Diverse teorie di difesa delle piante forniscono importanti indicazioni teoriche per spiegare i modelli del metabolismo specializzato delle piante, ma le loro previsioni chiave devono ancora essere testate. In questo studio, abbiamo utilizzato l'analisi di spettrometria di massa tandem (MS/MS) imparziale per esplorare sistematicamente il metaboloma di ceppi di tabacco attenuati, da singole piante a popolazioni e specie strettamente correlate, e abbiamo elaborato un gran numero di teorie spettrometriche di massa basate sugli spettri dei composti nelle informazioni. Framework per testare le previsioni chiave delle teorie della difesa ottimale (OD) e del bersaglio mobile (MT). La componente informativa della metabolomica vegetale è coerente con la teoria dell'OD, ma contraddice la principale previsione della teoria dell'MT sulle dinamiche metabolomiche causate dagli erbivori. Dalla scala micro a quella macro evolutiva, il segnale del jasmonato è stato identificato come il principale determinante dell'OD, mentre il segnale dell'etilene ha fornito una regolazione fine della risposta specifica dell'erbivoro annotata dalla rete molecolare MS/MS.
Metaboliti speciali con strutture diverse sono i principali partecipanti all'adattamento delle piante all'ambiente, in particolare nella difesa dai nemici (1). La sorprendente diversificazione del metabolismo speciale riscontrato nelle piante ha stimolato decenni di ricerche approfondite sui suoi molteplici aspetti delle funzioni ecologiche e ha formato un lungo elenco di teorie di difesa delle piante, che rappresentano lo sviluppo evolutivo ed ecologico delle interazioni pianta-insetto. La ricerca empirica fornisce indicazioni importanti (2). Tuttavia, queste teorie di difesa delle piante non hanno seguito il percorso normativo del ragionamento deduttivo ipotetico, in cui le previsioni chiave erano allo stesso livello di analisi (3) e venivano testate sperimentalmente per far avanzare il successivo ciclo di sviluppo teorico (4). Le limitazioni tecniche limitano la raccolta di dati a specifiche categorie metaboliche ed escludono l'analisi completa di metaboliti specializzati, impedendo così i confronti intercategoria essenziali per lo sviluppo teorico (5). La mancanza di dati metabolomici completi e di una valuta comune per confrontare il flusso di lavoro di elaborazione dello spazio metabolico tra diversi gruppi di piante ostacola la maturità scientifica del campo.
Gli ultimi sviluppi nel campo della metabolomica mediante spettrometria di massa tandem (MS/MS) possono caratterizzare in modo completo i cambiamenti metabolici all'interno e tra le specie di un dato clade di sistema e possono essere combinati con metodi computazionali per calcolare la similarità strutturale tra queste miscele complesse. Conoscenza pregressa di chimica (5). La combinazione di tecnologie avanzate di analisi e calcolo fornisce un quadro necessario per la verifica a lungo termine di numerose previsioni formulate dalle teorie ecologiche ed evolutive della diversità metabolica. Shannon (6) introdusse per la prima volta la teoria dell'informazione nel suo articolo fondamentale del 1948, gettando le basi per l'analisi matematica dell'informazione, che è stata utilizzata in molti campi diversi dalla sua applicazione originale. In genomica, la teoria dell'informazione è stata applicata con successo per quantificare le informazioni conservative di sequenza (7). Nella ricerca sulla trascrittomica, la teoria dell'informazione analizza i cambiamenti complessivi nel trascrittoma (8). In ricerche precedenti, abbiamo applicato il quadro statistico della teoria dell'informazione alla metabolomica per descrivere l'esperienza metabolica a livello tissutale nelle piante (9). In questo articolo combiniamo il flusso di lavoro basato su MS/MS con il quadro statistico della teoria dell'informazione, caratterizzato dalla diversità metabolica nella valuta comune, per confrontare le previsioni chiave della teoria della difesa delle piante del metaboloma indotto dagli erbivori.
I quadri teorici della difesa delle piante sono solitamente reciprocamente inclusivi e possono essere suddivisi in due categorie: quelli che cercano di spiegare la distribuzione dei metaboliti specifici delle piante in base alle funzioni di difesa, come la difesa ottimale (OD) (10), la teoria del bersaglio mobile (MT) (11) e la teoria dell'aspetto (12), mentre altri cercano spiegazioni meccaniche di come i cambiamenti nella disponibilità di risorse influenzino la crescita delle piante e l'accumulo di metaboliti specializzati, come l'ipotesi del bilancio dei nutrienti del carbonio (13), l'ipotesi del tasso di crescita (14) e l'ipotesi dell'equilibrio di crescita e differenziazione (15). I due insiemi di teorie si trovano a diversi livelli di analisi (4). Tuttavia, due teorie che coinvolgono le funzioni difensive a livello funzionale dominano il dibattito sulle difese costitutive e inducibili delle piante: la teoria OD, che presuppone che le piante investano nelle loro costose difese chimiche solo quando necessario, ad esempio quando vengono ingerite. Quando un animale erbaceo attacca, quindi, in base alla possibilità di un attacco futuro, viene assegnato il composto con una funzione difensiva (10); L'ipotesi MT propone che non vi sia un asse di cambiamento direzionale del metabolita, ma che il metabolita cambi casualmente, creando così la possibilità di ostacolare il "bersaglio di movimento" metabolico degli erbivori attaccanti. In altre parole, queste due teorie fanno previsioni opposte sul rimodellamento metabolico che si verifica dopo l'attacco degli erbivori: la relazione tra l'accumulo unidirezionale di metaboliti con funzione difensiva (OD) e cambiamenti metabolici non diretti (MT) (11).
Le ipotesi OD e MT coinvolgono non solo i cambiamenti indotti nel metaboloma, ma anche le conseguenze ecologiche ed evolutive dell'accumulo di questi metaboliti, come i costi e i benefici adattativi di questi cambiamenti metabolici in uno specifico ambiente ecologico (16). Sebbene entrambe le ipotesi riconoscano la funzione difensiva di metaboliti specializzati, che può essere o meno costosa, la previsione chiave che distingue le ipotesi OD e MT risiede nella direzionalità dei cambiamenti metabolici indotti. La previsione della teoria OD ha ricevuto finora la maggiore attenzione sperimentale. Questi test includono lo studio delle funzioni di difesa dirette o indirette di diversi tessuti di composti specifici in serre e in condizioni naturali, nonché i cambiamenti nello stadio di sviluppo delle piante (17-19). Tuttavia, finora, a causa della mancanza di un flusso di lavoro e di un quadro statistico per un'analisi globale completa della diversità metabolica di qualsiasi organismo, la principale previsione della differenza tra le due teorie (ovvero, la direzione dei cambiamenti metabolici) deve ancora essere testata. Qui, forniamo tale analisi.
Una delle caratteristiche più significative dei metaboliti specifici delle piante è la loro estrema diversità strutturale a tutti i livelli, dalle singole piante, alle popolazioni, fino a specie simili (20). Molti cambiamenti quantitativi nei metaboliti specializzati possono essere osservati a livello di popolazione, mentre forti differenze qualitative sono solitamente mantenute a livello di specie (20). Pertanto, la diversità metabolica delle piante è l'aspetto principale della diversità funzionale, riflettendo l'adattabilità a diverse nicchie, in particolare quelle con diverse possibilità di invasione da parte di insetti specifici ed erbivori comuni (21). A partire dall'articolo rivoluzionario di Fraenkel (22) sulle ragioni dell'esistenza dei metaboliti specifici delle piante, le interazioni con vari insetti sono state considerate importanti pressioni selettive e si ritiene che queste interazioni abbiano plasmato le piante durante l'evoluzione. Percorso metabolico (23). Le differenze interspecie nella diversità dei metaboliti specializzati possono anche riflettere l'equilibrio fisiologico associato alla difesa costitutiva e inducibile delle piante contro le strategie erbivore, poiché le due specie sono spesso correlate negativamente tra loro (24). Sebbene possa essere utile mantenere una buona difesa in ogni momento, i cambiamenti metabolici tempestivi associati alla difesa forniscono chiari benefici consentendo alle piante di allocare risorse preziose ad altri investimenti fisiologici (19, 24) ed evitare la necessità di simbiosi. Danni collaterali (25). Inoltre, queste riorganizzazioni di metaboliti specializzati causate dagli insetti erbivori possono portare a una distribuzione distruttiva nella popolazione (26) e possono riflettere letture dirette di sostanziali cambiamenti naturali nel segnale dell'acido jasmonico (JA), che possono essere mantenuti nella popolazione. Segnali JA alti e bassi sono compromessi tra la difesa contro gli erbivori e la competizione con specie specifiche (27). Inoltre, i percorsi biosintetici dei metaboliti specializzati subiranno una rapida perdita e trasformazione durante l'evoluzione, con conseguente distribuzione metabolica disomogenea tra specie strettamente correlate (28). Questi polimorfismi possono essere rapidamente stabiliti in risposta ai mutevoli modelli erbivori (29), il che significa che la fluttuazione delle comunità erbivore è un fattore chiave che guida l'eterogeneità metabolica.
Qui, abbiamo risolto specificamente i seguenti problemi. (I) In che modo l'insetto erbivoro riconfigura il metaboloma della pianta? (Ii) Quali sono le principali componenti informative della plasticità metabolica che possono essere quantificate per testare le previsioni della teoria della difesa a lungo termine? (Iii) Se riprogrammare il metaboloma della pianta in un modo unico per l'aggressore, in tal caso, quale ruolo gioca l'ormone vegetale nel personalizzare una specifica risposta metabolica e quali metaboliti contribuiscono alla specificità di specie della difesa? (Iv) Poiché le previsioni fatte da molte teorie di difesa possono essere estese a tutti i livelli dei tessuti biologici, ci siamo chiesti quanto sia coerente la risposta metabolica causata dal confronto interno al confronto interspecie? A tal fine, abbiamo studiato sistematicamente il metaboloma fogliare della nicotina del tabacco, che è una pianta modello ecologica con un ricco metabolismo specializzato ed è efficace contro le larve di due erbivori nativi, i Lepidotteri Datura (Ms) (molto aggressivi, principalmente mangiati). Su Solanaceae e Spodoptera littoralis (Sl), i bruchi delle foglie del cotone sono una sorta di "genere", con le piante ospiti di Solanaceae e altri ospiti di altri generi e famiglie di piante alimentari. Abbiamo analizzato lo spettro metabolomico MS/MS ed estratto i descrittori statistici della teoria dell'informazione per confrontare le teorie OD e MT. Abbiamo creato mappe di specificità per rivelare l'identità dei metaboliti chiave. L'analisi è stata estesa alla popolazione nativa di N. nasi e specie di tabacco strettamente correlate per analizzare ulteriormente la covarianza tra la segnalazione degli ormoni vegetali e l'induzione di OD.
Al fine di acquisire una mappa complessiva sulla plasticità e la struttura del metaboloma fogliare del tabacco erbivoro, abbiamo utilizzato un flusso di lavoro di analisi e calcolo precedentemente sviluppato per raccogliere e deconvoluzionare in modo completo spettri MS/MS indipendenti dai dati ad alta risoluzione da estratti vegetali (9). Questo metodo indifferenziato (chiamato MS/MS) può costruire spettri di composti non ridondanti, che possono quindi essere utilizzati per tutte le analisi a livello di composto qui descritte. Questi metaboliti vegetali deconvoluti sono di vario tipo, costituiti da centinaia a migliaia di metaboliti (circa 500-1000 s/MS/MS in questo caso). Qui, consideriamo la plasticità metabolica nel quadro della teoria dell'informazione e quantifichiamo la diversità e la professionalità del metaboloma sulla base dell'entropia di Shannon della distribuzione di frequenza metabolica. Utilizzando la formula precedentemente implementata (8), abbiamo calcolato un insieme di indicatori che possono essere utilizzati per quantificare la diversità del metaboloma (indicatore Hj), la specializzazione del profilo metabolico (indicatore δj) e la specificità metabolica di un singolo metabolita (indicatore Si). Inoltre, abbiamo applicato l'indice di plasticità a distanza relativa (RDPI) per quantificare l'inducibilità del metaboloma degli erbivori (Figura 1A) (30). All'interno di questo quadro statistico, trattiamo lo spettro MS/MS come unità di informazione di base ed elaboriamo l'abbondanza relativa di MS/MS in una mappa di distribuzione di frequenza, quindi utilizziamo l'entropia di Shannon per stimare la diversità del metaboloma da essa. La specializzazione del metaboloma è misurata dalla specificità media di un singolo spettro MS/MS. Pertanto, l'aumento dell'abbondanza di alcune classi MS/MS dopo l'induzione degli erbivori viene trasformato in inducibilità spettrale, RDPI e specializzazione, ovvero l'aumento dell'indice δj, poiché vengono prodotti metaboliti più specializzati e un elevato indice Si. L'abbassamento dell'indice di diversità Hj riflette che il numero di MS/MS generati è ridotto o che la distribuzione di frequenza del profilo cambia in una direzione meno uniforme, riducendone al contempo l'incertezza complessiva. Attraverso il calcolo dell'indice Si è possibile evidenziare quali MS/MS sono indotti da determinati erbivori, al contrario, quali MS/MS non rispondono all'induzione, il che è un indicatore chiave per distinguere la previsione di MT e OD.
(A) Descrittori statistici utilizzati per l'inducibilità dei dati MS/MS (RDPI) degli erbivori (da H1 a Hx), la diversità (indice Hj), la specializzazione (indice δj) e la specificità dei metaboliti (indice Si). Un aumento del grado di specializzazione (δj) indica che, in media, verranno prodotti più metaboliti specifici degli erbivori, mentre una diminuzione della diversità (Hj) indica una diminuzione nella produzione di metaboliti o una distribuzione non uniforme dei metaboliti nella mappa di distribuzione. Il valore Si valuta se il metabolita è specifico per una data condizione (in questo caso, erbivoro) o, al contrario, mantenuto allo stesso livello. (B) Diagramma concettuale della previsione della teoria della difesa utilizzando l'asse della teoria dell'informazione. La teoria OD prevede che l'attacco degli erbivori aumenterà i metaboliti di difesa, aumentando così δj. Allo stesso tempo, Hj diminuisce perché il profilo viene riorganizzato verso la ridotta incertezza delle informazioni metaboliche. La teoria MT prevede che l'attacco degli erbivori causerà cambiamenti non direzionali nel metaboloma, aumentando così Hj come indicatore di una maggiore incertezza delle informazioni metaboliche e causando una distribuzione casuale di Si. Abbiamo anche proposto un modello misto, il miglior MT, in cui alcuni metaboliti con valori difensivi più elevati saranno particolarmente aumentati (alto valore di Si), mentre altri mostreranno risposte casuali (basso valore di Si).
Utilizzando descrittori della teoria dell'informazione, interpretiamo la teoria OD per prevedere che i cambiamenti metabolici speciali indotti dagli erbivori in uno stato costitutivo non indotto porteranno a (i) un aumento della specificità metabolica (indice Si) che guida la specificità metabonomica (indice δj), l'aumento di) alcuni gruppi di metaboliti speciali con maggiore valore di difesa, e (ii) la diminuzione della diversità del metaboloma (indice Hj) dovuta al cambiamento della distribuzione della frequenza metabolica verso una maggiore distribuzione dei corpi di leptina. A livello di un singolo metabolita, ci si aspetta una distribuzione ordinata di Si, dove il metabolita aumenterà il valore di Si in base al suo valore di difesa (Figura 1B). In questa linea, spieghiamo la teoria MT per prevedere che l'eccitazione porterà a (i) cambiamenti non direzionali nei metaboliti che si tradurranno in una diminuzione dell'indice δj, e (ii) un aumento dell'indice Hj dovuto a un aumento dell'incertezza metabolica. O casualità, che può essere quantificata dall'entropia di Shannon sotto forma di diversità generalizzata. Per quanto riguarda la composizione metabolica, la teoria MT prevede la distribuzione casuale di Si. Tenendo conto che alcuni metaboliti si trovano in condizioni specifiche, mentre altri non si trovano in condizioni specifiche, e che il loro valore di difesa dipende dall'ambiente, abbiamo anche proposto un modello di difesa misto, in cui δj e Hj sono distribuiti in due lungo Si. Aumentando in tutte le direzioni, solo alcuni gruppi di metaboliti, che hanno valori di difesa più elevati, aumenteranno in modo particolare Si, mentre altri avranno una distribuzione casuale (Figura 1B).
Per testare la previsione della teoria della difesa ridefinita sull'asse del descrittore della teoria dell'informazione, abbiamo allevato larve di erbivori esperti (Ms) o generalisti (Sl) sulle foglie di Nepenthes pallens (Figura 2A). Utilizzando l'analisi MS/MS, abbiamo recuperato 599 spettri MS/MS non ridondanti (file di dati S1) da estratti di metanolo di tessuto fogliare raccolti dopo l'alimentazione del bruco. L'utilizzo degli indici RDPI, Hj e δj per visualizzare la riconfigurazione del contenuto informativo nei file di configurazione MS/MS rivela modelli interessanti (Figura 2B). La tendenza generale è che, come descritto dal descrittore dell'informazione, man mano che i bruchi continuano a mangiare foglie, il grado di riorganizzazione metabolica aumenta nel tempo: 72 ore dopo l'alimentazione dell'erbivoro, l'RDPI aumenta significativamente. Rispetto al controllo non danneggiato, Hj era significativamente ridotto, il che era dovuto al maggiore grado di specializzazione del profilo metabolico, quantificato dall'indice δj. Questa apparente tendenza è coerente con le previsioni della teoria OD, ma è incoerente con le principali previsioni della teoria MT, che ritiene che i cambiamenti casuali (non direzionali) nei livelli di metaboliti siano utilizzati come camuffamento difensivo (Figura 1B). Sebbene il contenuto di elicitori della secrezione orale (OS) e il comportamento alimentare di questi due erbivori siano diversi, la loro alimentazione diretta ha prodotto cambiamenti simili nelle direzioni di Hj e δj durante i periodi di raccolta di 24 e 72 ore. L'unica differenza si è verificata a 72 ore di RDPI. Rispetto a quello causato dall'alimentazione con Ms, il metabolismo complessivo indotto dall'alimentazione con Sl era più elevato.
(A) Disegno sperimentale: suini comuni (S1) o erbivori esperti (Ms) vengono alimentati con foglie desalinizzate di piante carnivore, mentre per l'erbivoria simulata, l'OS di Ms (W + OSM) viene utilizzato per gestire la puntura di ferite con posizioni fogliari standardizzate. Larve S1 (W + OSSl) o acqua (W + W). Il controllo (C) è una foglia non danneggiata. (B) Indici di inducibilità (RDPI confrontato con la carta di controllo), diversità (indice Hj) e specializzazione (indice δj) calcolati per la mappa dei metaboliti speciali (599 MS/MS; file di dati S1). Gli asterischi indicano differenze significative tra l'alimentazione diretta dell'erbivoro e il gruppo di controllo (test t di Student con test t per dati appaiati, *P<0,05 e ***P<0,001). ns, non importante. (C) Indice di risoluzione temporale dello spettro del metabolita principale (riquadro blu, amminoacido, acido organico e zucchero; file di dati S2) e di quello speciale (riquadro rosso 443 MS/MS; file di dati S1) dopo il trattamento simulato con erbivori. La banda colorata si riferisce all'intervallo di confidenza del 95%. L'asterisco indica la differenza significativa tra il trattamento e il controllo [analisi quadratica della varianza (ANOVA), seguita dalla differenza onestamente significativa di Tukey (HSD) per confronti multipli post hoc, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001]. (D) Specializzazione dei grafici di dispersione e dei profili dei metaboliti speciali (campioni ripetuti con trattamenti diversi).
Per verificare se il rimodellamento indotto dagli erbivori a livello del metaboloma si rifletta nei cambiamenti nei livelli dei singoli metaboliti, ci siamo inizialmente concentrati sui metaboliti precedentemente studiati nelle foglie di Nepenthes pallens con comprovata resistenza agli erbivori. Le ammidi fenoliche sono coniugati idrossicinnamamide-poliammina che si accumulano durante il processo di erbivoria degli insetti e sono noti per ridurre le prestazioni degli insetti (32). Abbiamo ricercato i precursori del corrispondente MS/MS e tracciato le loro curve cinetiche cumulative (Figura S1). Non sorprende che i derivati ​​fenolici che non sono direttamente coinvolti nella difesa contro gli erbivori, come l'acido clorogenico (CGA) e la rutina, siano sottoregolati dopo l'erbivoria. Al contrario, gli erbivori possono rendere le ammidi fenoliche altamente potenti. L'alimentazione continua dei due erbivori ha prodotto uno spettro di eccitazione delle fenolammidi pressoché identico, e questo schema è risultato particolarmente evidente per la sintesi de novo delle fenolammidi. Lo stesso fenomeno sarà osservato esplorando il pathway dei glicosidi diterpenici 17-idrossigeranil nonanediolo (17-HGL-DTG), che produce un gran numero di diterpeni aciclici con efficaci funzioni anti-erbivore (33), di cui l'alimentazione con Sl ha innescato un profilo di espressione simile (Figura S1).
Il possibile svantaggio degli esperimenti di alimentazione diretta degli erbivori è la differenza nel tasso di consumo delle foglie e nel tempo di alimentazione degli erbivori, che rende difficile eliminare gli effetti specifici degli erbivori causati da ferite ed erbivori. Per risolvere meglio la specificità della specie erbivora nella risposta metabolica fogliare indotta, abbiamo simulato l'alimentazione di larve di Ms e Sl applicando immediatamente l'OS appena raccolto (OSM e OSS1) alla puntura standard W di posizioni fogliari costanti. Questa procedura è chiamata trattamento W + OS e standardizza l'induzione temporizzando con precisione l'inizio della risposta suscitata dall'erbivoro senza causare effetti confondenti dovuti a differenze nel tasso o nella quantità di perdita di tessuto (Figura 2A) (34). Utilizzando la pipeline di analisi e calcolo MS/MS, abbiamo recuperato 443 spettri MS/MS (file di dati S1), che si sovrapponevano agli spettri precedentemente assemblati da esperimenti di alimentazione diretta. L'analisi della teoria dell'informazione di questo set di dati MS/MS ha mostrato che la riprogrammazione dei metabolomi specializzati a livello fogliare mediante la simulazione di erbivori ha mostrato induzioni specifiche per OS (Figura 2C). In particolare, rispetto al trattamento con OSS1, OSM ha causato un miglioramento della specializzazione del metaboloma a 4 ore. Vale la pena notare che, rispetto al set di dati sperimentali di alimentazione diretta con erbivori, la cinetica metabolica visualizzata nello spazio bidimensionale utilizzando Hj e δj come coordinate e la direzionalità della specializzazione del metaboloma in risposta al trattamento con erbivori simulati nel tempo aumentano in modo coerente (Figura 2D). Allo stesso tempo, abbiamo quantificato il contenuto di amminoacidi, acidi organici e zuccheri (file di dati S2) per indagare se questo aumento mirato della competenza del metaboloma sia dovuto alla riconfigurazione del metabolismo centrale del carbonio in risposta agli erbivori simulati (Figura S2). Per spiegare meglio questo modello, abbiamo ulteriormente monitorato la cinetica di accumulo metabolico delle vie fenolamide e 17-HGL-DTG precedentemente discusse. L'induzione specifica di OS negli erbivori si trasforma in un pattern di riarrangiamento differenziale all'interno del metabolismo della fenolamide (Figura S3). Le ammidi fenoliche contenenti gruppi cumarina e caffeoilici sono indotte preferenzialmente da OSS1, mentre gli OSM innescano un'induzione specifica di coniugati ferulilici. Per la via 17-HGL-DTG, è stata rilevata un'induzione differenziale di OS da parte di prodotti di malonilazione e dimalonilazione a valle (Figura S3).
Successivamente, abbiamo studiato la plasticità del trascrittoma indotta da OS utilizzando il set di dati del microarray time-course, che simula l'uso di OSM per trattare le foglie della pianta rosetta negli erbivori. La cinetica di campionamento si sovrappone sostanzialmente alla cinetica utilizzata in questo studio metabolomico (35). Rispetto alla riconfigurazione del metaboloma in cui la plasticità metabolica è particolarmente aumentata nel tempo, osserviamo picchi di trascrizione transitori nelle foglie indotte da Ms, dove l'inducibilità del trascrittoma (RDPI) e la specializzazione (δj) sono a 1. C'è stato un aumento significativo in ore e diversità (Hj) a questo punto temporale, l'espressione di BMP1 è stata significativamente ridotta, seguita dal rilassamento della specializzazione del trascrittoma (Figura S4). Le famiglie di geni metabolici (come P450, glicosiltransferasi e BAHD aciltransferasi) partecipano al processo di assemblaggio di metaboliti speciali da unità strutturali derivate dal metabolismo primario, seguendo il modello di alta specializzazione precoce sopra menzionato. Come caso di studio, è stata analizzata la via della fenilalanina. L'analisi ha confermato che i geni chiave nel metabolismo della fenolamide sono altamente indotti da OS negli erbivori rispetto alle piante non attratte, e presentano un pattern di espressione strettamente allineato. Il fattore di trascrizione MYB8 e i geni strutturali PAL1, PAL2, C4H e 4CL a monte di questa via hanno mostrato un inizio precoce della trascrizione. Le aciltransferasi che svolgono un ruolo nell'assemblaggio finale della fenolamide, come AT1, DH29 e CV86, mostrano un pattern di upregulation prolungato (Figura S4). Le osservazioni di cui sopra indicano che l'inizio precoce della specializzazione del trascrittoma e il successivo potenziamento della specializzazione metabolomica sono una modalità accoppiata, che potrebbe essere dovuta al sistema di regolazione sincrono che avvia una potente risposta di difesa.
La riconfigurazione nella segnalazione degli ormoni vegetali agisce come un livello regolatore che integra le informazioni erbivore per riprogrammare la fisiologia delle piante. Dopo la simulazione erbivora, abbiamo misurato la dinamica cumulativa delle principali categorie di ormoni vegetali e visualizzato la coespressione temporale tra di esse [coefficiente di correlazione di Pearson (PCC)> 0,4] (Figura 3A). Come previsto, gli ormoni vegetali correlati alla biosintesi sono collegati all'interno della rete di coespressione degli ormoni vegetali. Inoltre, la specificità metabolica (indice Si) è mappata su questa rete per evidenziare gli ormoni vegetali indotti da diversi trattamenti. Sono state individuate due aree principali di risposta specifica erbivora: una è nel cluster JA, dove JA (la sua forma biologicamente attiva JA-Ile) e altri derivati ​​JA mostrano il punteggio Si più alto; l'altra è l'etilene (ET). La gibberellina ha mostrato solo un moderato aumento della specificità erbivora, mentre altri ormoni vegetali, come citochinina, auxina e acido abscissico, hanno mostrato una bassa specificità di induzione per gli erbivori. Rispetto all'utilizzo del solo W + W, l'amplificazione del valore di picco dei derivati ​​di JA attraverso l'applicazione di OS (W + OS) può sostanzialmente essere trasformata in un forte indicatore specifico di JA. Inaspettatamente, è noto che OSM e OSS1 con diverso contenuto di elicitori causano un accumulo simile di JA e JA-Ile. A differenza di OSS1, OSM è specificamente e fortemente indotto da OSM, mentre OSS1 non amplifica la risposta delle ferite basali (Figura 3B).
(A) Analisi della rete di coespressione basata sul calcolo PCC della simulazione della cinetica di accumulo di ormoni vegetali indotta da erbivori. Il nodo rappresenta un singolo ormone vegetale e la dimensione del nodo rappresenta l'indice Si specifico dell'ormone vegetale tra i trattamenti. (B) Accumulo di JA, JA-Ile ed ET nelle foglie causato da diversi trattamenti indicati da colori diversi: albicocca, W + OSM; blu, W + OSSl; nero, W + W; grigio, C (controllo). Gli asterischi indicano differenze significative tra trattamento e controllo (ANOVA a due vie seguita da confronto multiplo post hoc Tukey HSD, *** P <0,001). Analisi della teoria dell'informazione di (C)697 MS/MS (file di dati S1) nella biosintesi di JA e spettro di percezione alterato (irAOC e irCOI1) e (D)585 MS/MS (file di dati S1) in ETR1 con segnale ET alterato. Due trattamenti simulati con erbivori hanno attivato linee vegetali e piante di controllo con veicolo vuoto (EV). Gli asterischi indicano differenze significative tra il trattamento W+OS e il controllo non danneggiato (ANOVA a due vie seguita da confronto multiplo post hoc Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). (E) Grafici sparsi di opposizione sparsa alla specializzazione. I colori rappresentano diversi ceppi geneticamente modificati; i simboli rappresentano diversi metodi di trattamento: triangolo, W + OSS1; rettangolo, W + OSM; cerchio C
Successivamente, utilizziamo un ceppo geneticamente modificato di Nepenthes attenuato (irCOI1 e sETR1) nei passaggi chiave della biosintesi di JA ed ET (irAOC e irACO) e della percezione (irCOI1 e sETR1) per analizzare il metabolismo di questi due ormoni vegetali sugli erbivori. Il contributo relativo della riprogrammazione. In linea con gli esperimenti precedenti, abbiamo confermato l'induzione di OS erbivoro nelle piante portatrici vuote (EV) (Figura 3, da C a D) e la diminuzione complessiva dell'indice Hj causata da OSM, mentre l'indice δj è aumentato. La risposta è più pronunciata rispetto alla risposta innescata da OSS1. Un grafico a due linee che utilizza Hj e δj come coordinate mostra la deregolazione specifica (Figura 3E). La tendenza più evidente è che nei ceppi privi di segnale JA, la diversità del metaboloma e i cambiamenti di specializzazione causati dagli erbivori vengono quasi completamente eliminati (Figura 3C). Al contrario, la percezione silente di ET nelle piante sETR1, sebbene l'effetto complessivo sui cambiamenti nel metabolismo erbivoro sia molto inferiore a quello della segnalazione JA, attenua la differenza negli indici Hj e δj tra le eccitazioni OSM e OSS1 (Figura 3D e Figura S5). Ciò indica che, oltre alla funzione principale della trasduzione del segnale JA, la trasduzione del segnale ET serve anche come regolazione fine della risposta metabolica specie-specifica degli erbivori. Coerentemente con questa funzione di regolazione fine, non si è verificata alcuna variazione nell'inducibilità complessiva del metaboloma nelle piante sETR1. D'altra parte, rispetto alle piante sETR1, le piante irACO hanno indotto ampiezze complessive simili di cambiamenti metabolici causati dagli erbivori, ma hanno mostrato punteggi Hj e δj significativamente diversi tra le stimolazioni OSM e OSS1 (Figura S5).
Per identificare metaboliti specializzati che contribuiscono in modo significativo alla risposta specie-specifica degli erbivori e per calibrarne la produzione attraverso i segnali ET, abbiamo utilizzato il metodo MS/MS strutturale precedentemente sviluppato. Questo metodo si basa sul metodo del bi-clustering per dedurre nuovamente la famiglia metabolica dai frammenti MS/MS [prodotto scalare normalizzato (NDP)] e dal punteggio di similarità basato sulla perdita neutra (NL). Il set di dati MS/MS costruito attraverso l'analisi delle linee transgeniche ET ha prodotto 585 MS/MS (file di dati S1), che sono stati risolti raggruppandoli in sette moduli MS/MS principali (M) (Figura 4A). Alcuni di questi moduli sono densamente popolati di metaboliti speciali precedentemente caratterizzati: ad esempio, M1, M2, M3, M4 e M7 sono ricchi di vari derivati ​​fenolici (M1), glicosidi flavonoidi (M2), zuccheri acilici (M3 e M4) e 17-HGL-DTG (M7). Inoltre, vengono calcolate le informazioni metaboliche specifiche (indice di Si) di un singolo metabolita in ciascun modulo, e la sua distribuzione di Si può essere visualizzata intuitivamente. In breve, gli spettri MS/MS che mostrano un'elevata specificità erbivora e genotipica sono caratterizzati da elevati valori di Si, e le statistiche di curtosi indicano la distribuzione della pelliccia sull'angolo destro della coda. Una tale distribuzione di colloidi magri è stata rilevata in M1, in cui la fenolammide ha mostrato la più alta frazione di Si (Figura 4B). Il 17-HGL-DTG inducibile erbivoro precedentemente menzionato in M7 ha mostrato un punteggio di Si moderato, indicando un grado moderato di regolazione differenziale tra i due tipi di OS. Al contrario, la maggior parte dei metaboliti specializzati prodotti costitutivamente, come rutina, CGA e zuccheri acilici, sono tra i punteggi di Si più bassi. Per esplorare meglio la complessità strutturale e la distribuzione di Si tra metaboliti speciali, è stata costruita una rete molecolare per ciascun modulo (Figura 4B). Un'importante previsione della teoria OD (riassunta nella Figura 1B) è che la riorganizzazione di metaboliti speciali dopo l'erbivoria dovrebbe portare a cambiamenti unidirezionali nei metaboliti con elevato valore di difesa, in particolare aumentando la loro specificità (in contrapposizione alla distribuzione casuale) Modalità) Metabolismo difensivo previsto dalla teoria MT. La maggior parte dei derivati ​​fenolici accumulati in M1 sono funzionalmente correlati al declino delle prestazioni degli insetti (32). Confrontando i valori di Si nei metaboliti M1 tra le foglie indotte e le foglie costituenti delle piante di controllo EV a 24 ore, abbiamo osservato che la specificità metabolica di molti metaboliti dopo insetti erbivori ha un trend di aumento significativo (Figura 4C). L'aumento specifico del valore di Si è stato rilevato solo nelle fenolammidi difensive, ma nessun aumento del valore di Si è stato rilevato in altri fenoli e metaboliti sconosciuti coesistenti in questo modulo. Questo è un modello specializzato, correlato alla teoria OD. Le principali previsioni dei cambiamenti metabolici causati dagli erbivori sono coerenti. Per verificare se questa particolarità dello spettro della fenolamide fosse indotta da ET specifico per OS, abbiamo tracciato l'indice di Si del metabolita e causato un valore di espressione differenziale tra OSM e OSS1 nei genotipi EV e sETR1 (Figura 4D). In sETR1, la differenza indotta dalla fenolamide tra OSM e OSS1 è stata notevolmente ridotta. Il metodo di bi-clustering è stato applicato anche ai dati MS/MS raccolti in ceppi con JA insufficiente per dedurre i principali moduli MS/MS correlati alla specializzazione metabolica regolata da JA (Figura S6).
(A) I risultati del clustering di 585 MS/MS basati sul frammento condiviso (somiglianza NDP) e sulla perdita neutra condivisa (somiglianza NL) determinano che il modulo (M) è coerente con la famiglia di composti nota, oppure con una composizione di metaboliti sconosciuta o scarsamente metabolizzata. Accanto a ciascun modulo, è mostrata la distribuzione specifica (Si) del metabolita (MS/MS). (B) Rete molecolare modulare: i nodi rappresentano MS/MS e i bordi, i punteggi MS/MS NDP (rosso) e NL (blu) (cut-off, > 0,6). L'indice di specificità del metabolita graduato (Si) è colorato in base al modulo (sinistra) e mappato sulla rete molecolare (destra). (C) Modulo M1 della pianta EV in stato costitutivo (controllo) e indotto (erbivoro simulato) a 24 ore: diagramma della rete molecolare (il valore Si è la dimensione del nodo, la fenolamide difensiva è evidenziata in blu). (D) Il diagramma della rete molecolare M1 della linea spettrale sETR1 con percezione EV ed ET alterata: il composto fenolico rappresentato dal nodo del cerchio verde e la differenza significativa (valore P) tra i trattamenti W + OSM e W + OSS1 come dimensione del nodo. CP, N-caffeoil-tirosina; CS, N-caffeoil-spermidina; FP, estere dell'acido N-ferulico-acido urico; FS, N-ferulil-spermidina; CoP, N', N “-coumarolil-tirosina; DCS, N', N”-dicaffeoil-spermidina; CFS, N', N”-caffeoil, feruloil-spermidina; Lycium barbarum in wolfberry Son; Nick. O-AS, zucchero O-acil.
Abbiamo ulteriormente esteso l'analisi da un singolo genotipo attenuato di Nepenthes a popolazioni naturali, dove forti cambiamenti intraspecifici nei livelli di JA erbivori e nei livelli di metaboliti specifici sono stati precedentemente descritti in popolazioni naturali (26). Utilizziamo questo set di dati per coprire 43 germoplasmi. Questi germoplasmi consistono in 123 specie di piante di N. pallens. Queste piante sono state prelevate da semi raccolti in diversi habitat nativi in ​​Utah, Nevada, Arizona e California (Figura S7); abbiamo calcolato la diversità del metaboloma (qui chiamata livello di popolazione, diversità β) e la specializzazione causata da OSM. In linea con studi precedenti, abbiamo osservato un'ampia gamma di cambiamenti metabolici lungo gli assi Hj e δj, indicando che i germoplasmi presentano differenze significative nella plasticità delle loro risposte metaboliche agli erbivori (Figura S7). Questa organizzazione ricorda precedenti osservazioni sulla gamma dinamica dei cambiamenti di JA causati dagli erbivori e ha mantenuto un valore molto elevato in una singola popolazione (26, 36). Utilizzando JA e JA-Ile per testare la correlazione complessiva tra Hj e δj, abbiamo scoperto che esiste una significativa correlazione positiva tra JA e l'indice di diversità e specializzazione del metaboloma β (Figura S7). Ciò suggerisce che l'eterogeneità indotta dagli erbivori nell'induzione di JA rilevata a livello di popolazione potrebbe essere dovuta a polimorfismi metabolici chiave causati dalla selezione da insetti erbivori.
Studi precedenti hanno dimostrato che i tipi di tabacco differiscono notevolmente per tipologia e relativa dipendenza dalle difese metaboliche indotte e costitutive. Si ritiene che questi cambiamenti nella trasduzione del segnale anti-erbivoro e nelle capacità di difesa siano regolati dalla pressione della popolazione di insetti, dal ciclo vitale della pianta e dai costi di produzione della difesa nella nicchia in cui cresce una data specie. Abbiamo studiato la coerenza del rimodellamento del metaboloma fogliare indotto dagli erbivori di sei specie di Nicotiana native del Nord America e del Sud America. Queste specie sono strettamente correlate a Nepenthes Nord America, ovvero Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. erba attenuata, Nicotiana tabacum, tabacco lineare, tabacco (Nicotiana spegazzinii) e tabacco da foglia (Nicotiana obtusifolia) (Figura 5A) (37). Sei di queste specie, tra cui la specie ben caratterizzata N. please, sono piante annuali del clade petunia, e obtusifolia N. sono piante perenni del clade gemello Trigonophyllae (38). Successivamente, l'induzione W + W, W + OSM e W + OSS1 è stata eseguita su queste sette specie per studiare il riarrangiamento metabolico a livello di specie dell'alimentazione degli insetti.
(A) Un albero filogenetico bootstrap basato sulla massima verosimiglianza [per la sintesi nucleare di glutammina (38)] e sulla distribuzione geografica di sette specie di Nicotiana strettamente correlate (colori diversi) (37). (B) Un diagramma di dispersione della diversità specializzata per i profili metabolici di sette specie di Nicotiana (939 MS/MS; file di dati S1). A livello di specie, la diversità del metaboloma è negativamente correlata al grado di specializzazione. L'analisi della correlazione a livello di specie tra diversità metabolica e specializzazione e accumulo di JA è mostrata nella Figura 2. S9. Colore, diversi tipi; triangolo, W + OSS1; rettangolo, W + OSM; (C) Le dinamiche di JA e JA-Ile di Nicotiana sono classificate in base all'ampiezza di eccitazione di OS (ANOVA a due vie e confronto multiplo post-Tukey HSD, * P <0,05, ** P <0,01 e * ** Per il confronto di W + OS e W + W, P <0,001). Box plot della diversità (D) e della specializzazione (E) di ciascuna specie dopo la simulazione di JA erbivoro e metilico (MeJA). L'asterisco indica la differenza significativa tra W + OS e W + W o lanolina più W (Lan + W) o Lan più MeJA (Lan + MeJa) e controllo Lan (analisi della varianza a due vie, seguita dal confronto multiplo post hoc HSD di Tukey, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001).
Utilizzando il metodo del doppio cluster, abbiamo identificato 9 moduli di 939 MS/MS (file di dati S1). La composizione di MS/MS riconfigurata da diversi trattamenti varia notevolmente tra i diversi moduli e tra le specie (Figura S8). La visualizzazione di Hj (qui definita diversità gamma a livello di specie) e δj rivela che specie diverse si aggregano in gruppi molto diversi nello spazio metabolico, dove la divisione a livello di specie è solitamente più evidente dell'eccitazione. Ad eccezione di N. linear e N. obliquus, esse mostrano un'ampia gamma dinamica di effetti di induzione (Figura 5B). Al contrario, specie come N. purpurea e N. obtusifolia presentano una risposta metabolica al trattamento meno evidente, ma il metaboloma è più diversificato. La distribuzione specie-specifica della risposta metabolica indotta ha determinato una significativa correlazione negativa tra specializzazione e diversità gamma (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Le variazioni nei livelli di JA indotte da OS sono correlate positivamente con la specializzazione del metaboloma e negativamente con la diversità metabolica gamma esibita da ciascuna specie (Figura 5B e Figura S9). Vale la pena notare che le specie colloquialmente denominate "risposta al segnale" nella Figura 5C, come Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute e Nepenthes attenuated, hanno causato segni significativi a 30 minuti. Le recenti epidemie di JA e JA-Ile specifiche per OS, mentre altri batteri definiti "non responsivi al segnale", come Nepenthes mills, Nepenthes powdery e N. obtusifolia, mostrano solo l'induzione di JA-Ile Edge senza alcuna specificità per OS (Figura 5C). A livello metabolico, come accennato in precedenza, per Nepenthes attenuate, le sostanze responsive al segnale hanno mostrato specificità per OS e hanno aumentato significativamente δj, riducendo al contempo Hj. Questo effetto di priming specifico dell'OS non è stato rilevato nelle specie classificate come specie non reattive al segnale (Figura 5, D ed E). I metaboliti specifici dell'OS sono condivisi più frequentemente tra le specie sensibili al segnale e questi cluster di segnali si raggruppano con specie con risposte al segnale più deboli, mentre le specie con risposte al segnale più deboli mostrano una minore interdipendenza (Figura S8). Questo risultato indica che l'induzione specifica dell'OS di JA e la riconfigurazione specifica dell'OS del metaboloma a valle sono accoppiate a livello di specie.
Successivamente, abbiamo utilizzato una pasta di lanolina contenente metil JA (MeJA) per trattare le piante, per verificare se queste modalità di accoppiamento siano limitate dalla disponibilità di JA applicata da JA esogena, che sarà presente nel citoplasma delle piante. La deesterificazione rapida è JA. Abbiamo riscontrato la stessa tendenza del graduale cambiamento da specie sensibili al segnale a specie non sensibili al segnale, causato dalla fornitura continua di JA (Figura 5, D ed E). In breve, il trattamento con MeJA ha fortemente riprogrammato i metabolomi di nematodi lineari, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens e N. mikimotoi, con conseguente aumento significativo di δj e una diminuzione di Hj. N. purpurea ha mostrato solo un aumento di δj, ma non di Hj. N. obtusifolia, che in precedenza ha dimostrato di accumulare livelli estremamente bassi di JA, risponde scarsamente al trattamento con MeJA in termini di riconfigurazione del metaboloma. Questi risultati indicano che la produzione di JA o la trasduzione del segnale è fisiologicamente limitata nelle specie non reattive al segnale. Per verificare questa ipotesi, abbiamo studiato le quattro specie (N. pallens, N. mills, N. pink e N. microphylla) indotte da W + W, W + OSM e W + trascrittoma OSS1 (39). Coerentemente con il modello di rimodellamento del metaboloma, le specie sono ben separate nello spazio del trascrittoma, tra cui N. attenuata ha mostrato il più alto RDPI indotto da OS, mentre N. gracilis ha avuto il più basso (Figura 6A). Tuttavia, è stato riscontrato che la diversità del trascrittoma indotta da N. oblonga era la più bassa tra le quattro specie, contrariamente alla più alta diversità metabonomica di N. oblonga precedentemente mostrata in sette specie. Studi precedenti hanno dimostrato che un insieme di geni correlati ai segnali di difesa precoci, inclusi i segnali JA, spiega la specificità delle risposte di difesa precoci indotte da elicitori correlati agli erbivori nelle specie di Nicotiana (39). Confrontando le vie di segnalazione di JA tra queste quattro specie, è emerso un modello interessante (Figura 6B). La maggior parte dei geni coinvolti in questa via, come AOC, OPR3, ACX e COI1, ha mostrato livelli di induzione relativamente elevati in queste quattro specie. Tuttavia, un gene chiave, JAR4, converte JA nella sua forma biologicamente attiva di trascritti accumulati da JA-Ile, e il suo livello di trascrizione è molto basso, soprattutto in N. mills, Nepenthes pieris e N. microphylla. Inoltre, solo il trascritto di un altro gene, AOS, non è stato rilevato in N. bifidum. Questi cambiamenti nell'espressione genica potrebbero essere responsabili dei fenotipi estremi indotti dalla bassa produzione di JA nelle specie anergiche del segnale e dell'induzione in N. gracilis.
(A) Analisi della teoria dell'informazione della riprogrammazione delle risposte trascrizionali precoci di quattro specie di tabacco strettamente correlate, campionate 30 minuti dopo l'induzione erbivora. L'RDPI viene calcolato confrontando le foglie indotte dall'esofago erbivoro con il controllo della ferita. I colori indicano specie diverse e i simboli indicano diversi metodi di trattamento. (B) Analisi dell'espressione genica nelle vie di segnalazione JA tra quattro specie. Il percorso JA semplificato è mostrato accanto al box plot. Colori diversi indicano diversi metodi di elaborazione. L'asterisco indica che esiste una differenza significativa tra il trattamento W + OS e il controllo W + W (per il test t di Student per differenze a coppie, *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001). OPDA, acido 12-ossofitodienoico; OPC-8: acido 0,3-osso-2(2′(Z)-pentenil)-ciclopentano-1-ottanoico.
Nell'ultima parte, abbiamo studiato come il rimodellamento specifico del metaboloma di diverse specie vegetali, specie di insetto, possa essere resistente agli erbivori. Ricerche precedenti hanno evidenziato il genere Nicotiana. La loro resistenza a Ms e larve differisce notevolmente (40). Qui, abbiamo studiato la connessione tra questo modello e la loro plasticità metabolica. Utilizzando le quattro specie di tabacco sopra menzionate e testando la correlazione tra la diversità e la specializzazione del metaboloma causate dagli erbivori e la resistenza delle piante a Ms e Sl, abbiamo riscontrato che la resistenza, la diversità e la specializzazione al generalista Sl sono tutte correlate positivamente, mentre la correlazione tra la resistenza alle donne esperte e la specializzazione è debole e la correlazione con la diversità non è significativa (Figura S10). Per quanto riguarda la resistenza a S1, sia la N. chinensis attenuata che la N. gracilis, che in precedenza avevano dimostrato di esibire sia livelli di trasduzione del segnale JA che plasticità del metaboloma, hanno avuto risposte molto diverse all'induzione da parte degli erbivori e hanno anche mostrato un'elevata resistenza simile. Sesso.
Negli ultimi sessant'anni, la teoria della difesa delle piante ha fornito un quadro teorico, sulla base del quale i ricercatori hanno previsto un numero considerevole di evoluzioni e funzioni dei metaboliti specializzati delle piante. La maggior parte di queste teorie non segue la normale procedura di inferenze forti (41). Propongono previsioni chiave (3) allo stesso livello di analisi. Quando la verifica delle previsioni chiave consente di analizzare teorie specifiche, ciò renderà il campo di ricerca in continua evoluzione. Essere supportati, ma rifiutare gli altri (42). Invece, la nuova teoria fa previsioni a diversi livelli di analisi e aggiunge un nuovo livello di considerazioni descrittive (42). Tuttavia, le due teorie proposte a livello funzionale, MT e OD, possono essere facilmente spiegate come importanti previsioni di cambiamenti metabolici specializzati causati dagli erbivori: la teoria OD ritiene che i cambiamenti nello "spazio" metabolico specializzato siano altamente direzionali. La teoria MT ritiene che questi cambiamenti saranno non direzionali e localizzati casualmente nello spazio metabolico e tendono ad avere metaboliti ad alto valore di difesa. Precedenti esami delle previsioni di OD e MT sono stati testati utilizzando un ristretto insieme di composti "difensivi" a priori. Questi test incentrati sui metaboliti precludono la possibilità di analizzare l'entità e la traiettoria della riconfigurazione del metaboloma durante l'erbivoria e non consentono di testare, all'interno di un quadro statistico coerente, la necessità di previsioni chiave che possano essere considerate nel loro complesso. Quantificare i cambiamenti nel metaboloma vegetale. Qui, abbiamo utilizzato l'innovativa tecnologia della metabolomica basata sulla MS computazionale e abbiamo eseguito l'analisi MS di deconvoluzione nell'ambito generale dei descrittori della teoria dell'informazione per testare la distinzione tra i due proposti a livello di metabolomica globale. La previsione chiave di questa teoria. La teoria dell'informazione è stata applicata in molti campi, soprattutto nel contesto della ricerca sulla biodiversità e sul flusso di nutrienti (43). Tuttavia, per quanto ne sappiamo, questa è la prima applicazione utilizzata per descrivere lo spazio informativo metabolico delle piante e risolvere problemi ecologici legati ai cambiamenti metabolici temporanei in risposta a stimoli ambientali. In particolare, la capacità di questo metodo risiede nella sua capacità di confrontare modelli all'interno e tra specie vegetali per esaminare come gli erbivori si sono evoluti da specie diverse a modelli macroevolutivi interspecie a diversi livelli di evoluzione. Metabolismo.
L'analisi delle componenti principali (PCA) converte un set di dati multivariato in uno spazio di riduzione della dimensionalità in modo da poter spiegare la tendenza principale dei dati, quindi viene solitamente utilizzata come tecnica esplorativa per analizzare il set di dati, come il metaboloma di deconvoluzione. Tuttavia, la riduzione della dimensionalità perderà parte del contenuto informativo nel set di dati e la PCA non può fornire informazioni quantitative su caratteristiche particolarmente rilevanti per la teoria ecologica, come: come gli erbivori riconfigurano la diversità in campi specializzati (ad esempio, ricchezza, distribuzione e abbondanza) dei metaboliti? Quali metaboliti sono predittori dello stato indotto di un dato erbivoro? Dal punto di vista della specificità, della diversità e dell'inducibilità, il contenuto informativo del profilo metabolico specifico della foglia viene scomposto e si scopre che l'alimentazione degli erbivori può attivare un metabolismo specifico. Inaspettatamente, abbiamo osservato che, come descritto negli indicatori di teoria dell'informazione implementati, la situazione metabolica risultante presenta una grande sovrapposizione dopo gli attacchi dei due erbivori (il generalista Sl alimentato di notte) e l'esperta di Solanacee Ms. Sebbene il loro comportamento alimentare e la concentrazione siano significativamente diversi. Iniziatore del coniugato acido grasso-amminoacido (FAC) in OS (31). Utilizzando l'OS erbivoro per trattare ferite da puntura standardizzate, anche il trattamento simulato con erbivori ha mostrato una tendenza simile. Questa procedura standardizzata per simulare la risposta delle piante agli attacchi degli erbivori elimina i fattori confondenti causati dai cambiamenti nel comportamento alimentare degli erbivori, che portano a vari gradi di danno in momenti diversi (34). Il FAC, che è noto per essere la causa principale dell'OSM, riduce la risposta di JAS e di altri ormoni vegetali in OSS1, mentre OSS1 riduce centinaia di volte (31). Tuttavia, OSS1 ha causato livelli simili di accumulo di JA rispetto all'OSM. È stato precedentemente dimostrato che la risposta JA nelle Nepenthes attenuate è molto sensibile all'OSM, dove la FAC può mantenere la sua attività anche se diluita 1:1000 con acqua (44). Pertanto, rispetto all'OSM, sebbene la FAC in OSS1 sia molto bassa, è sufficiente a indurre un'adeguata incidenza di JA. Studi precedenti hanno dimostrato che proteine ​​simili alle porine (45) e oligosaccaridi (46) possono essere utilizzati come indizi molecolari per innescare le risposte di difesa delle piante in OSS1. Tuttavia, non è ancora chiaro se questi elicitori in OSS1 siano responsabili dell'accumulo di JA osservato nello studio attuale.
Sebbene vi siano pochi studi che descrivono le impronte metaboliche differenziali causate dall'applicazione di diversi erbivori o di JA o SA (acido salicilico) esogeni (47), nessuno ha perturbato la perturbazione specifica della specie erbivora nella rete di piante erbacee e i suoi effetti sulle specifiche informazioni personali. L'impatto complessivo del metabolismo è studiato sistematicamente. Questa analisi ha ulteriormente confermato che la connessione della rete ormonale interna con altri ormoni vegetali diversi dai JA modella la specificità della riorganizzazione metabolica causata dagli erbivori. In particolare, abbiamo rilevato che l'ET causato da OSM era significativamente maggiore di quello causato da OSS1. Questa modalità è coerente con un maggiore contenuto di FAC in OSM, che è una condizione necessaria e sufficiente per innescare un'esplosione di ET (48). Nel contesto dell'interazione tra piante ed erbivori, la funzione di segnalazione dell'ET sulla dinamica dei metaboliti specifici delle piante è ancora sporadica e prende di mira solo un singolo gruppo di composti. Inoltre, la maggior parte degli studi ha utilizzato l'applicazione esogena di ET o dei suoi precursori o di vari inibitori per studiarne la regolazione, tra cui queste applicazioni chimiche esogene produrranno molti effetti collaterali aspecifici. A nostra conoscenza, questo studio rappresenta il primo esame sistematico su larga scala del ruolo di ET nell'uso di ET per produrre e percepire piante transgeniche compromesse per coordinare le dinamiche del metaboloma vegetale. L'induzione di ET specifica per erbivoro può in definitiva modulare la risposta del metaboloma. Il più significativo è la manipolazione transgenica dei geni di biosintesi di ET (ACO) e percezione (ETR1) che ha rivelato l'accumulo de novo di fenolammidi specifico per erbivoro. È stato precedentemente dimostrato che ET può regolare finemente l'accumulo di nicotina indotto da JA regolando la putrescina N-metiltransferasi (49). Tuttavia, da un punto di vista meccanico, non è chiaro come ET regoli finemente l'induzione di fenammide. Oltre alla funzione di trasduzione del segnale dell'ET, il flusso metabolico può anche essere deviato verso la S-adenosil-1-metionina per regolare l'investimento in poliamminofenolammidi. La S-adenosil-1-metionina è l'ET e un intermedio comune della via biosintetica delle poliammine. Il meccanismo attraverso il quale il segnale dell'ET regola il livello di fenolammide necessita di ulteriori studi.
Per lungo tempo, a causa dell'elevato numero di metaboliti speciali di struttura sconosciuta, l'intensa attenzione rivolta a specifiche categorie metaboliche non è stata in grado di valutare rigorosamente i cambiamenti temporali della diversità metabolica dopo le interazioni biologiche. Attualmente, sulla base dell'analisi della teoria dell'informazione, il risultato principale dell'acquisizione di spettri MS/MS basata su metaboliti imparziali è che gli erbivori che mangiano o simulano erbivori continuano a ridurre la diversità metabolica complessiva del metaboloma fogliare, aumentandone al contempo il grado di specializzazione. Questo aumento temporaneo della specificità del metaboloma causato dagli erbivori è associato a un aumento sinergico della specificità del trascrittoma. La caratteristica che contribuisce maggiormente a questa maggiore specializzazione del metaboloma (avente un valore di Si più elevato) è il metabolita speciale con la funzione erbivora precedentemente caratterizzata. Questo modello è coerente con la previsione della teoria OD, ma la previsione di MT relativa alla casualità della riprogrammazione del metaboloma non è coerente. Tuttavia, questi dati sono anche coerenti con la previsione del modello misto (miglior MT; Figura 1B), perché altri metaboliti non caratterizzati con funzioni di difesa sconosciute potrebbero comunque seguire una distribuzione casuale di Si.
Un modello degno di nota ulteriormente catturato da questa ricerca è che dal livello di microevoluzione (singola pianta e popolazione di tabacco) a una scala evolutiva più ampia (specie di tabacco strettamente correlate), diversi livelli di organizzazione evolutiva sono nella "migliore difesa". Ci sono differenze significative nelle capacità degli erbivori. Moore et al. (20) e Kessler e Kalske (1) hanno proposto indipendentemente di convertire i tre livelli funzionali di biodiversità originariamente distinti da Whittaker (50) nei cambiamenti temporali costitutivi e indotti della diversità chimica; questi autori non hanno riassunto. Le procedure per la raccolta di dati sul metaboloma su larga scala non descrivono inoltre come calcolare la diversità metabolica da questi dati. In questo studio, piccoli aggiustamenti alla classificazione funzionale di Whittaker considereranno la diversità α-metabolica come la diversità degli spettri MS/MS in una data pianta e la diversità β-metabolica come il metabolismo intraspecifico di base di un gruppo di popolazioni. Spazio, e la diversità γ-metabolica sarà un'estensione dell'analisi di specie simili.
Il segnale JA è essenziale per un'ampia gamma di risposte metaboliche degli erbivori. Tuttavia, mancano rigorosi test quantitativi sul contributo della regolazione intraspecifica della biosintesi di JA alla diversità del metaboloma, e se il segnale JA sia un sito generale per la diversificazione metabolica indotta dallo stress su una scala macroevolutiva più elevata è ancora un mistero. Abbiamo osservato che la natura erbivora di Nepenthes induce la specializzazione del metaboloma e che la variazione della specializzazione del metaboloma all'interno della popolazione di specie di Nicotiana e tra specie di Nicotiana strettamente correlate è sistematicamente correlata positivamente con la segnalazione JA. Inoltre, quando il segnale JA è compromesso, la specificità metabolica indotta da un singolo genotipo erbivoro verrà annullata (Figura 3, C ed E). Poiché le variazioni dello spettro metabolico delle popolazioni di Nepenthes naturalmente attenuate sono per lo più quantitative, le variazioni nella diversità e specificità metabolica β in questa analisi potrebbero essere in gran parte causate dalla forte eccitazione di categorie di composti ricchi di metaboliti. Queste classi di composti dominano parte del profilo del metaboloma e portano a una correlazione positiva con i segnali JA.
Poiché i meccanismi biochimici delle specie di tabacco strettamente correlate sono molto diversi, i metaboliti sono specificamente identificati nell'aspetto qualitativo, quindi è più analitico. L'elaborazione del profilo metabolico acquisito da parte della teoria dell'informazione rivela che l'induzione erbivora esacerba il compromesso tra diversità e specializzazione gamma metabolica. Il segnale JA gioca un ruolo centrale in questo compromesso. L'aumento della specializzazione del metaboloma è coerente con la principale previsione di OD ed è positivamente correlato al segnale JA, mentre il segnale JA è negativamente correlato alla diversità gamma metabolica. Questi modelli indicano che la capacità di OD delle piante è determinata principalmente dalla plasticità di JA, sia su scala microevolutiva che su scala evolutiva più ampia. Esperimenti di applicazione di JA esogena che aggirano i difetti di biosintesi di JA rivelano ulteriormente che le specie di tabacco strettamente correlate possono essere distinte in specie sensibili al segnale e specie non sensibili al segnale, proprio come la loro modalità di JA e la plasticità del metaboloma indotte dagli erbivori. Le specie non reattive al segnale non possono rispondere a causa della loro incapacità di produrre JA endogena e sono quindi soggette a limitazioni fisiologiche. Ciò potrebbe essere causato da mutazioni in alcuni geni chiave nella via di segnalazione JA (AOS e JAR4 in N. crescens). Questo risultato evidenzia che questi modelli macroevolutivi interspecie potrebbero essere principalmente guidati da cambiamenti nella percezione e nella reattività ormonale interna.
Oltre all'interazione tra piante ed erbivori, l'esplorazione della diversità metabolica è correlata a tutti i più importanti progressi teorici nella ricerca sull'adattamento biologico all'ambiente e sull'evoluzione di tratti fenotipici complessi. Con l'aumento della quantità di dati acquisiti dai moderni strumenti di spettroscopia di massa (MS), i test di ipotesi sulla diversità metabolica possono ora trascendere le differenze metaboliche individuali/categoriali ed eseguire analisi globali per rivelare modelli inaspettati. Nel processo di analisi su larga scala, una metafora importante è l'idea di concepire mappe significative che possano essere utilizzate per esplorare i dati. Pertanto, un risultato importante dell'attuale combinazione di metabolomica MS/MS imparziale e teoria dell'informazione è che fornisce una metrica semplice che può essere utilizzata per costruire mappe per esplorare la diversità metabolica su diverse scale tassonomiche. È il requisito fondamentale di questo metodo. Lo studio della micro/macroevoluzione e dell'ecologia di comunità.
A livello macroevolutivo, il fulcro della teoria della coevoluzione pianta-insetto di Ehrlich e Raven (51) è prevedere che la variazione della diversità metabolica interspecie sia la causa della diversificazione delle linee vegetali. Tuttavia, nei cinquant'anni trascorsi dalla pubblicazione di questo lavoro fondamentale, questa ipotesi è stata raramente testata (52). Ciò è in gran parte dovuto alle caratteristiche filogenetiche di caratteristiche metaboliche comparabili tra linee vegetali a lunga distanza. La rarità può essere utilizzata per ancorare i metodi di analisi target. L'attuale flusso di lavoro MS/MS elaborato dalla teoria dell'informazione quantifica la similarità strutturale MS/MS di metaboliti sconosciuti (senza una precedente selezione dei metaboliti) e converte questi MS/MS in un insieme di MS/MS, quindi nel metabolismo professionale. Questi modelli macroevolutivi vengono confrontati in una scala di classificazione. Semplici indicatori statistici. Il processo è simile all'analisi filogenetica, che può utilizzare l'allineamento di sequenze per quantificare il tasso di diversificazione o l'evoluzione dei caratteri senza una precedente previsione.
A livello biochimico, l'ipotesi di screening di Firn e Jones (53) mostra che la diversità metabolica viene mantenuta a diversi livelli per fornire materie prime per esercitare le attività biologiche di metaboliti precedentemente non correlati o sostituiti. I metodi della teoria dell'informazione forniscono un quadro in cui queste transizioni evolutive specifiche dei metaboliti che si verificano durante la specializzazione dei metaboliti possono essere quantificate come parte del processo di screening evolutivo proposto: adattamento biologicamente attivo da bassa specificità ad alta specificità Metaboliti inibiti di un dato ambiente.
Nel complesso, agli albori della biologia molecolare, sono state sviluppate importanti teorie sulla difesa delle piante e i metodi deduttivi basati su ipotesi sono ampiamente considerati l'unico mezzo di progresso scientifico. Ciò è dovuto in gran parte ai limiti tecnici della misurazione dell'intero metaboloma. Sebbene i metodi basati su ipotesi siano particolarmente utili nella scelta di altri meccanismi causali, la loro capacità di far progredire la nostra comprensione delle reti biochimiche è più limitata rispetto ai metodi computazionali attualmente disponibili nella scienza contemporanea basata sull'uso intensivo di dati. Pertanto, le teorie che non possono essere previste vanno ben oltre la portata dei dati disponibili, quindi il ciclo ipotetico formula/test del progresso nel campo della ricerca non può essere abolito (4). Prevediamo che il flusso di lavoro computazionale della metabolomica qui introdotto possa riaccendere l'interesse per le questioni recenti (come) e definitive (perché) della diversità metabolica e contribuire a una nuova era di scienza dei dati guidata dalla teoria. Quest'era ha riesaminato le importanti teorie che hanno ispirato le generazioni precedenti.
L'alimentazione diretta degli erbivori viene effettuata allevando una larva di secondo stadio, o larva Sl, su una singola foglia di una pianta di rosa in fiore, con 10 repliche per pianta. Le larve dell'insetto sono state fissate con pinze e il tessuto fogliare rimanente è stato raccolto 24 e 72 ore dopo l'infezione e congelato rapidamente, e i metaboliti sono stati estratti.
Simulare il trattamento erbivoro in modo altamente sincronizzato. Il metodo consiste nell'utilizzare ruote di tessuto per forare tre file di spine su ciascun lato della nervatura centrale delle tre foglie completamente espanse della pianta durante la fase di crescita della ghirlanda di tessuto e applicare immediatamente Ms diluito 1:5. Oppure utilizzare le dita guantate per inserire S1 OS nella ferita di puntura. Raccogliere e trattare una foglia come descritto sopra. Utilizzare il metodo precedentemente descritto per estrarre metaboliti primari e ormoni vegetali (54).
Per le applicazioni di JA esogena, le tre foglie picciolate di ciascuna delle sei piante di rosa in fiore di ciascuna specie vengono trattate con 20 μl di pasta di lanolina contenente 150 μg di MeJA (Lan + MeJA) e 20 μl di lanolina più trattamento per ferite (Lan + W), oppure utilizzare 20 μl di lanolina pura come controllo. Le foglie vengono raccolte 72 ore dopo il trattamento, congelate rapidamente in azoto liquido e conservate a -80 °C fino al momento dell'uso.
Nel nostro gruppo di ricerca sono state identificate quattro linee transgeniche JA ed ET, ovvero irAOC (36), irCOI1 (55), irACO e sETR1 (48). irAOC ha mostrato una forte diminuzione dei livelli di JA e JA-Ile, mentre irCOI1 non era sensibile ai JA. Rispetto a EV, l'accumulo di JA-Ile è aumentato. Analogamente, irACO ridurrà la produzione di ET e, rispetto a EV, sETR1, che è insensibile a ET, aumenterà la produzione di ET.
Per eseguire la misurazione dell'ET in modo non invasivo, viene utilizzato uno spettrometro laser fotoacustico (sensore ET in tempo reale Sensor Sense ETD-300). Immediatamente dopo il trattamento, metà delle foglie è stata tagliata e trasferita in una fiala di vetro sigillata da 4 ml, lasciando che lo spazio di testa si accumulasse entro 5 ore. Durante la misurazione, ogni fiala è stata lavata con un flusso di 2 litri/ora di aria pura per 8 minuti, precedentemente fatta passare attraverso un catalizzatore fornito da Sensor Sense per rimuovere CO2 e acqua.
I dati del microarray sono stati originariamente pubblicati in (35) e salvati nel database completo di espressione genica del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (numero di accesso GSE30287). Per questo studio sono stati estratti i dati corrispondenti alle foglie causate dal trattamento W + OSM e al controllo non danneggiato. L'intensità grezza è log2. Prima dell'analisi statistica, la linea di base è stata convertita e normalizzata al suo 75° percentile utilizzando il pacchetto software R.
I dati originali di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) della specie Nicotiana sono stati recuperati dagli archivi NCBI Short Reading Archives (SRA), numero di progetto PRJNA301787, riportati da Zhou et al. (39) e procedono come descritto in (56). I dati grezzi elaborati da W + W, W + OSM e W + OSS1 corrispondenti alla specie Nicotiana sono stati selezionati per l'analisi in questo studio e trattati nel modo seguente: Innanzitutto, le letture grezze di RNA-seq sono state convertite in formato FASTQ. HISAT2 converte FASTQ in SAM e SAMtools converte i file SAM in file BAM ordinati. StringTie viene utilizzato per calcolare l'espressione genica e il suo metodo di espressione prevede che ci siano frammenti per mille frammenti di base per milione di frammenti di trascrizione sequenziati.
La colonna cromatografica Acclaim (150 mm x 2,1 mm; dimensione delle particelle 2,2 μm) utilizzata nell'analisi e la colonna di protezione da 4 mm x 4 mm sono realizzate con lo stesso materiale. Il sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC) Dionex UltiMate 3000 utilizza il seguente gradiente binario: da 0 a 0,5 minuti, isocratico 90% A [acqua deionizzata, acetonitrile allo 0,1% (v/v) e acido formico allo 0,05%], 10% B (acetonitrile e acido formico allo 0,05%); da 0,5 a 23,5 minuti, la fase del gradiente è rispettivamente 10% A e 90% B; da 23,5 a 25 minuti, isocratico 10% A e 90% B. La portata è di 400 μl/min. Per tutte le analisi MS, iniettare l'eluente della colonna in un analizzatore quadrupolare e tempo di volo (qTOF) dotato di una sorgente elettrospray funzionante in modalità di ionizzazione positiva (tensione capillare, 4500 V; uscita capillare 130 V; temperatura di essiccazione 200 °C; flusso d'aria di essiccazione 10 litri/min).
Eseguire l'analisi dei frammenti MS/MS (di seguito denominati MS/MS) irrilevanti o indistinguibili dai dati per ottenere informazioni strutturali sul profilo metabolico complessivo rilevabile. Il concetto del metodo MS/MS indiscriminato si basa sul fatto che il quadrupolo ha una finestra di isolamento di massa molto ampia [pertanto, si considerano tutti i segnali del rapporto massa/carica (m/z) come frammenti]. Per questo motivo, poiché lo strumento Impact II non è stato in grado di creare un'inclinazione CE, sono state eseguite diverse analisi indipendenti utilizzando valori di energia di collisione (CE) di dissociazione indotta da collisione aumentati. In breve, analizzare innanzitutto il campione mediante ionizzazione elettrospray UHPLC/qTOF-MS utilizzando la modalità di spettrometria di massa singola (condizioni di bassa frammentazione generate dalla frammentazione in-source), scansionando da m/z 50 a 1500 a una frequenza di ripetizione di 5 Hz. Utilizzare l'azoto come gas di collisione per l'analisi MS/MS ed eseguire misurazioni indipendenti alle seguenti quattro diverse tensioni di dissociazione indotte dalla collisione: 20, 30, 40 e 50 eV. Durante l'intero processo di misurazione, il quadrupolo presenta la più ampia finestra di isolamento di massa, da m/z 50 a 1500. Quando l'esperimento di m/z e larghezza di isolamento del corpo anteriore è impostato su 200, l'intervallo di massa viene attivato automaticamente dal software operativo dello strumento e 0 Da. Eseguire la scansione per frammenti di massa come nella modalità di massa singola. Utilizzare formiato di sodio (50 ml di isopropanolo, 200 μl di acido formico e 1 ml di soluzione acquosa 1M di NaOH) per la calibrazione della massa. Utilizzando l'algoritmo di calibrazione ad alta precisione di Bruker, il file di dati viene calibrato dopo aver eseguito lo spettro medio in un dato periodo di tempo. Utilizzare la funzione di esportazione del software Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Brema, Germania) per convertire i file di dati grezzi in formato NetCDF. Il set di dati MS/MS è stato salvato nel database metabolomico aperto MetaboLights (www.ebi.ac.uk) con il numero di accesso MTBLS1471.
L'assemblaggio MS/MS può essere realizzato tramite l'analisi di correlazione tra i segnali di qualità MS1 e MS/MS per bassa e alta energia di collisione e tramite regole di nuova implementazione. Lo script R viene utilizzato per realizzare l'analisi di correlazione della distribuzione del precursore al prodotto, mentre lo script C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) viene utilizzato per implementare le regole.
Per ridurre gli errori falsi positivi causati dal rumore di fondo e la falsa correlazione causata dal rilevamento di determinate caratteristiche m/z in pochi campioni, utilizziamo la funzione "filled peak" del pacchetto R XCMS (per la correzione del rumore di fondo). Dovrebbe essere utilizzata per sostituire l'intensità "NA" (picco non rilevato). Quando si utilizza la funzione fill peak, ci sono ancora molti valori di intensità "0" nel set di dati che influenzeranno il calcolo della correlazione. Quindi, confrontiamo i risultati dell'elaborazione dei dati ottenuti quando si utilizza la funzione filled peak e quando non si utilizza la funzione filled peak e calcoliamo il valore del rumore di fondo in base al valore medio stimato corretto, quindi sostituiamo questi valori di intensità 0 con il valore di fondo calcolato. Abbiamo anche considerato solo le caratteristiche la cui intensità superava di tre volte il valore di fondo e le abbiamo considerate come "picchi veri". Per i calcoli PCC, vengono considerati solo i segnali m/z del precursore del campione (MS1) e dei set di dati frammentati con almeno otto picchi veri.
Se l'intensità della caratteristica di qualità del precursore nell'intero campione è significativamente correlata con l'intensità ridotta della stessa caratteristica di qualità soggetta a bassa o alta energia di collisione, e la caratteristica non è etichettata come picco isotopico da CAMERA, può essere ulteriormente definita. Quindi, calcolando tutte le possibili coppie precursore-prodotto entro 3 s (la finestra di tempo di ritenzione stimata per la ritenzione del picco), viene eseguita l'analisi di correlazione. Solo quando il valore m/z è inferiore al valore del precursore e la frammentazione MS/MS si verifica nella stessa posizione del campione nel set di dati del precursore da cui è derivata, viene considerata un frammento.
Sulla base di queste due semplici regole, escludiamo i frammenti specificati con valori m/z maggiori di quelli del precursore identificato, e in base alla posizione del campione in cui appare il precursore e al frammento specificato. È anche possibile selezionare le caratteristiche qualitative generate da molti frammenti in-source generati in modalità MS1 come precursori candidati, generando così composti MS/MS ridondanti. Per ridurre questa ridondanza di dati, se la similarità NDP degli spettri supera 0,6 e appartengono al cromatogramma "pcgroup" annotato da CAMERA, li uniremo. Infine, uniamo tutti e quattro i risultati CE associati al precursore e ai frammenti nello spettro composito deconvoluto finale selezionando il picco di intensità più elevata tra tutti i picchi candidati con lo stesso valore m/z a diverse energie di collisione. Le fasi di elaborazione successive si basano sul concetto di spettro composito e tengono conto delle diverse condizioni CE necessarie per massimizzare la probabilità di frammentazione, poiché alcuni frammenti possono essere rilevati solo a una specifica energia di collisione.
RDPI (30) è stato utilizzato per calcolare l'inducibilità del profilo metabolico. La diversità dello spettro metabolico (indice Hj) è derivata dall'abbondanza di precursori MS/MS utilizzando l'entropia di Shannon della distribuzione di frequenza MS/MS utilizzando la seguente equazione descritta da Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) dove Pij corrisponde alla frequenza relativa dell'i-esimo MS/MS nel j-esimo campione (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
La specificità metabolica (indice Si) è definita come l'identità di espressione di un dato MS/MS in relazione alla frequenza tra i campioni considerati. La specificità MS/MS è calcolata come Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Utilizzare la seguente formula per misurare l'indice δj specifico del metaboloma di ciascun campione j e la media della specificità MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Gli spettri MS/MS sono allineati a coppie e la similarità viene calcolata in base ai due punteggi. Innanzitutto, utilizzando l'NDP standard (noto anche come metodo di correlazione del coseno), utilizzare la seguente equazione per valutare la similarità del segmento tra gli spettri NDP = (∑iS1 e S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 dove S1 e S2 Corrispondentemente, per lo spettro 1 e lo spettro 2, così come per WS1, i e WS2, i rappresenta il peso basato sull'intensità del picco, ovvero che la differenza dell'i-esimo picco comune tra i due spettri è inferiore a 0,01 Da. Il peso viene calcolato come segue: W = [intensità del picco] m [qualità] n, m = 0,5, n = 2, come suggerito da MassBank.
È stato implementato un secondo metodo di punteggio, che prevedeva l'analisi del NL condiviso tra MS/MS. A tal fine, abbiamo utilizzato in tandem le 52 liste NL frequentemente riscontrate durante il processo di frammentazione MS e il NL più specifico (file di dati S1) che è stato precedentemente annotato per lo spettro MS/MS dei metaboliti secondari delle specie indebolite di Nepenthes (9, 26). Creare un vettore binario di 1 e 0 per ogni MS/MS, corrispondente rispettivamente alla corrente e all'inesistente di alcuni NL. Sulla base della similarità della distanza euclidea, il punteggio di similarità NL viene calcolato per ciascuna coppia di vettori NL binari.
Per eseguire il clustering binario, abbiamo utilizzato il pacchetto R DiffCoEx, basato su un'estensione di Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Utilizzando le matrici di punteggio NDP e NL degli spettri MS/MS, abbiamo utilizzato DiffCoEx per calcolare la matrice di correlazione comparativa. Il clustering binario viene eseguito impostando il parametro "cutreeDynamic" su method = "hybrid", cutHeight = 0,9999, deepSplit = T e minClusterSize = 10. Il codice sorgente R di DiffCoEx è stato scaricato dal file aggiuntivo 1 da Tesson et al. (57); il pacchetto software R WGCNA richiesto è disponibile all'indirizzo https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Per eseguire l'analisi della rete molecolare MS/MS, abbiamo calcolato la connettività spettrale accoppiata in base ai tipi di similarità NDP e NL e abbiamo utilizzato il software Cytoscape per visualizzare la topologia di rete utilizzando il layout organico nell'applicazione di estensione dell'algoritmo di layout CyFilescape yFiles.
Utilizzare R versione 3.0.1 per eseguire l'analisi statistica dei dati. La significatività statistica è stata valutata utilizzando l'analisi della varianza a due vie (ANOVA), seguita dal test post-hoc della differenza significativa di Tukey (HSD). Per analizzare la differenza tra il trattamento erbivoro e il controllo, la distribuzione a due code dei due gruppi di campioni con la stessa varianza è stata analizzata utilizzando il test t di Student.
Per materiali supplementari per questo articolo, vedere http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
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La teoria dell'informazione fornisce una valuta universale per il confronto di metabolomi speciali e la previsione delle teorie di difesa dei test.
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