per le variabili continue) o il test χ² (per le variabili categoriche). Il tasso di falsi positivi (FDR) è stato utilizzato per correggere i test multipli e i geni con FDR < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. L'analisi di correlazione di Spearman è stata utilizzata per correlare la metilazione del DNA CpG con l'intensità del segnale IPA, con valori p nominali (p < 0,05) riportati.
L'analisi dei percorsi metabolici è stata eseguita utilizzando uno strumento di analisi di set di geni basato sul web (WebGestalt) per 268 trascritti (p nominale < 0,01), 119 trascritti associati ai mitocondri (p nominale < 0,05) e 4350 CpG su 3093 trascritti epatici associati ai livelli sierici circolanti di IPA. Lo strumento Venny DB (versione 2.1.0), disponibile gratuitamente, è stato utilizzato per trovare i geni sovrapposti e StringDB (versione 11.5) per visualizzare le interazioni proteina-proteina.
Per l'esperimento LX-2, i campioni sono stati testati per la normalità utilizzando il test di D'Agostino-Pearson. I dati sono stati ottenuti da almeno tre repliche biologiche e sottoposti ad ANOVA a una via con test post hoc di Bonferroni. Un valore di p inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. I dati sono presentati come media ± deviazione standard e il numero di esperimenti è indicato in ogni figura. Tutte le analisi e i grafici sono stati realizzati utilizzando il software statistico GraphPad Prism 8 per Windows (GraphPad Software Inc., versione 8.4.3, San Diego, USA).
Innanzitutto, abbiamo studiato l'associazione dei livelli sierici di IPA con i trascritti epatici, dell'intero organismo e mitocondriali. Nel profilo trascrittomico totale, il gene maggiormente associato ai livelli sierici di IPA era MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; chinasi proteica attivata da mitogeni 3); nel profilo trascrittomico correlato ai mitocondri, il gene maggiormente associato era AKT1 (FDR = 0,7621; chinasi serina/treonina AKT 1) (File supplementare 1 e File supplementare 2).
Abbiamo quindi analizzato i trascritti globali (n = 268; p < 0,01) e i trascritti associati ai mitocondri (n = 119; p < 0,05), identificando infine l'apoptosi come la via canonica più significativa (p = 0,0089). Per i trascritti mitocondriali associati ai livelli sierici di IPA, ci siamo concentrati sull'apoptosi (FDR = 0,00001), sulla mitofagia (FDR = 0,00029) e sulle vie di segnalazione del TNF (FDR = 0,000006) (Figura 1A, Tabella 2 e Figure supplementari 1A-B).
Analisi sovrapposta di trascritti globali, trascritti associati ai mitocondri e metilazione del DNA nel fegato umano in associazione con i livelli sierici di IPA. A rappresenta 268 trascritti globali, 119 trascritti associati ai mitocondri e trascritti metilati del DNA mappati su 3092 siti CpG associati ai livelli sierici di IPA (valori p < 0,01 per i trascritti globali e metilati del DNA e valori p < 0,05 per i trascritti mitocondriali). I principali trascritti sovrapposti sono mostrati al centro (AKT1 e YKT6). B La mappa di interazione dei 13 geni con il punteggio di interazione più alto (0,900) con altri geni è stata costruita dai 56 geni sovrapposti (regione della linea nera) che erano significativamente associati ai livelli sierici di IPA utilizzando lo strumento online StringDB. Verde: Geni mappati al componente cellulare Gene Ontology (GO): mitocondri (GO:0005739). AKT1 è la proteina con il punteggio più alto (0,900) per le interazioni con altre proteine ​​in base ai dati (basati su text mining, esperimenti, database e co-espressione). I nodi della rete rappresentano le proteine ​​e gli archi rappresentano le connessioni tra le proteine.
Poiché i metaboliti del microbiota intestinale possono regolare la composizione epigenetica attraverso la metilazione del DNA [32], abbiamo studiato se i livelli sierici di IPA fossero associati alla metilazione del DNA epatico. Abbiamo scoperto che i due principali siti di metilazione associati ai livelli sierici di IPA erano vicino alla regione ricca di prolina-serina 3 (C19orf55) e al membro 6 della famiglia delle proteine ​​da shock termico B (piccolo) (HSPB6) (File supplementare 3). La metilazione del DNA di 4350 CpG (p < 0,01) era correlata ai livelli sierici di IPA ed era arricchita nei percorsi regolatori della longevità (p = 0,006) (Figura 1A, Tabella 2 e Figura supplementare 1C).
Per comprendere i meccanismi biologici alla base delle associazioni tra i livelli sierici di IPA, i trascritti globali, i trascritti associati ai mitocondri e la metilazione del DNA nel fegato umano, abbiamo eseguito un'analisi di sovrapposizione dei geni identificati nella precedente analisi del pathway (Figura 1A). I ​​risultati dell'analisi di arricchimento del pathway dei 56 geni sovrapposti (all'interno della linea nera nella Figura 1A) hanno mostrato che il pathway dell'apoptosi (p = 0,00029) ha evidenziato due geni comuni alle tre analisi: AKT1 e YKT6 (omologo v-SNARE di YKT6), come mostrato nel diagramma di Venn (Figura supplementare 2 e Figura 1A). È interessante notare che abbiamo scoperto che AKT1 (cg19831386) e YKT6 (cg24161647) erano correlati positivamente con i livelli sierici di IPA (File aggiuntivo 3). Per identificare potenziali interazioni proteiche tra i prodotti genici, abbiamo selezionato 13 geni con il punteggio più alto nella regione comune (0,900) tra 56 geni sovrapposti come input e abbiamo costruito una mappa di interazione. In base al livello di confidenza (confidenza marginale), il gene AKT1 con il punteggio più alto (0,900) si trovava in cima (Figura 1B).
Sulla base dell'analisi del percorso, abbiamo scoperto che l'apoptosi era il percorso principale, quindi abbiamo studiato se il trattamento con IPA avrebbe influenzato l'apoptosi delle HSC in vitro. Abbiamo precedentemente dimostrato che diverse dosi di IPA (10 μM, 100 μM e 1 mM) non erano tossiche per le cellule LX-2 [15]. Questo studio ha mostrato che il trattamento con IPA a 10 μM e 100 μM ha aumentato il numero di cellule vitali e necrotiche. Tuttavia, rispetto al gruppo di controllo, la vitalità cellulare è diminuita alla concentrazione di IPA di 1 mM, mentre il tasso di necrosi cellulare è rimasto invariato (Figura 2A, B). Successivamente, per trovare la concentrazione ottimale per indurre l'apoptosi nelle cellule LX-2, abbiamo testato 10 μM, 100 μM e 1 mM di IPA per 24 ore (Figura 2A-E e Figura supplementare 3A-B). È interessante notare che IPA 10 μM e 100 μM hanno ridotto il tasso di apoptosi (%), tuttavia, IPA 1 mM ha aumentato l'apoptosi tardiva e il tasso di apoptosi (%) rispetto al controllo ed è stato quindi scelto per ulteriori esperimenti (Figure 2A–D).
L'IPA induce l'apoptosi delle cellule LX-2. Il metodo di doppia colorazione con Annexina V e 7-AAD è stato utilizzato per quantificare il tasso di apoptosi e la morfologia cellulare mediante citometria a flusso. Le cellule BA sono state incubate con 10 μM, 100 μM e 1 mM di IPA per 24 ore o con F–H TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM di IPA in terreno privo di siero per 24 ore. A: cellule vive (Annexina V -/ 7AAD-); B: cellule necrotiche (Annexina V -/ 7AAD+); C, F: fase precoce (Annexina V +/ 7AAD-); D, G: fase tardiva (Annexina V+/7AAD+); E, H: percentuale di cellule apoptotiche precoci e tardive totali nel tasso di apoptosi (%). I dati sono espressi come media ± DS, n = 3 esperimenti indipendenti. I confronti statistici sono stati eseguiti utilizzando l'ANOVA a una via con test post hoc di Bonferroni. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Come abbiamo dimostrato in precedenza, 5 ng/ml di TGF-β1 possono indurre l'attivazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) aumentando l'espressione dei geni marcatori classici [15]. Le cellule LX-2 sono state trattate con 5 ng/ml di TGF-β1 e 1 mM di IPA in combinazione (Fig. 2E–H). Il trattamento con TGF-β1 non ha modificato il tasso di apoptosi, tuttavia, il co-trattamento con IPA ha aumentato l'apoptosi tardiva e il tasso di apoptosi (%) rispetto al trattamento con TGF-β1 (Fig. 2E–H). Questi risultati indicano che 1 mM di IPA può promuovere l'apoptosi nelle cellule LX-2 indipendentemente dall'induzione di TGF-β1.
Abbiamo ulteriormente studiato l'effetto dell'IPA sulla respirazione mitocondriale nelle cellule LX-2. I risultati hanno mostrato che 1 mM di IPA ha ridotto i parametri del tasso di consumo di ossigeno (OCR): respirazione non mitocondriale, respirazione basale e massima, perdita di protoni e produzione di ATP rispetto al gruppo di controllo (Figura 3A, B), mentre l'indice di salute bioenergetica (BHI) non è cambiato.
L'IPA riduce la respirazione mitocondriale nelle cellule LX-2. La curva di respirazione mitocondriale (OCR) è presentata come parametri di respirazione mitocondriale (respirazione non mitocondriale, respirazione basale, respirazione massima, perdita di protoni, produzione di ATP, SRC e BHI). Le cellule A e B sono state incubate rispettivamente con 10 μM, 100 μM e 1 mM di IPA per 24 ore. Le cellule C e D sono state incubate rispettivamente con TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM di IPA in terreno privo di siero per 24 ore. Tutte le misurazioni sono state normalizzate al contenuto di DNA utilizzando il kit CyQuant. BHI: indice di salute bioenergetica; SRC: capacità di riserva respiratoria; OCR: tasso di consumo di ossigeno. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (DS), n = 5 esperimenti indipendenti. I confronti statistici sono stati eseguiti utilizzando ANOVA a una via e test post hoc di Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; e ***p < 0,001
Per ottenere una comprensione più completa dell'effetto dell'IPA sul profilo bioenergetico delle cellule LX-2 attivate da TGF-β1, abbiamo analizzato la fosforilazione ossidativa mitocondriale tramite OCR (Fig. 3C,D). I risultati hanno mostrato che il trattamento con TGF-β1 poteva ridurre la respirazione massima, la capacità di riserva respiratoria (SRC) e il BHI rispetto al gruppo di controllo (Fig. 3C,D). Inoltre, il trattamento combinato ha diminuito la respirazione basale, la perdita di protoni e la produzione di ATP, ma SRC e BHI erano significativamente più alti rispetto a quelli trattati con TGF-β1 (Fig. 3C,D).
Abbiamo anche eseguito il "Cellular Energy Phenotype Test" fornito dal software Seahorse (Figura supplementare 4A-D). Come mostrato nella Figura supplementare 3B, entrambi i potenziali metabolici OCR ed ECAR sono diminuiti dopo il trattamento con TGF-β1, tuttavia, non è stata osservata alcuna differenza nei gruppi di trattamento combinato e IPA rispetto al gruppo di controllo. Inoltre, sia i livelli basali che quelli di stress di OCR sono diminuiti dopo il trattamento combinato e IPA rispetto al gruppo di controllo (Figura supplementare 4C). È interessante notare che un modello simile è stato osservato con la terapia combinata, dove non è stata osservata alcuna variazione nei livelli basali e di stress di ECAR rispetto al trattamento con TGF-β1 (Figura supplementare 4C). Negli HSC, la riduzione della fosforilazione ossidativa mitocondriale e la capacità del trattamento combinato di ripristinare SCR e BHI dopo l'esposizione al trattamento con TGF-β1 non hanno alterato il potenziale metabolico (OCR ed ECAR). Nel complesso, questi risultati indicano che l'IPA può ridurre la bioenergetica nelle cellule staminali ematopoietiche (HSC), suggerendo che l'IPA possa indurre un profilo energetico inferiore che sposta il fenotipo delle HSC verso l'inattivazione (Figura supplementare 4D).
L'effetto dell'IPA sulla dinamica mitocondriale è stato studiato utilizzando la quantificazione tridimensionale della morfologia mitocondriale e delle connessioni di rete, nonché la colorazione MTR (Figura 4 e Figura supplementare 5). La Figura 4 mostra che, rispetto al gruppo di controllo, il trattamento con TGF-β1 ha ridotto l'area superficiale media, il numero di ramificazioni, la lunghezza totale delle ramificazioni e il numero di giunzioni delle ramificazioni (Figura 4A e B) e ha modificato la proporzione di mitocondri da morfologia sferica a morfologia intermedia (Figura 4C). Solo il trattamento con IPA ha ridotto il volume mitocondriale medio e modificato la proporzione di mitocondri da morfologia sferica a morfologia intermedia rispetto al gruppo di controllo (Figura 4A). Al contrario, la sfericità, la lunghezza media delle ramificazioni e l'attività mitocondriale valutata tramite MTR dipendente dal potenziale di membrana mitocondriale (Figura 4A e E) sono rimaste invariate e questi parametri non differivano tra i gruppi. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che il trattamento con TGF-β1 e IPA sembra modulare la forma e le dimensioni dei mitocondri, nonché la complessità della rete mitocondriale, nelle cellule LX-2 viventi.
L'IPA altera la dinamica mitocondriale e l'abbondanza di DNA mitocondriale nelle cellule LX-2. A. Immagini confocali rappresentative di cellule LX-2 vive incubate con TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM di IPA per 24 ore in terreno privo di siero, che mostrano reti mitocondriali colorate con Mitotracker™ Red CMXRos e nuclei colorati di blu con DAPI. Tutti i dati contenevano almeno 15 immagini per gruppo. Abbiamo acquisito 10 immagini Z-stack per ogni tipo di campione. Ogni sequenza dell'asse Z conteneva 30 fette, ciascuna con uno spessore di 9,86 μm. Barra di scala: 10 μm. B. Oggetti rappresentativi (solo mitocondri) identificati applicando una sogliatura adattiva all'immagine. L'analisi quantitativa e il confronto delle connessioni della rete morfologica mitocondriale sono stati eseguiti per tutte le cellule in ciascun gruppo. C. Frequenza dei rapporti di forma mitocondriale. Valori prossimi a 0 indicano forme sferiche, mentre valori prossimi a 1 indicano forme filamentose. D Il contenuto di DNA mitocondriale (mtDNA) è stato determinato come descritto in Materiali e Metodi. E L'analisi Mitotracker™ Red CMXRos è stata eseguita mediante citometria a flusso (30.000 eventi) come descritto in Materiali e Metodi. I dati sono presentati come media ± DS, n = 3 esperimenti indipendenti. I confronti statistici sono stati eseguiti utilizzando ANOVA a una via e test post hoc di Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Abbiamo quindi analizzato il contenuto di mtDNA nelle cellule LX-2 come indicatore del numero di mitocondri. Rispetto al gruppo di controllo, il contenuto di mtDNA è risultato aumentato nel gruppo trattato con TGF-β1 (Figura 4D). Rispetto al gruppo trattato con TGF-β1, il contenuto di mtDNA è risultato diminuito nel gruppo sottoposto a trattamento combinato (Figura 4D), suggerendo che l'IPA potrebbe ridurre il contenuto di mtDNA e possibilmente anche il numero di mitocondri e la respirazione mitocondriale (Figura 3C). Inoltre, l'IPA sembrava ridurre il contenuto di mtDNA nel trattamento combinato, ma non influenzava l'attività mitocondriale mediata da MTR (Figure 4A-C).
Abbiamo studiato l'associazione di IPA con i livelli di mRNA dei geni associati a fibrosi, apoptosi, sopravvivenza e dinamica mitocondriale nelle cellule LX-2 (Figura 5A-D). Rispetto al gruppo di controllo, il gruppo trattato con TGF-β1 ha mostrato un'espressione aumentata di geni come la catena α2 del collagene di tipo I (COL1A2), l'α-actina del muscolo liscio (αSMA), la metalloproteinasi della matrice 2 (MMP2), l'inibitore tissutale della metalloproteinasi 1 (TIMP1) e il gene simile alla dinamina 1 (DRP1), indicando un aumento della fibrosi e dell'attivazione. Inoltre, rispetto al gruppo di controllo, il trattamento con TGF-β1 ha ridotto i livelli di mRNA del recettore nucleare del pregnano X (PXR), della caspasi 8 (CASP8), di MAPKAPK3, dell'inibitore delle cellule B α, dell'enhancer del gene del fattore nucleare κ peptide leggero (NFκB1A) e dell'inibitore della subunità chinasi del fattore nucleare κB β (IKBKB) (Figura 5A–D). Rispetto al trattamento con TGF-β1, il trattamento combinato con TGF-β1 e IPA ha ridotto l'espressione di COL1A2 e MMP2, ma ha aumentato i livelli di mRNA di PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β e IKBKB. Il trattamento con IPA ha ridotto significativamente l'espressione di MMP2, proteina X associata a Bcl-2 (BAX), AKT1, proteina 1 dell'atrofia ottica (OPA1) e proteina 2 di fusione mitocondriale (MFN2), mentre l'espressione di CASP8, NFκB1A, NFκB1B e IKBKB è risultata aumentata rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, non è stata riscontrata alcuna differenza nell'espressione di caspasi-3 (CASP3), fattore 1 di attivazione della peptidasi apoptotica (APAF1), proteina 1 di fusione mitocondriale (MFN1) e proteina 1 di fissione (FIS1). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che il trattamento con IPA modula l'espressione di geni associati a fibrosi, apoptosi, sopravvivenza e dinamica mitocondriale. I nostri dati indicano che il trattamento con IPA riduce la fibrosi nelle cellule LX-2 e, allo stesso tempo, stimola la sopravvivenza spostando il fenotipo verso l'inattivazione.
L'IPA modula l'espressione dei geni coinvolti nei fibroblasti, nell'apoptosi, nella vitalità cellulare e nella dinamica mitocondriale nelle cellule LX-2. Gli istogrammi mostrano l'espressione dell'mRNA rispetto al controllo endogeno (RPLP0 o PPIA) dopo l'induzione delle cellule LX-2 con TGF-β1 e IPA in terreno privo di siero per 24 ore. A indica i fibroblasti, B indica le cellule apoptotiche, C indica le cellule sopravvissute e D indica l'espressione dei geni coinvolti nella dinamica mitocondriale. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (DS), n = 3 esperimenti indipendenti. I confronti statistici sono stati eseguiti utilizzando l'ANOVA a una via e il test post hoc di Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Successivamente, le variazioni delle dimensioni cellulari (FSC-H) e della complessità citoplasmatica (SSC-H) sono state valutate mediante citometria a flusso (Figura 6A,B), mentre le variazioni della morfologia cellulare dopo il trattamento con IPA sono state valutate mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e microscopia a contrasto di fase (Figura supplementare 6A-B). Come previsto, le cellule del gruppo trattato con TGF-β1 hanno mostrato un aumento di dimensioni rispetto al gruppo di controllo (Figura 6A,B), evidenziando la classica espansione del reticolo endoplasmatico rugoso (ER*) e dei fagolisosomi (P), indicativa dell'attivazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) (Figura supplementare 6A). Tuttavia, rispetto al gruppo trattato con TGF-β1, le dimensioni cellulari, la complessità citoplasmatica (Fig. 6A,B) e il contenuto di ER* sono risultati ridotti nel gruppo trattato con la combinazione di TGF-β1 e IPA (Figura supplementare 6A). Inoltre, il trattamento con IPA ha ridotto le dimensioni cellulari, la complessità citoplasmatica (Figg. 6A,B), il contenuto di P e ER* (Figura supplementare 6A) rispetto al gruppo di controllo. In aggiunta, il contenuto di cellule apoptotiche è aumentato dopo 24 ore di trattamento con IPA rispetto al gruppo di controllo (frecce bianche, Figura supplementare 6B). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che 1 mM di IPA può stimolare l'apoptosi delle HSC e invertire le modifiche dei parametri morfologici cellulari indotte dal TGF-β1, regolando così le dimensioni e la complessità cellulare, che potrebbero essere associate all'inattivazione delle HSC.
L'IPA altera le dimensioni cellulari e la complessità citoplasmatica nelle cellule LX-2. Immagini rappresentative dell'analisi mediante citometria a flusso. L'analisi ha utilizzato una strategia di gating specifica per le cellule LX-2: SSC-A/FSC-A per definire la popolazione cellulare, FSC-H/FSC-A per identificare i doppietti e SSC-H/FSC-H per l'analisi delle dimensioni cellulari e della complessità. Le cellule sono state incubate con TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM di IPA in terreno privo di siero per 24 ore. Le cellule LX-2 sono state distribuite nel quadrante inferiore sinistro (SSC-H-/FSC-H-), nel quadrante superiore sinistro (SSC-H+/FSC-H-), nel quadrante inferiore destro (SSC-H-/FSC-H+) e nel quadrante superiore destro (SSC-H+/FSC-H+) per l'analisi delle dimensioni cellulari e della complessità citoplasmatica. B. La morfologia cellulare è stata analizzata mediante citometria a flusso utilizzando FSC-H (dispersione frontale, dimensione cellulare) e SSC-H (dispersione laterale, complessità citoplasmatica) (30.000 eventi). I dati sono presentati come media ± DS, n = 3 esperimenti indipendenti. I confronti statistici sono stati eseguiti utilizzando ANOVA a una via e test post hoc di Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 e ****p < 0,0001
I metaboliti intestinali come l'IPA sono diventati un argomento di ricerca di grande interesse, suggerendo che nuovi bersagli potrebbero essere scoperti nel microbiota intestinale. È quindi interessante notare che l'IPA, un metabolita che abbiamo collegato alla fibrosi epatica negli esseri umani [15], si è dimostrato un potenziale composto antifibrotico in modelli animali [13, 14]. Qui, dimostriamo per la prima volta un'associazione tra IPA sierico e trascrittomica epatica globale e metilazione del DNA in individui obesi senza diabete di tipo 2 (T2D), evidenziando apoptosi, mitofagia e longevità, nonché un possibile gene candidato AKT1 che regola l'omeostasi epatica. Un'altra novità del nostro studio è che abbiamo dimostrato l'interazione del trattamento con IPA con apoptosi, morfologia cellulare, bioenergetica e dinamica mitocondriale nelle cellule LX-2, indicando uno spettro energetico inferiore che sposta il fenotipo HSC verso l'inattivazione, rendendo l'IPA un potenziale candidato per migliorare la fibrosi epatica.
Abbiamo scoperto che l'apoptosi, la mitofagia e la longevità erano i percorsi canonici più importanti arricchiti nei geni epatici associati all'IPA sierico circolante. L'interruzione del sistema di controllo della qualità mitocondriale (MQC) può portare a disfunzione mitocondriale, mitofagia e apoptosi, promuovendo così l'insorgenza di MASLD[33, 34]. Pertanto, possiamo ipotizzare che l'IPA possa essere coinvolto nel mantenimento della dinamica cellulare e dell'integrità mitocondriale attraverso l'apoptosi, la mitofagia e la longevità nel fegato. I nostri dati hanno mostrato che due geni erano comuni a tutti e tre i test: YKT6 e AKT1. Vale la pena notare che YKT6 è una proteina SNARE coinvolta nel processo di fusione della membrana cellulare. Svolge un ruolo nell'autofagia e nella mitofagia formando un complesso di iniziazione con STX17 e SNAP29 sull'autofagosoma, promuovendo così la fusione di autofagosomi e lisosomi[35]. Inoltre, la perdita della funzione di YKT6 si traduce in una mitofagia compromessa[36], mentre l'upregolazione di YKT6 è associata alla progressione del carcinoma epatocellulare (HCC), mostrando una maggiore sopravvivenza cellulare[37]. D'altra parte, AKT1 è il gene interagente più importante e svolge un ruolo importante nelle malattie del fegato, tra cui la via di segnalazione PI3K/AKT, il ciclo cellulare, la migrazione cellulare, la proliferazione, l'adesione focale, la funzione mitocondriale e la secrezione di collagene[38–40]. La via di segnalazione PI3K/AKT attivata può attivare le cellule staminali ematopoietiche (HSC), che sono le cellule responsabili della produzione della matrice extracellulare (ECM), e la sua disregolazione può contribuire all'insorgenza e alla progressione della fibrosi epatica[40]. Inoltre, AKT è uno dei fattori chiave di sopravvivenza cellulare che inibisce l'apoptosi cellulare dipendente da p53, e l'attivazione di AKT può essere associata all'inibizione dell'apoptosi delle cellule epatiche[41, 42]. I risultati ottenuti suggeriscono che l'IPA potrebbe essere coinvolto nell'apoptosi associata ai mitocondri epatici, influenzando la decisione degli epatociti tra l'ingresso nell'apoptosi e la sopravvivenza. Questi effetti potrebbero essere regolati dai geni candidati AKT e/o YKT6, fondamentali per l'omeostasi epatica.
I nostri risultati hanno mostrato che 1 mM di IPA induceva apoptosi e diminuiva la respirazione mitocondriale nelle cellule LX-2 indipendentemente dal trattamento con TGF-β1. È importante notare che l'apoptosi è una via principale per la risoluzione della fibrosi e l'attivazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC), ed è anche un evento chiave nella risposta fisiologica reversibile della fibrosi epatica [4, 43]. Inoltre, il ripristino del BHI nelle cellule LX-2 dopo il trattamento combinato ha fornito nuove informazioni sul potenziale ruolo dell'IPA nella regolazione della bioenergetica mitocondriale. In condizioni di riposo e inattività, le cellule ematopoietiche normalmente utilizzano la fosforilazione ossidativa mitocondriale per produrre ATP e hanno una bassa attività metabolica. D'altra parte, l'attivazione delle HSC aumenta la respirazione e la biosintesi mitocondriale per compensare le richieste energetiche dell'ingresso nello stato glicolitico [44]. Il fatto che l'IPA non abbia influenzato il potenziale metabolico e l'ECAR suggerisce che la via glicolitica sia meno prioritaria. Allo stesso modo, un altro studio ha dimostrato che 1 mM di IPA era in grado di modulare l'attività della catena respiratoria mitocondriale nei cardiomiociti, nella linea cellulare di epatociti umani (Huh7) e nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC); tuttavia, non è stato riscontrato alcun effetto dell'IPA sulla glicolisi nei cardiomiociti, suggerendo che l'IPA potrebbe influenzare la bioenergetica di altri tipi di cellule [45]. Pertanto, ipotizziamo che 1 mM di IPA possa agire come un disaccoppiante chimico blando, poiché può ridurre significativamente l'espressione genica fibrogenica, la morfologia cellulare e la bioenergetica mitocondriale senza modificare la quantità di mtDNA [46]. I disaccoppianti mitocondriali possono inibire la fibrosi indotta dalla coltura e l'attivazione dell'HSC [47] e ridurre la produzione di ATP mitocondriale regolata o indotta da alcune proteine ​​come le proteine ​​disaccoppianti (UCP) o la translocasi dei nucleotidi adeninici (ANT). A seconda del tipo di cellula, questo fenomeno può proteggere le cellule dall'apoptosi e/o promuovere l'apoptosi [46]. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per chiarire il ruolo dell'IPA come disaccoppiante mitocondriale nell'inattivazione delle cellule staminali ematopoietiche.
Abbiamo quindi studiato se i cambiamenti nella respirazione mitocondriale si riflettono nella morfologia mitocondriale nelle cellule LX-2 viventi. È interessante notare che il trattamento con TGF-β1 altera la proporzione mitocondriale da sferica a intermedia, con una diminuzione della ramificazione mitocondriale e un aumento dell'espressione di DRP1, un fattore chiave nella fissione mitocondriale [48]. Inoltre, la frammentazione mitocondriale è associata alla complessità complessiva della rete e la transizione dalla fusione alla fissione è fondamentale per l'attivazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC), mentre l'inibizione della fissione mitocondriale porta all'apoptosi delle HSC [49]. Pertanto, i nostri risultati indicano che il trattamento con TGF-β1 può indurre una diminuzione della complessità della rete mitocondriale con una ramificazione ridotta, che è più comune nella fissione mitocondriale associata alle cellule staminali ematopoietiche (HSC) attivate. Inoltre, i nostri dati hanno mostrato che l'IPA potrebbe modificare la proporzione dei mitocondri da sferici a di forma intermedia, riducendo così l'espressione di OPA1 e MFN2. Studi hanno dimostrato che la downregulation di OPA1 potrebbe causare una diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale e innescare l'apoptosi cellulare[50]. È noto che MFN2 media la fusione mitocondriale e l'apoptosi[51]. I risultati ottenuti suggeriscono che l'induzione delle cellule LX-2 da parte di TGF-β1 e/o IPA sembra modulare la forma e le dimensioni dei mitocondri, nonché lo stato di attivazione e la complessità della rete.
I nostri risultati indicano che il trattamento combinato di TGFβ-1 e IPA potrebbe ridurre il mtDNA e i parametri morfologici cellulari regolando l'espressione dell'mRNA di geni correlati alla fibrosi, all'apoptosi e alla sopravvivenza nelle cellule che sfuggono all'apoptosi. Infatti, l'IPA ha diminuito il livello di espressione dell'mRNA di AKT1 e di importanti geni della fibrosi come COL1A2 e MMP2, ma ha aumentato il livello di espressione di CASP8, che è associato all'apoptosi. I nostri risultati hanno mostrato che dopo il trattamento con IPA, l'espressione di BAX è diminuita e l'espressione dell'mRNA delle subunità della famiglia TIMP1, BCL-2 e NF-κB è aumentata, suggerendo che l'IPA potrebbe stimolare segnali di sopravvivenza nelle cellule staminali ematopoietiche (HSC) che sfuggono all'apoptosi. Queste molecole possono agire come segnali pro-sopravvivenza nelle cellule staminali ematopoietiche attivate, che possono essere associate a una maggiore espressione di proteine ​​anti-apoptotiche (come Bcl-2), a una minore espressione di BAX pro-apoptotico e a una complessa interazione tra TIMP e NF-κB [5, 7]. L'IPA esercita i suoi effetti attraverso PXR e abbiamo scoperto che il trattamento combinato con TGF-β1 e IPA ha aumentato i livelli di espressione dell'mRNA di PXR, indicando la soppressione dell'attivazione delle HSC. È noto che la segnalazione di PXR attivato inibisce l'attivazione delle HSC sia in vivo che in vitro [52, 53]. I nostri risultati indicano che l'IPA può partecipare alla rimozione delle HSC attivate promuovendo l'apoptosi, riducendo la fibrosi e il metabolismo mitocondriale e potenziando i segnali di sopravvivenza, che sono processi tipici che convertono il fenotipo delle HSC attivate in uno inattivato. Un'altra possibile spiegazione per il potenziale meccanismo e ruolo dell'IPA nell'apoptosi è che esso elimina i mitocondri disfunzionali principalmente attraverso la mitofagia (via intrinseca) e la via di segnalazione estrinseca del TNF (Tabella 1), che è direttamente collegata alla via di segnalazione di sopravvivenza NF-κB (Figura supplementare 7). È interessante notare che i geni arricchiti correlati all'IPA sono in grado di indurre segnali pro-apoptotici e pro-sopravvivenza nella via apoptotica [54], suggerendo che l'IPA possa indurre la via apoptotica o la sopravvivenza interagendo con questi geni. Tuttavia, il modo in cui l'IPA induce l'apoptosi o la sopravvivenza durante l'attivazione dell'HSC e i suoi percorsi meccanicistici rimangono poco chiari.
L'IPA è un metabolita microbico formato dal triptofano alimentare attraverso il microbiota intestinale. Studi hanno dimostrato che possiede proprietà antinfiammatorie, antiossidanti e di regolazione epigenetica nell'ambiente intestinale.[55] Studi hanno dimostrato che l'IPA può modulare la funzione della barriera intestinale e ridurre lo stress ossidativo, il che può contribuire ai suoi effetti fisiologici locali.[56] Infatti, l'IPA viene trasportato agli organi bersaglio attraverso la circolazione e, poiché l'IPA condivide una struttura metabolica principale simile con il triptofano, la serotonina e i derivati ​​dell'indolo, l'IPA esercita azioni metaboliche che si traducono in destini metabolici competitivi.[52] L'IPA può competere con i metaboliti derivati ​​dal triptofano per i siti di legame su enzimi o recettori, potenzialmente interrompendo i normali percorsi metabolici. Ciò evidenzia la necessità di ulteriori studi sulla sua farmacocinetica e farmacodinamica per comprendere meglio la sua finestra terapeutica.[57] Resta da vedere se ciò può verificarsi anche nelle cellule staminali ematopoietiche (HSC).
Riconosciamo che il nostro studio presenta alcune limitazioni. Per esaminare specificamente le associazioni correlate all'IPA, abbiamo escluso i pazienti con diabete mellito di tipo 2 (T2DM). Riconosciamo che ciò limita l'applicabilità generale dei nostri risultati ai pazienti con diabete mellito di tipo 2 e malattia epatica avanzata. Sebbene la concentrazione fisiologica di IPA nel siero umano sia di 1–10 μM [11, 20], è stata scelta una concentrazione di 1 mM di IPA sulla base della più alta concentrazione non tossica [15] e del più alto tasso di apoptosi, senza differenze nella percentuale della popolazione di cellule necrotiche. Sebbene in questo studio siano stati utilizzati livelli suprafisiologici di IPA, attualmente non esiste un consenso sulla dose efficace di IPA [52]. Sebbene i nostri risultati siano significativi, il destino metabolico più ampio dell'IPA rimane un'area di ricerca attiva. Inoltre, i nostri risultati sull'associazione tra i livelli sierici di IPA e la metilazione del DNA dei trascritti epatici sono stati ottenuti non solo da cellule staminali ematopoietiche (HSC) ma anche da tessuti epatici. Abbiamo scelto di utilizzare cellule LX-2 umane sulla base dei nostri precedenti risultati dall'analisi del trascrittoma che l'IPA è associato all'attivazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) [15], e le HSC sono le principali cellule coinvolte nella progressione della fibrosi epatica. Il fegato è composto da molteplici tipi cellulari, quindi altri modelli cellulari come il sistema di co-coltura epatociti-HSC-cellule immunitarie combinato con l'attivazione della caspasi e la frammentazione del DNA, così come il meccanismo d'azione incluso il livello proteico, dovrebbero essere presi in considerazione per studiare il ruolo dell'IPA e la sua interazione con altri tipi di cellule epatiche.