Diverse teorie sulla difesa delle piante forniscono importanti indicazioni teoriche per spiegare i modelli del metabolismo specializzato delle piante, ma le loro previsioni chiave devono ancora essere verificate. In questo studio, abbiamo utilizzato l'analisi di spettrometria di massa tandem (MS/MS) non mirata per esplorare sistematicamente il metaboloma di ceppi attenuati di tabacco, dalle singole piante alle popolazioni e alle specie strettamente correlate, e abbiamo elaborato un gran numero di teorie sulle caratteristiche spettrometriche di massa basate sugli spettri dei composti nel quadro informativo per testare le previsioni chiave delle teorie della difesa ottimale (OD) e del bersaglio mobile (MT). La componente informativa della metabolomica vegetale è coerente con la teoria OD, ma contraddice la principale previsione della teoria MT sulla dinamica metabolomica causata dagli erbivori. Dalla scala micro a quella macro evolutiva, il segnale del jasmonato è stato identificato come il principale determinante dell'OD, mentre il segnale dell'etilene ha fornito una messa a punto fine della risposta specifica all'erbivoro annotata dalla rete molecolare MS/MS.
I metaboliti speciali con strutture diverse sono i principali protagonisti dell'adattamento delle piante all'ambiente, soprattutto nella difesa dai nemici (1). La straordinaria diversificazione del metabolismo speciale presente nelle piante ha stimolato decenni di ricerche approfondite sui suoi molteplici aspetti e funzioni ecologiche, e ha dato origine a una lunga serie di teorie sulla difesa delle piante, che rappresentano lo sviluppo evolutivo ed ecologico delle interazioni pianta-insetto. La ricerca empirica fornisce un'importante guida (2). Tuttavia, queste teorie sulla difesa delle piante non hanno seguito il percorso normativo del ragionamento ipotetico-deduttivo, in cui le previsioni chiave si trovavano allo stesso livello di analisi (3) e venivano testate sperimentalmente per far progredire il ciclo successivo di sviluppo teorico (4). Le limitazioni tecniche restringono la raccolta dei dati a specifiche categorie metaboliche ed escludono un'analisi completa dei metaboliti specializzati, impedendo così i confronti intercategoriali essenziali per lo sviluppo teorico (5). La mancanza di dati metabolomici completi e di una valuta comune per confrontare il flusso di elaborazione dello spazio metabolico tra diversi gruppi di piante ostacola la maturità scientifica del settore.
Gli ultimi sviluppi nel campo della metabolomica mediante spettrometria di massa tandem (MS/MS) possono caratterizzare in modo completo i cambiamenti metabolici all'interno e tra le specie di un dato clade di sistema e possono essere combinati con metodi computazionali per calcolare la somiglianza strutturale tra queste miscele complesse. Conoscenza pregressa della chimica (5). La combinazione di tecnologie avanzate nell'analisi e nel calcolo fornisce un quadro necessario per la verifica a lungo termine di molte previsioni fatte dalle teorie ecologiche ed evolutive della diversità metabolica. Shannon (6) ha introdotto per la prima volta la teoria dell'informazione nel suo articolo fondamentale del 1948, ponendo le basi per l'analisi matematica dell'informazione, che è stata utilizzata in molti campi oltre alla sua applicazione originale. In genomica, la teoria dell'informazione è stata applicata con successo per quantificare l'informazione conservata della sequenza (7). Nella ricerca trascrittomica, la teoria dell'informazione analizza i cambiamenti complessivi nel trascrittoma (8). In precedenti ricerche, abbiamo applicato il quadro statistico della teoria dell'informazione alla metabolomica per descrivere l'esperienza metabolica a livello tissutale nelle piante (9). In questo studio, combiniamo il flusso di lavoro basato sulla spettrometria di massa tandem (MS/MS) con il quadro statistico della teoria dell'informazione, caratterizzato dalla diversità metabolica nella valuta comune, per confrontare le previsioni chiave della teoria della difesa delle piante del metaboloma indotto dagli erbivori.
I quadri teorici della difesa delle piante sono generalmente mutuamente inclusivi e possono essere suddivisi in due categorie: quelli che cercano di spiegare la distribuzione dei metaboliti specifici delle piante in base alle funzioni di difesa, come la difesa ottimale (OD) (10), il bersaglio mobile (MT) (11) e la teoria dell'aspetto (12), mentre altri cercano spiegazioni meccaniche di come i cambiamenti nella disponibilità di risorse influenzino la crescita delle piante e l'accumulo di metaboliti specializzati, come l'ipotesi del bilancio del carbonio e dei nutrienti (13), l'ipotesi del tasso di crescita (14) e l'ipotesi dell'equilibrio tra crescita e differenziazione (15). I due insiemi di teorie si trovano a diversi livelli di analisi (4). Tuttavia, due teorie che coinvolgono le funzioni difensive a livello funzionale dominano la discussione sulle difese costitutive e inducibili delle piante: la teoria OD, che presuppone che le piante investano nelle loro costose difese chimiche solo quando necessario, ad esempio, quando vengono ingerite da un animale erbivoro che attacca, quindi, in base alla possibilità di un futuro attacco, viene assegnato il composto con una funzione difensiva (10); L'ipotesi MT propone che non esista un asse di cambiamento metabolico direzionale, ma che i cambiamenti metabolici avvengano in modo casuale, creando così la possibilità di ostacolare il “bersaglio di movimento” metabolico degli erbivori attaccanti. In altre parole, queste due teorie fanno previsioni opposte sul rimodellamento metabolico che si verifica dopo l'attacco degli erbivori: la relazione tra l'accumulo unidirezionale di metaboliti con funzione difensiva (OD) e i cambiamenti metabolici non direzionali (MT) (11).
Le ipotesi OD e MT non riguardano solo i cambiamenti indotti nel metaboloma, ma anche le conseguenze ecologiche ed evolutive dell'accumulo di questi metaboliti, come i costi e i benefici adattativi di questi cambiamenti metabolici in uno specifico ambiente ecologico (16). Sebbene entrambe le ipotesi riconoscano la funzione difensiva dei metaboliti specializzati, che può essere costosa o meno, la previsione chiave che distingue le ipotesi OD e MT risiede nella direzionalità dei cambiamenti metabolici indotti. La previsione della teoria OD ha ricevuto finora la maggiore attenzione sperimentale. Questi test includono lo studio delle funzioni di difesa dirette o indirette di diversi tessuti di specifici composti in serra e in condizioni naturali, nonché i cambiamenti nello stadio di sviluppo della pianta (17-19). Tuttavia, finora, a causa della mancanza di un flusso di lavoro e di un quadro statistico per un'analisi globale completa della diversità metabolica di qualsiasi organismo, la principale differenza prevista tra le due teorie (ovvero, la direzione dei cambiamenti metabolici) deve ancora essere verificata. Qui forniamo tale analisi.
Una delle caratteristiche più significative dei metaboliti specifici delle piante è la loro estrema diversità strutturale a tutti i livelli, dalle singole piante, alle popolazioni fino alle specie simili (20). Molti cambiamenti quantitativi nei metaboliti specializzati possono essere osservati a livello di popolazione, mentre forti differenze qualitative sono solitamente mantenute a livello di specie (20). Pertanto, la diversità metabolica delle piante è l'aspetto principale della diversità funzionale, che riflette l'adattabilità a diverse nicchie, in particolare quelle con diverse possibilità di invasione da parte di insetti speciali ed erbivori comuni (21). Fin dall'articolo pionieristico di Fraenkel (22) sulle ragioni dell'esistenza dei metaboliti specifici delle piante, le interazioni con vari insetti sono state considerate importanti pressioni selettive e si ritiene che queste interazioni abbiano plasmato le piante durante l'evoluzione. Percorso metabolico (23). Le differenze interspecifiche nella diversità dei metaboliti specializzati possono anche riflettere l'equilibrio fisiologico associato alla difesa costitutiva e inducibile delle piante contro le strategie degli erbivori, poiché le due specie sono spesso correlate negativamente tra loro (24). Sebbene possa essere vantaggioso mantenere una buona difesa in ogni momento, i cambiamenti metabolici tempestivi associati alla difesa forniscono chiari vantaggi, consentendo alle piante di allocare risorse preziose ad altri investimenti fisiologici (19, 24) ed evitando la necessità di simbiosi. Danni collaterali (25). Inoltre, queste riorganizzazioni di metaboliti specializzati causate dagli insetti erbivori possono portare a una distribuzione distruttiva nella popolazione (26) e possono riflettere letture dirette di sostanziali cambiamenti naturali nel segnale dell'acido jasmonico (JA), che può essere mantenuto nella popolazione. Segnali JA alti e bassi rappresentano un compromesso tra la difesa contro gli erbivori e la competizione con specie specifiche (27). Inoltre, i percorsi biosintetici dei metaboliti specializzati subiranno una rapida perdita e trasformazione durante l'evoluzione, con conseguente distribuzione metabolica a chiazze tra specie strettamente correlate (28). Questi polimorfismi possono essere rapidamente stabiliti in risposta ai cambiamenti nei modelli di erbivori (29), il che significa che la fluttuazione delle comunità di erbivori è un fattore chiave che guida l'eterogeneità metabolica.
In questo studio, abbiamo affrontato nello specifico i seguenti problemi: (I) Come fa l'insetto erbivoro a riconfigurare il metaboloma della pianta? (II) Quali sono le principali componenti informative della plasticità metabolica che possono essere quantificate per verificare le previsioni della teoria della difesa a lungo termine? (III) Se l'insetto riprogramma il metaboloma della pianta in un modo specifico per l'attaccante, in tal caso, quale ruolo svolge l'ormone vegetale nell'adattare una risposta metabolica specifica e quali metaboliti contribuiscono alla specificità di specie della difesa? (IV) Poiché le previsioni fatte da molte teorie della difesa possono essere estese a tutti i livelli dei tessuti biologici, ci siamo chiesti quanto sia coerente la risposta metabolica causata dal confronto interno al confronto interspecifico? A tal fine, abbiamo studiato sistematicamente il metaboloma fogliare della nicotina del tabacco, una pianta modello ecologica con un metabolismo ricco e specializzato, efficace contro le larve di due erbivori autoctoni, Lepidoptera Datura (Ms) (molto aggressiva, principalmente mangiata) sulle Solanaceae e Spodoptera littoralis (Sl), i vermi delle foglie di cotone sono una sorta di "genere", con piante ospiti delle Solanaceae e altri ospiti di altri generi e famiglie. Abbiamo analizzato lo spettro metabolomico MS/MS ed estratto descrittori statistici della teoria dell'informazione per confrontare le teorie OD e MT. Abbiamo creato mappe di specificità per rivelare l'identità dei metaboliti chiave. L'analisi è stata estesa alla popolazione autoctona di N. nasi e specie di tabacco strettamente correlate per analizzare ulteriormente la covarianza tra la segnalazione ormonale vegetale e l'induzione OD.
Al fine di ottenere una mappa generale della plasticità e della struttura del metaboloma fogliare del tabacco erbivoro, abbiamo utilizzato un flusso di lavoro di analisi e calcolo precedentemente sviluppato per raccogliere e deconvolvere in modo completo spettri MS/MS indipendenti da dati ad alta risoluzione da estratti vegetali (9). Questo metodo non differenziato (chiamato MS/MS) può costruire spettri di composti non ridondanti, che possono quindi essere utilizzati per tutte le analisi a livello di composto qui descritte. Questi metaboliti vegetali deconvoluti sono di vario tipo, costituiti da centinaia a migliaia di metaboliti (circa 500-1000-s/MS/MS qui). Qui, consideriamo la plasticità metabolica nel quadro della teoria dell'informazione e quantifichiamo la diversità e la professionalità del metaboloma sulla base dell'entropia di Shannon della distribuzione di frequenza metabolica. Utilizzando la formula precedentemente implementata (8), abbiamo calcolato una serie di indicatori che possono essere utilizzati per quantificare la diversità del metaboloma (indicatore Hj), la specializzazione del profilo metabolico (indicatore δj) e la specificità metabolica di un singolo metabolita (indicatore Si). Inoltre, abbiamo applicato l'indice di plasticità della distanza relativa (RDPI) per quantificare l'inducibilità del metaboloma degli erbivori (Figura 1A) (30). All'interno di questo quadro statistico, trattiamo lo spettro MS/MS come unità di informazione di base ed elaboriamo l'abbondanza relativa di MS/MS in una mappa di distribuzione di frequenza, quindi utilizziamo l'entropia di Shannon per stimare la diversità del metaboloma da essa. La specializzazione del metaboloma è misurata dalla specificità media di un singolo spettro MS/MS. Pertanto, l'aumento dell'abbondanza di alcune classi MS/MS dopo l'induzione degli erbivori viene trasformato in inducibilità spettrale, RDPI e specializzazione, ovvero l'aumento dell'indice δj, perché vengono prodotti più metaboliti specializzati e viene prodotto un indice Si elevato. L'abbassamento dell'indice di diversità Hj riflette il fatto che il numero di MS/MS generati è ridotto o la distribuzione di frequenza del profilo cambia in una direzione meno uniforme, riducendo al contempo la sua incertezza complessiva. Attraverso il calcolo dell'indice Si, è possibile evidenziare quali MS/MS sono indotti da determinati erbivori e, al contrario, quali MS/MS non rispondono all'induzione, il che rappresenta un indicatore chiave per distinguere la previsione MT e OD.
(A) Descrittori statistici utilizzati per l'inducibilità dei dati MS/MS (RDPI), la diversità (indice Hj), la specializzazione (indice δj) e la specificità dei metaboliti (indice Si) degli erbivori (da H1 a Hx). Un aumento del grado di specializzazione (δj) indica che, in media, verranno prodotti più metaboliti specifici degli erbivori, mentre una diminuzione della diversità (Hj) indica una diminuzione della produzione di metaboliti o una distribuzione non uniforme dei metaboliti nella mappa di distribuzione. Il valore Si valuta se il metabolita è specifico per una data condizione (in questo caso, erbivoro) o, al contrario, viene mantenuto allo stesso livello. (B) Diagramma concettuale della previsione della teoria della difesa utilizzando l'asse della teoria dell'informazione. La teoria OD prevede che l'attacco degli erbivori aumenterà i metaboliti di difesa, aumentando così δj. Allo stesso tempo, Hj diminuisce perché il profilo viene riorganizzato verso la ridotta incertezza delle informazioni metaboliche. La teoria MT prevede che l'attacco degli erbivori provochi cambiamenti non direzionali nel metaboloma, aumentando così Hj come indicatore di una maggiore incertezza delle informazioni metaboliche e causando una distribuzione casuale di Si. Abbiamo anche proposto un modello misto, il miglior MT, in cui alcuni metaboliti con valori difensivi più elevati saranno particolarmente aumentati (valore Si elevato), mentre altri mostreranno risposte casuali (valore Si inferiore).
Utilizzando i descrittori della teoria dell'informazione, interpretiamo la teoria OD per prevedere che i cambiamenti metabolici speciali indotti dagli erbivori in uno stato costitutivo non indotto porteranno a (i) un aumento della specificità metabolica (indice Si) che guida la specificità metabolomica (indice δj) (l'aumento di) certi gruppi di metaboliti speciali con un valore di difesa più elevato, e (ii) una diminuzione della diversità del metaboloma (indice Hj) dovuta al cambiamento della distribuzione della frequenza metabolica verso una distribuzione più leptinica. A livello di un singolo metabolita, ci si aspetta una distribuzione Si ordinata, dove il metabolita aumenterà il valore Si in base al suo valore di difesa (Figura 1B). In questa linea, spieghiamo la teoria MT per prevedere che l'eccitazione porterà a (i) cambiamenti non direzionali nei metaboliti che si traducono in una diminuzione dell'indice δj, e (ii) un aumento dell'indice Hj dovuto a un aumento dell'incertezza metabolica. O casualità, che può essere quantificata dall'entropia di Shannon sotto forma di diversità generalizzata. Per quanto riguarda la composizione metabolica, la teoria MT prevede la distribuzione casuale di Si. Tenendo conto che alcuni metaboliti sono in condizioni specifiche e altri no, e che il loro valore di difesa dipende dall'ambiente, abbiamo anche proposto un modello di difesa misto, in cui δj e Hj sono distribuiti in due lungo Si. Aumentando in tutte le direzioni, solo alcuni gruppi di metaboliti, che hanno valori di difesa più elevati, aumenteranno in modo particolare Si, mentre altri avranno una distribuzione casuale (Figura 1B).
Per testare la previsione della teoria della difesa ridefinita sull'asse del descrittore della teoria dell'informazione, abbiamo allevato larve di erbivori esperti (Ms) o generalisti (Sl) sulle foglie di Nepenthes pallens (Figura 2A). Utilizzando l'analisi MS/MS, abbiamo recuperato 599 spettri MS/MS non ridondanti (file di dati S1) da estratti metanolici di tessuto fogliare raccolto dopo l'alimentazione dei bruchi. L'utilizzo degli indici RDPI, Hj e δj per visualizzare la riconfigurazione del contenuto informativo nei file di configurazione MS/MS rivela modelli interessanti (Figura 2B). La tendenza generale è che, come descritto dal descrittore dell'informazione, man mano che i bruchi continuano a mangiare le foglie, il grado di tutta la riorganizzazione metabolica aumenta nel tempo: 72 ore dopo l'alimentazione dell'erbivoro, l'RDPI aumenta significativamente. Rispetto al controllo non danneggiato, Hj è risultato significativamente ridotto, il che è dovuto all'aumento del grado di specializzazione del profilo metabolico, che è stato quantificato dall'indice δj. Questa tendenza apparente è coerente con le previsioni della teoria OD, ma è incoerente con le principali previsioni della teoria MT, che ritiene che i cambiamenti casuali (non direzionali) nei livelli dei metaboliti siano utilizzati come camuffamento difensivo (Figura 1B). Sebbene il contenuto di elicitori della secrezione orale (OS) e il comportamento alimentare di questi due erbivori siano diversi, la loro alimentazione diretta ha determinato cambiamenti simili nelle direzioni di Hj e δj durante i periodi di raccolta di 24 e 72 ore. L'unica differenza si è verificata a 72 ore di RDPI. Rispetto a quello causato dall'alimentazione Ms, il metabolismo complessivo indotto dall'alimentazione Sl è risultato più elevato.
(A) Disegno sperimentale: suini comuni (S1) o erbivori esperti (Ms) vengono alimentati con foglie desalinizzate di piante carnivore, mentre per l'erbivoria simulata, l'OS di Ms (W + OSMs) viene utilizzato per gestire la puntura di posizioni fogliari standardizzate ferite. S1 (W + OSSl) larve o acqua (W + W). Il controllo (C) è una foglia intatta. (B) Indice di inducibilità (RDPI confrontato con il grafico di controllo), diversità (indice Hj) e specializzazione (indice δj) calcolati per la mappa metabolica speciale (599 MS/MS; file di dati S1). Gli asterischi indicano differenze significative tra l'alimentazione diretta dell'erbivoro e il gruppo di controllo (test t di Student con test t appaiato, *P<0,05 e ***P<0,001). ns, non importante. (C) Indice di risoluzione temporale dello spettro dei metaboliti principali (riquadro blu, amminoacidi, acidi organici e zuccheri; file di dati S2) e speciali (riquadro rosso 443 MS/MS; file di dati S1) dopo il trattamento simulato di erbivoria. La banda di colore si riferisce all'intervallo di confidenza del 95%. L'asterisco indica la differenza significativa tra il trattamento e il controllo [analisi quadratica della varianza (ANOVA), seguita dalla differenza onestamente significativa di Tukey (HSD) per confronti multipli post hoc, *P<0,05, **P<0,01 e *** P <0,001]. (D) Specializzazione dei diagrammi a dispersione e dei profili dei metaboliti speciali (campioni ripetuti con trattamenti diversi).
Per esplorare se il rimodellamento indotto dagli erbivori a livello del metaboloma si riflette nei cambiamenti del livello dei singoli metaboliti, ci siamo concentrati inizialmente sui metaboliti precedentemente studiati nelle foglie di Nepenthes pallens con comprovata resistenza agli erbivori. Le ammidi fenoliche sono coniugati idrossicinnamamide-poliammina che si accumulano durante il processo di erbivoria degli insetti e sono noti per ridurre le prestazioni degli insetti (32). Abbiamo cercato i precursori del corrispondente MS/MS e tracciato le loro curve cinetiche cumulative (Figura S1). Non sorprende che i derivati ​​del fenolo che non sono direttamente coinvolti nella difesa contro gli erbivori, come l'acido clorogenico (CGA) e la rutina, siano sottoregolati dopo l'erbivoria. Al contrario, gli erbivori possono rendere le ammidi fenoliche altamente potenti. L'alimentazione continua dei due erbivori ha determinato uno spettro di eccitazione quasi identico delle fenolammidi, e questo schema è risultato particolarmente evidente per la sintesi de novo delle fenolammidi. Lo stesso fenomeno verrà osservato esplorando la via dei glicosidi diterpenici 17-idrossigeranil nonanediolo (17-HGL-DTG), che produce un gran numero di diterpeni aciclici con efficaci funzioni anti-erbivori (33), di cui Ms Feeding with Sl ha innescato un profilo di espressione simile (Figura S1)).
Il possibile svantaggio degli esperimenti di alimentazione diretta degli erbivori è la differenza nel tasso di consumo delle foglie e nel tempo di alimentazione degli erbivori, che rende difficile eliminare gli effetti specifici degli erbivori causati da ferite ed erbivori stessi. Per risolvere meglio la specificità della specie di erbivoro nella risposta metabolica fogliare indotta, abbiamo simulato l'alimentazione delle larve di Ms e Sl applicando immediatamente l'OS appena raccolto (OSM e OSS1) alla puntura standard W di posizioni fogliari costanti. Questa procedura è chiamata trattamento W + OS e standardizza l'induzione cronometrando con precisione l'inizio della risposta elicitata dall'erbivoro senza causare effetti confondenti dovuti a differenze nel tasso o nella quantità di perdita di tessuto (Figura 2A) (34). Utilizzando la pipeline di analisi e calcolo MS/MS, abbiamo recuperato 443 spettri MS/MS (file di dati S1), che si sovrapponevano agli spettri precedentemente assemblati da esperimenti di alimentazione diretta. L'analisi della teoria dell'informazione di questo set di dati MS/MS ha mostrato che la riprogrammazione dei metabolomi specializzati delle foglie mediante la simulazione di erbivori ha mostrato induzioni specifiche di OS (Figura 2C). In particolare, rispetto al trattamento OSS1, OSM ha causato un miglioramento della specializzazione del metaboloma a 4 ore. Vale la pena notare che rispetto al set di dati sperimentali di alimentazione diretta degli erbivori, la cinetica metabolica visualizzata nello spazio bidimensionale utilizzando Hj e δj come coordinate e la direzionalità della specializzazione del metaboloma in risposta al trattamento con erbivori simulati nel tempo Aumenta coerente (Figura 2D). Allo stesso tempo, abbiamo quantificato il contenuto di amminoacidi, acidi organici e zuccheri (file di dati S2) per indagare se questo aumento mirato della competenza del metaboloma sia dovuto alla riconfigurazione del metabolismo centrale del carbonio in risposta agli erbivori simulati (Figura S2). Per spiegare meglio questo modello, abbiamo ulteriormente monitorato la cinetica di accumulo metabolico delle vie metaboliche della fenolamide e del 17-HGL-DTG precedentemente discusse. L'induzione specifica di OS negli erbivori si trasforma in un modello di riarrangiamento differenziale all'interno del metabolismo della fenolamide (Figura S3). Le ammidi fenoliche contenenti gruppi cumarina e caffeoile sono indotte preferenzialmente da OSS1, mentre gli OSM innescano un'induzione specifica dei coniugati ferulilici. Per la via 17-HGL-DTG, è stata rilevata un'induzione differenziale di OS da parte dei prodotti di malonilazione e dimalonilazione a valle (Figura S3).
Successivamente, abbiamo studiato la plasticità del trascrittoma indotta da OS utilizzando il set di dati microarray del corso del tempo, che simula l'uso di OSM per trattare le foglie della pianta a rosetta negli erbivori. La cinetica di campionamento si sovrappone sostanzialmente alla cinetica utilizzata in questo studio di metabolomica (35). Rispetto alla riconfigurazione del metaboloma in cui la plasticità metabolica è particolarmente aumentata nel tempo, osserviamo raffiche di trascrizione transitorie nelle foglie indotte da Ms, dove l'inducibilità del trascrittoma (RDPI) e la specializzazione (δj) sono a 1. C'è stato un aumento significativo in ore e diversità (Hj) in questo punto temporale, l'espressione di BMP1 è stata significativamente ridotta, seguita dal rilassamento della specializzazione del trascrittoma (Figura S4). Le famiglie di geni metabolici (come P450, glicosiltransferasi e aciltransferasi BAHD) partecipano al processo di assemblaggio di metaboliti speciali da unità strutturali derivate dal metabolismo primario, seguendo il suddetto modello di alta specializzazione precoce. Come caso di studio, è stato analizzato il pathway della fenilalanina. L'analisi ha confermato che i geni chiave nel metabolismo della fenolamide sono fortemente indotti dallo stress ossidativo negli erbivori rispetto alle piante non attratte e presentano modelli di espressione strettamente allineati. Il fattore di trascrizione MYB8 e i geni strutturali PAL1, PAL2, C4H e 4CL a monte di questo pathway hanno mostrato un'iniziazione precoce della trascrizione. Le aciltransferasi che svolgono un ruolo nell'assemblaggio finale della fenolamide, come AT1, DH29 e CV86, mostrano un modello di sovraregolazione prolungato (Figura S4). Le osservazioni di cui sopra indicano che l'iniziazione precoce della specializzazione del trascrittoma e il successivo potenziamento della specializzazione metabolomica sono una modalità accoppiata, che potrebbe essere dovuta al sistema regolatorio sincrono che avvia una potente risposta di difesa.
La riconfigurazione della segnalazione ormonale vegetale agisce come uno strato regolatorio che integra le informazioni sugli erbivori per riprogrammare la fisiologia delle piante. Dopo la simulazione degli erbivori, abbiamo misurato la dinamica cumulativa delle principali categorie di ormoni vegetali e visualizzato la co-espressione temporale tra di esse [coefficiente di correlazione di Pearson (PCC) > 0,4] (Figura 3A). Come previsto, gli ormoni vegetali correlati alla biosintesi sono collegati all'interno della rete di co-espressione degli ormoni vegetali. Inoltre, la specificità metabolica (indice Si) è mappata su questa rete per evidenziare gli ormoni vegetali indotti da diversi trattamenti. Sono state individuate due aree principali di risposta specifica agli erbivori: una si trova nel cluster JA, dove JA (la sua forma biologicamente attiva JA-Ile) e altri derivati ​​di JA mostrano il punteggio Si più alto; l'altra è l'etilene (ET). La gibberellina ha mostrato solo un moderato aumento della specificità per gli erbivori, mentre altri ormoni vegetali, come citochinine, auxine e acido abscissico, hanno mostrato una bassa specificità di induzione per gli erbivori. Rispetto all'utilizzo di W + W da solo, l'amplificazione del valore di picco dei derivati ​​JA attraverso l'applicazione OS (W + OS) può essere sostanzialmente trasformata in un forte indicatore specifico di JA. Inaspettatamente, è noto che OSM e OSS1 con diverso contenuto di elicitori causano un accumulo simile di JA e JA-Ile. A differenza di OSS1, OSM è indotto in modo specifico e forte da OSM, mentre OSS1 non amplifica la risposta delle ferite basali (Figura 3B).
(A) Analisi della rete di co-espressione basata sul calcolo PCC della simulazione della cinetica di accumulo degli ormoni vegetali indotta dagli erbivori. Il nodo rappresenta un singolo ormone vegetale e la dimensione del nodo rappresenta l'indice Si specifico per l'ormone vegetale tra i trattamenti. (B) Accumulo di JA, JA-Ile ed ET nelle foglie causato da diversi trattamenti indicati da diversi colori: albicocca, W + OSM; blu, W + OSSl; nero, W + W; grigio, C (controllo). Gli asterischi indicano differenze significative tra trattamento e controllo (ANOVA a due vie seguita da confronto multiplo post hoc Tukey HSD, *** P <0,001). Analisi della teoria dell'informazione di (C)697 MS/MS (file di dati S1) nella biosintesi di JA e spettro di percezione alterato (irAOC e irCOI1) e (D)585 MS/MS (file di dati S1) in ETR1 con segnale ET alterato. Due trattamenti simulati con erbivori hanno innescato linee di piante e piante di controllo con veicolo vuoto (EV). Gli asterischi indicano differenze significative tra il trattamento W+OS e il controllo non danneggiato (ANOVA a due vie seguita da confronto multiplo post hoc Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). (E) Grafici a dispersione dell'opposizione alla specializzazione. I colori rappresentano diversi ceppi geneticamente modificati; i simboli rappresentano diversi metodi di trattamento: triangolo, W + OSS1; rettangolo, W + OSM; cerchio C
Successivamente, utilizziamo un ceppo geneticamente modificato di Nepenthes attenuata (irCOI1 e sETR1) nelle fasi chiave della biosintesi di JA ed ET (irAOC e irACO) e della percezione (irCOI1 e sETR1) per analizzare il metabolismo di questi due ormoni vegetali sugli erbivori. Il contributo relativo della riprogrammazione. In linea con esperimenti precedenti, abbiamo confermato l'induzione di OS erbivoro nelle piante portatrici vuote (EV) (Figura 3, da C a D) e la diminuzione complessiva dell'indice Hj causata da OSM, mentre l'indice δj è aumentato. La risposta è più pronunciata rispetto alla risposta innescata da OSS1. Un grafico a due linee che utilizza Hj e δj come coordinate mostra la deregolazione specifica (Figura 3E). La tendenza più evidente è che nei ceppi privi del segnale JA, la diversità del metaboloma e i cambiamenti di specializzazione causati dagli erbivori sono quasi completamente eliminati (Figura 3C). Al contrario, la percezione silente dell'ET nelle piante sETR1, sebbene l'effetto complessivo sui cambiamenti nel metabolismo degli erbivori sia molto inferiore a quello della segnalazione JA, attenua la differenza negli indici Hj e δj tra le eccitazioni OSM e OSS1 (Figura 3D e Figura S5). Ciò indica che, oltre alla funzione principale della trasduzione del segnale JA, la trasduzione del segnale ET serve anche come regolazione fine della risposta metabolica specie-specifica degli erbivori. In linea con questa funzione di regolazione fine, non si è osservata alcuna variazione nell'inducibilità complessiva del metaboloma nelle piante sETR1. D'altra parte, rispetto alle piante sETR1, le piante irACO hanno indotto ampiezze complessive simili di cambiamenti metabolici causati dagli erbivori, ma hanno mostrato punteggi Hj e δj significativamente diversi tra le sfide OSM e OSS1 (Figura S5).
Al fine di identificare i metaboliti specializzati che contribuiscono in modo significativo alla risposta specie-specifica degli erbivori e di affinare la loro produzione attraverso i segnali ET, abbiamo utilizzato il metodo MS/MS strutturale precedentemente sviluppato. Questo metodo si basa sul metodo di bi-clustering per re-inferire la famiglia metabolica dai frammenti MS/MS [prodotto scalare normalizzato (NDP)] e dal punteggio di similarità basato sulla perdita neutra (NL). Il set di dati MS/MS costruito attraverso l'analisi delle linee transgeniche ET ha prodotto 585 MS/MS (file di dati S1), che sono stati risolti mediante clustering in sette moduli MS/MS principali (M) (Figura 4A). Alcuni di questi moduli sono densamente popolati da metaboliti speciali precedentemente caratterizzati: ad esempio, M1, M2, M3, M4 e M7 sono ricchi di vari derivati ​​fenolici (M1), glicosidi flavonoidi (M2), zuccheri acilici (M3 e M4) e 17-HGL-DTG (M7). Inoltre, viene calcolata l'informazione metabolica specifica (indice Si) di un singolo metabolita in ciascun modulo e la sua distribuzione Si può visualizzare in modo intuitivo. In breve, gli spettri MS/MS che mostrano un'elevata specificità per l'erbivoria e il genotipo sono caratterizzati da valori Si elevati e le statistiche di curtosi indicano la distribuzione del pelo nell'angolo destro della coda. Una tale distribuzione colloidale magra è stata rilevata in M1, in cui la fenolo ammide ha mostrato la frazione Si più alta (Figura 4B). Il 17-HGL-DTG inducibile dall'erbivoria precedentemente menzionato in M7 ha mostrato un punteggio Si moderato, indicando un grado moderato di regolazione differenziale tra i due tipi di OS. Al contrario, la maggior parte dei metaboliti specializzati prodotti in modo costitutivo, come la rutina, l'acido clorogenico (CGA) e gli zuccheri acilici, sono tra i punteggi Si più bassi. Al fine di esplorare meglio la complessità strutturale e la distribuzione Si tra i metaboliti speciali, è stata costruita una rete molecolare per ciascun modulo (Figura 4B). Un'importante previsione della teoria OD (riassunta nella Figura 1B) è che la riorganizzazione dei metaboliti speciali dopo l'erbivoria dovrebbe portare a cambiamenti unidirezionali nei metaboliti con alto valore di difesa, soprattutto aumentando la loro specificità (in contrapposizione alla distribuzione casuale) Modalità) Metabolita difensivo previsto dalla teoria MT. La maggior parte dei derivati ​​fenolici accumulati in M1 sono funzionalmente correlati al declino delle prestazioni degli insetti (32). Confrontando i valori Si nei metaboliti M1 tra le foglie indotte e le foglie costituenti delle piante di controllo EV a 24 ore, abbiamo osservato che la specificità metabolica di molti metaboliti dopo gli insetti erbivori ha una tendenza all'aumento significativa (Figura 4C). L'aumento specifico del valore Si è stato rilevato solo nelle fenolammidi difensive, ma nessun aumento del valore Si è stato rilevato in altri fenoli e metaboliti sconosciuti coesistenti in questo modulo. Questo è un modello specializzato, che è correlato alla teoria OD. Le principali previsioni dei cambiamenti metabolici causati dagli erbivori sono coerenti. Per verificare se questa particolarità dello spettro della fenolamide fosse indotta dall'ET specifico per OS, abbiamo tracciato l'indice Si del metabolita e causato un valore di espressione differenziale tra OSM e OSS1 nei genotipi EV e sETR1 (Figura 4D). In sETR1, la differenza indotta dalla fenolamide tra OSM e OSS1 era notevolmente ridotta. Il metodo di bi-clustering è stato applicato anche ai dati MS/MS raccolti in ceppi con JA insufficiente per dedurre i principali moduli MS/MS correlati alla specializzazione metabolica regolata da JA (Figura S6).
(A) I risultati del clustering di 585 MS/MS basati su frammenti condivisi (somiglianza NDP) e perdita neutra condivisa (somiglianza NL) determinano che il modulo (M) è coerente con la famiglia di composti nota, oppure con una composizione di metaboliti sconosciuta o scarsamente metabolizzata. Accanto a ciascun modulo, viene mostrata la distribuzione specifica (Si) del metabolita (MS/MS). (B) Rete molecolare modulare: i nodi rappresentano MS/MS e gli archi, punteggi MS/MS NDP (rosso) e NL (blu) (cut-off, > 0,6). L'indice di specificità del metabolita graduato (Si) colorato in base al modulo (a sinistra) e mappato sulla rete molecolare (a destra). (C) Modulo M1 della pianta EV in stato costitutivo (controllo) e indotto (erbivoro simulato) a 24 ore: diagramma della rete molecolare (il valore Si è la dimensione del nodo, la fenolamide difensiva è evidenziata in blu). (D) Diagramma della rete molecolare M1 della linea spettrale sETR1 con percezione EV ed ET compromessa: il composto fenolico è rappresentato dal nodo del cerchio verde e la differenza significativa (valore P) tra i trattamenti W + OSM e W + OSS1 è indicata dalla dimensione del nodo. CP, N-caffeoil-tirosina; CS, N-caffeoil-spermidina; FP, estere dell'acido N-ferulico-acido urico; FS, N-ferulil-spermidina; CoP, N', N "-cumarolil-tirosina; DCS, N', N"-dicaffeoil-spermidina; CFS, N', N"-caffeoil, feruloil-spermidina; Lycium barbarum in bacche di goji; Nick. O-AS, zucchero O-acilico.
Abbiamo ulteriormente esteso l'analisi da un singolo genotipo attenuato di Nepenthes alle popolazioni naturali, dove forti cambiamenti intraspecifici nei livelli di JA erbivori e nei livelli di metaboliti specifici sono stati precedentemente descritti nelle popolazioni naturali (26). Utilizziamo questo set di dati per coprire 43 germoplasmi. Questi germoplasmi sono costituiti da 123 specie di piante di N. pallens. Queste piante sono state prese da semi raccolti in diversi habitat nativi nello Utah, Nevada, Arizona e California (Figura S7), abbiamo calcolato la diversità del metaboloma (qui chiamata diversità β a livello di popolazione) e la specializzazione causata da OSM. In linea con studi precedenti, abbiamo osservato un'ampia gamma di cambiamenti metabolici lungo gli assi Hj e δj, indicando che i germoplasmi hanno differenze significative nella plasticità delle loro risposte metaboliche agli erbivori (Figura S7). Questa organizzazione ricorda le precedenti osservazioni sulla gamma dinamica dei cambiamenti di JA causati dagli erbivori e ha mantenuto un valore molto elevato in una singola popolazione (26, 36). Utilizzando JA e JA-Ile per testare la correlazione a livello generale tra Hj e δj, abbiamo scoperto che esiste una correlazione positiva significativa tra JA e l'indice di diversità e specializzazione del metaboloma β (Figura S7). Ciò suggerisce che l'eterogeneità indotta dagli erbivori nell'induzione di JA rilevata a livello di popolazione potrebbe essere dovuta a polimorfismi metabolici chiave causati dalla selezione da parte degli insetti erbivori.
Studi precedenti hanno dimostrato che i tipi di tabacco differiscono notevolmente per tipo e dipendenza relativa dalle difese metaboliche indotte e costitutive. Si ritiene che questi cambiamenti nella trasduzione del segnale anti-erbivori e nelle capacità di difesa siano regolati dalla pressione della popolazione di insetti, dal ciclo vitale della pianta e dai costi di produzione della difesa nella nicchia in cui cresce una data specie. Abbiamo studiato la coerenza del rimodellamento del metaboloma fogliare indotto dagli erbivori di sei specie di Nicotiana native del Nord America e del Sud America. Queste specie sono strettamente imparentate con Nepenthes Nord America, vale a dire Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. erba attenuata, Nicotiana tabacum, tabacco lineare, tabacco (Nicotiana spegazzinii) e tabacco foglia (Nicotiana obtusifolia) (Figura 5A) (37). Sei di queste specie, inclusa la specie ben caratterizzata N. please, sono piante annuali del clade petunia, e obtusifolia N. è perenne del clade fratello Trigonophyllae (38). Successivamente, su queste sette specie sono state eseguite induzioni W + W, W + OSM e W + OSS1 per studiare il riarrangiamento metabolico a livello di specie dell'alimentazione degli insetti.
(A) Un albero filogenetico bootstrap basato sulla massima verosimiglianza [per la sintesi nucleare della glutammina (38)] e la distribuzione geografica di sette specie di Nicotiana strettamente correlate (colori diversi) (37). (B) Un grafico a dispersione della diversità specializzata per i profili metabolici di sette specie di Nicotiana (939 MS/MS; file di dati S1). A livello di specie, la diversità del metaboloma è correlata negativamente con il grado di specializzazione. L'analisi della correlazione a livello di specie tra diversità metabolica e specializzazione e accumulo di JA è mostrata nella Figura 2. S9. Colore, tipi diversi; triangolo, W + OSS1; rettangolo, W + OSM; (C) Le dinamiche di JA e JA-Ile di Nicotiana sono classificate in base all'ampiezza di eccitazione OS (ANOVA a due vie e confronto multiplo post-test di Tukey HSD, * P <0,05, ** P <0,01 e * ** Per il confronto di W + OS e W + W, P <0,001). Box plot della (D) diversità e (E) specializzazione di ciascuna specie dopo la simulazione di erbivoria e metil JA (MeJA). L'asterisco indica la differenza significativa tra W + OS e W + W o lanolina più W (Lan + W) o Lan più MeJA (Lan + MeJa) e controllo Lan (analisi della varianza a due vie, seguita dal confronto multiplo post hoc HSD di Tukey, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001).
Utilizzando il metodo del doppio cluster, abbiamo identificato 9 moduli di 939 MS/MS (file di dati S1). La composizione di MS/MS riconfigurati da diversi trattamenti varia notevolmente tra i diversi moduli e tra le specie (Figura S8). La visualizzazione di Hj (qui indicato come diversità γ a livello di specie) e δj rivela che le diverse specie si aggregano in gruppi molto diversi nello spazio metabolico, dove la divisione a livello di specie è solitamente più prominente dell'eccitazione. Ad eccezione di N. linear e N. obliquus, esse mostrano un ampio intervallo dinamico di effetti di induzione (Figura 5B). Al contrario, specie come N. purpurea e N. obtusifolia hanno una risposta metabolica al trattamento meno evidente, ma il metaboloma è più diversificato. La distribuzione specie-specifica della risposta metabolica indotta ha portato a una correlazione negativa significativa tra specializzazione e diversità gamma (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Le modifiche indotte da OS nei livelli di JA sono correlate positivamente con la specializzazione del metaboloma e negativamente con la diversità gamma metabolica esibita da ciascuna specie (Figura 5B e Figura S9). Vale la pena notare che le specie colloquialmente indicate come specie "a risposta al segnale" nella Figura 5C, come i nematodi Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute e Nepenthes attenuated, hanno causato segni significativi a 30 minuti. I recenti focolai di JA e JA-Ile specifici per OS, mentre altri batteri chiamati "non responsivi al segnale", come Nepenthes mills, Nepenthes powdery e N. obtusifolia mostrano solo l'induzione di JA-Ile Edge senza alcuna specificità OS (Figura 5C). A livello metabolico, come menzionato sopra, per Nepenthes attenuated, le sostanze responsive al segnale hanno mostrato specificità OS e hanno aumentato significativamente δj, mentre hanno ridotto Hj. Questo effetto di priming specifico per OS non è stato rilevato nelle specie classificate come specie non reattive al segnale (Figura 5, D ed E). I metaboliti specifici per OS sono condivisi più frequentemente tra le specie che rispondono al segnale, e questi cluster di segnali si raggruppano con specie con risposte al segnale più deboli, mentre le specie con risposte al segnale più deboli mostrano una minore interdipendenza (Figura S8). Questo risultato indica che l'induzione specifica per OS degli JA e la riconfigurazione specifica per OS del metaboloma a valle sono accoppiate a livello di specie.
Successivamente, abbiamo utilizzato una pasta di lanolina contenente metil JA (MeJA) per trattare le piante al fine di indagare se queste modalità di accoppiamento siano limitate dalla disponibilità di JA applicata da JA esogeno, che sarà nel citoplasma delle piante. La rapida deesterificazione è JA. Abbiamo trovato la stessa tendenza del cambiamento graduale da specie reattive al segnale a specie non reattive al segnale causato dalla fornitura continua di JA (Figura 5, D ed E). In breve, il trattamento con MeJA ha riprogrammato fortemente i metabolomi dei nematodi lineari, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens e N. mikimotoi, con conseguente aumento significativo di δj e diminuzione di Hj. N. purpurea ha mostrato solo un aumento di δj, ma non di Hj. N. obtusifolia, che in precedenza ha dimostrato di accumulare livelli estremamente bassi di JA, risponde anche scarsamente al trattamento con MeJA in termini di riconfigurazione del metaboloma. Questi risultati indicano che la produzione di JA o la trasduzione del segnale è fisiologicamente limitata nelle specie non reattive al segnale. Per testare questa ipotesi, abbiamo studiato le quattro specie (N. pallens, N. mills, N. pink e N. microphylla) indotte da W + W, W + OSMs e W + OSS1 Transcriptome (39). In linea con il modello di rimodellamento del metaboloma, le specie sono ben separate nello spazio del trascrittoma, tra cui N. attenuated ha mostrato il più alto RDPI indotto da OS, mentre N. gracilis ha avuto il più basso (Figura 6A). Tuttavia, è stato scoperto che la diversità del trascrittoma indotta da N. oblonga era la più bassa tra le quattro specie, contrariamente alla più alta diversità metabonomica di N. oblonga precedentemente mostrata in sette specie. Studi precedenti hanno dimostrato che un insieme di geni correlati ai segnali di difesa precoci, inclusi i segnali JA, spiega la specificità delle risposte di difesa precoci indotte da elicitori correlati agli erbivori nelle specie di Nicotiana (39). Il confronto delle vie di segnalazione dell'acido jasmonico (JA) tra queste quattro specie ha rivelato un modello interessante (Figura 6B). La maggior parte dei geni in questa via, come AOC, OPR3, ACX e COI1, hanno mostrato livelli di induzione relativamente elevati in queste quattro specie. Tuttavia, un gene chiave, JAR4, converte il JA nella sua forma biologicamente attiva di JA-Ile, accumulando trascritti, e il suo livello di trascrizione è molto basso, soprattutto in N. mills, Nepenthes pieris e N. microphylla. Inoltre, solo il trascritto di un altro gene, AOS, non è stato rilevato in N. bifidum. Questi cambiamenti nell'espressione genica potrebbero essere responsabili dei fenotipi estremi indotti dalla bassa produzione di JA nelle specie anergiche al segnale e dall'induzione in N. gracilis.
(A) Analisi della teoria dell'informazione della riprogrammazione delle risposte trascrizionali precoci di quattro specie di tabacco strettamente correlate, campionate 30 minuti dopo l'induzione dell'erbivoria. L'RDPI è calcolato confrontando le foglie indotte dall'erbivoro OS con il controllo della ferita. I colori indicano specie diverse e i simboli indicano metodi di trattamento diversi. (B) Analisi dell'espressione genica nei percorsi di segnalazione JA tra quattro specie. Il percorso JA semplificato è mostrato accanto al box plot. Colori diversi indicano metodi di elaborazione diversi. L'asterisco indica che esiste una differenza significativa tra il trattamento W + OS e il controllo W + W (per il test t di Student per differenze a coppie, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). OPDA: acido 12-ossofitodienoico; OPC-8: acido 0,3-osso-2(2′(Z)-pentenil)-ciclopentano-1-ottanoico.
Nell'ultima parte, abbiamo studiato come il rimodellamento specie-specifico del metaboloma di diverse specie vegetali può essere resistente agli erbivori. La ricerca precedente ha enfatizzato il genere Nicotiana. La loro resistenza a Ms e larve differisce notevolmente (40). Qui, abbiamo studiato la connessione tra questo modello e la loro plasticità metabolica. Utilizzando le quattro specie di tabacco sopra menzionate e testando la correlazione tra la diversità e la specializzazione del metaboloma causate dagli erbivori e la resistenza delle piante a Ms e Sl, abbiamo scoperto che la resistenza, la diversità e la specializzazione al generalista Sl sono tutte positivamente correlate, mentre la correlazione tra la resistenza alle donne esperte e la specializzazione è debole e la correlazione con la diversità non è significativa (Figura S10). Per quanto riguarda la resistenza a S1, sia la N. chinensis attenuata che la N. gracilis, che in precedenza hanno dimostrato di mostrare sia livelli di trasduzione del segnale JA che plasticità del metaboloma, hanno avuto risposte molto diverse all'induzione degli erbivori e hanno anche mostrato una resistenza elevata simile.
Negli ultimi sessant'anni, la teoria della difesa delle piante ha fornito un quadro teorico, sulla base del quale i ricercatori hanno previsto un numero considerevole di evoluzioni e funzioni dei metaboliti specializzati delle piante. La maggior parte di queste teorie non segue la normale procedura di forti inferenze (41). Propongono previsioni chiave (3) allo stesso livello di analisi. Quando la verifica delle previsioni chiave consente di analizzare teorie specifiche, ciò renderà il campo in progresso. Essere supportate, ma respingere le altre (42). Invece, la nuova teoria fa previsioni a diversi livelli di analisi e aggiunge un nuovo livello di considerazioni descrittive (42). Tuttavia, le due teorie proposte a livello funzionale, MT e OD, possono essere facilmente spiegate come importanti previsioni di cambiamenti metabolici specializzati causati dagli erbivori: la teoria OD crede che i cambiamenti nello "spazio" metabolico specializzato siano altamente direzionali. La teoria MT crede che questi cambiamenti saranno non direzionali e localizzati casualmente nello spazio metabolico e tenderanno ad avere metaboliti ad alto valore di difesa. Precedenti esami delle previsioni OD e MT sono stati testati utilizzando un insieme ristretto di composti “di difesa” a priori. Questi test incentrati sui metaboliti precludono la possibilità di analizzare l’entità e la traiettoria della riconfigurazione del metaboloma durante l’erbivoria e non consentono di testare all’interno di un quadro statistico coerente per richiedere previsioni chiave che possono essere considerate nel loro insieme Quantificare i cambiamenti nel metaboloma vegetale. Qui, abbiamo utilizzato l’innovativa tecnologia in metabolomica basata sulla MS computazionale e abbiamo eseguito l’analisi MS di deconvoluzione nella valuta generale dei descrittori della teoria dell’informazione per testare la distinzione tra i due proposti a livello di metabolomica globale. La previsione chiave di questa teoria. La teoria dell’informazione è stata applicata in molti campi, specialmente nel contesto della ricerca sulla biodiversità e sul flusso di nutrienti (43). Tuttavia, per quanto ne sappiamo, questa è la prima applicazione utilizzata per descrivere lo spazio informativo metabolico delle piante e risolvere problemi ecologici relativi a cambiamenti metabolici temporanei in risposta a segnali ambientali. In particolare, la capacità di questo metodo risiede nella sua capacità di confrontare modelli all'interno e tra specie vegetali per esaminare come gli erbivori si sono evoluti da diverse specie a modelli macroevolutivi interspecifici a diversi livelli di evoluzione. Metabolismo.
L'analisi delle componenti principali (PCA) converte un set di dati multivariato in uno spazio di riduzione della dimensionalità in modo da poter spiegare la tendenza principale dei dati, quindi viene solitamente utilizzata come tecnica esplorativa per analizzare il set di dati, come ad esempio la deconvoluzione del metaboloma. Tuttavia, la riduzione della dimensionalità comporta la perdita di parte del contenuto informativo del set di dati e la PCA non può fornire informazioni quantitative su caratteristiche particolarmente rilevanti per la teoria ecologica, come ad esempio: in che modo gli erbivori riconfigurano la diversità in campi specializzati (ad esempio, ricchezza, distribuzione e abbondanza) dei metaboliti? Quali metaboliti sono predittori dello stato indotto di un dato erbivoro? Dal punto di vista della specificità, della diversità e dell'inducibilità, il contenuto informativo del profilo metabolico specifico delle foglie viene scomposto e si scopre che l'alimentazione degli erbivori può attivare un metabolismo specifico. Inaspettatamente, abbiamo osservato che, come descritto negli indicatori della teoria dell'informazione implementati, la situazione metabolica risultante presenta una grande sovrapposizione dopo gli attacchi dei due erbivori (il generalista notturno Sl) e l'esperto di Solanaceae Ms. Sebbene il loro comportamento alimentare e la concentrazione siano significativamente diversi. Iniziatore del coniugato acido grasso-amminoacido (FAC) in OS (31). Utilizzando OS erbivoro per trattare ferite da puntura standardizzate, anche il trattamento simulato dell'erbivoro ha mostrato una tendenza simile. Questa procedura standardizzata per simulare la risposta delle piante agli attacchi degli erbivori elimina i fattori confondenti causati dai cambiamenti nel comportamento alimentare degli erbivori, che portano a diversi gradi di danno in momenti diversi (34). Il FAC, che è noto per essere la causa principale di OSM, riduce JAS e altre risposte ormonali vegetali in OSS1, mentre OSS1 riduce centinaia di volte (31). Tuttavia, OSS1 ha causato livelli simili di accumulo di JA rispetto a OSM. È stato precedentemente dimostrato che la risposta JA nelle Nepenthes attenuate è molto sensibile all'OSM, dove il FAC può mantenere la sua attività anche se diluito 1:1000 con acqua (44). Pertanto, rispetto all'OSM, sebbene il FAC in OSS1 sia molto basso, è sufficiente per indurre un'esplosione di JA sufficiente. Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine ​​simili alle porine (45) e gli oligosaccaridi (46) possono essere utilizzati come indizi molecolari per innescare le risposte di difesa delle piante in OSS1. Tuttavia, non è ancora chiaro se questi elicitori in OSS1 siano responsabili dell'accumulo di JA osservato nel presente studio.
Sebbene esistano pochi studi che descrivono le impronte metaboliche differenziali causate dall'applicazione di diversi erbivori o JA o SA (acido salicilico) esogeni (47), nessuno ha perturbato la perturbazione specie-specifica dell'erbivoro nella rete erbacea della pianta e i suoi effetti sulle informazioni personali specifiche. L'impatto complessivo del metabolismo è studiato sistematicamente. Questa analisi ha ulteriormente confermato che la connessione della rete ormonale interna con altri ormoni vegetali oltre ai JA modella la specificità della riorganizzazione metabolica causata dagli erbivori. In particolare, abbiamo rilevato che l'ET causato da OSM era significativamente maggiore di quello causato da OSS1. Questa modalità è coerente con un maggiore contenuto di FAC in OSM, che è una condizione necessaria e sufficiente per innescare un burst di ET (48). Nel contesto dell'interazione tra piante ed erbivori, la funzione di segnalazione dell'ET sulla dinamica dei metaboliti specifici della pianta è ancora sporadica e si rivolge solo a un singolo gruppo di composti. Inoltre, la maggior parte degli studi ha utilizzato l'applicazione esogena di ET o dei suoi precursori o di vari inibitori per studiare la regolazione dell'ET, tra cui queste applicazioni chimiche esogene produrranno molti effetti collaterali non specifici. A nostra conoscenza, questo studio rappresenta il primo esame sistematico su larga scala del ruolo dell'ET nell'uso dell'ET per produrre e percepire piante transgeniche alterate per coordinare le dinamiche del metaboloma vegetale. L'induzione di ET specifica per gli erbivori può in definitiva modulare la risposta del metaboloma. La manipolazione transgenica più significativa è quella dei geni di biosintesi (ACO) e percezione (ETR1) dell'ET che ha rivelato l'accumulo de novo di fenolammidi specifico per gli erbivori. È stato precedentemente dimostrato che l'ET può regolare finemente l'accumulo di nicotina indotto da JA regolando la putrescina N-metiltransferasi (49). Tuttavia, da un punto di vista meccanico, non è chiaro come l'ET regoli finemente l'induzione della fenamide. Oltre alla funzione di trasduzione del segnale dell'ET, il flusso metabolico può essere deviato anche verso la S-adenosil-1-metionina per regolare l'investimento nelle poliamminofenolammidi. La S-adenosil-1-metionina è un intermedio comune dell'ET e della via biosintetica delle poliammine. Il meccanismo con cui il segnale dell'ET regola il livello di fenolammidi necessita di ulteriori studi.
Per lungo tempo, a causa dell'elevato numero di metaboliti speciali di struttura sconosciuta, l'intensa attenzione rivolta a specifiche categorie metaboliche non ha permesso di valutare con precisione le variazioni temporali della diversità metabolica a seguito di interazioni biologiche. Attualmente, sulla base di un'analisi basata sulla teoria dell'informazione, il principale risultato dell'acquisizione di spettri MS/MS basata su metaboliti non distorti è che gli erbivori che si nutrono di piante o che simulano l'attività degli erbivori continuano a ridurre la diversità metabolica complessiva del metaboloma fogliare, aumentandone al contempo il grado di specializzazione. Questo aumento temporaneo della specificità del metaboloma causato dagli erbivori è associato a un aumento sinergico della specificità del trascrittoma. La caratteristica che contribuisce maggiormente a questa maggiore specializzazione del metaboloma (avendo un valore Si più elevato) è il metabolita speciale con la funzione erbivora precedentemente caratterizzata. Questo modello è coerente con la previsione della teoria OD, ma non con la previsione della teoria MT relativa alla casualità della riprogrammazione del metaboloma. Tuttavia, questi dati sono anche coerenti con la previsione del modello misto (MT migliore; Figura 1B), poiché altri metaboliti non caratterizzati con funzioni di difesa sconosciute potrebbero comunque seguire una distribuzione casuale del Si.
Un modello notevole ulteriormente catturato da questa ricerca è che dal livello di microevoluzione (singola pianta e popolazione di tabacco) a una scala evolutiva più ampia (specie di tabacco strettamente correlate), diversi livelli di organizzazione evolutiva sono nella “migliore difesa” Ci sono differenze significative nelle capacità degli erbivori. Moore et al. (20) e Kessler e Kalske (1) hanno proposto indipendentemente di convertire i tre livelli funzionali di biodiversità originariamente distinti da Whittaker (50) nei cambiamenti temporali costitutivi e indotti della diversità chimica; questi autori non hanno riassunto Le procedure per la raccolta di dati metabolomici su larga scala inoltre non delineano come calcolare la diversità metabolica da questi dati. In questo studio, piccoli aggiustamenti alla classificazione funzionale di Whittaker considereranno la diversità metabolica α come la diversità degli spettri MS/MS in una data pianta, e la diversità metabolica β come il metabolismo intraspecifico di base di un gruppo di popolazioni Spazio, e la diversità metabolica γ sarà un'estensione dell'analisi di specie simili.
Il segnale JA è essenziale per un'ampia gamma di risposte metaboliche degli erbivori. Tuttavia, manca una rigorosa verifica quantitativa del contributo della regolazione intraspecifica della biosintesi di JA alla diversità del metaboloma, e non è ancora chiaro se il segnale JA rappresenti un sito generale per la diversificazione metabolica indotta dallo stress su una scala macroevolutiva più ampia. Abbiamo osservato che la natura erbivora delle Nepenthes induce la specializzazione del metaboloma e che la variazione della specializzazione del metaboloma all'interno della popolazione di specie di Nicotiana e tra specie di Nicotiana strettamente correlate è sistematicamente correlata positivamente con la segnalazione JA. Inoltre, quando il segnale JA è compromesso, la specificità metabolica indotta da un singolo genotipo di erbivoro viene annullata (Figura 3, C ed E). Poiché i cambiamenti dello spettro metabolico delle popolazioni di Nepenthes naturalmente attenuate sono per lo più quantitativi, i cambiamenti nella diversità e specificità metabolica β in questa analisi potrebbero essere in gran parte causati dalla forte eccitazione delle categorie di composti ricchi di metaboliti. Queste classi di composti dominano parte del profilo del metaboloma e portano a una correlazione positiva con i segnali di JA.
Poiché i meccanismi biochimici delle specie di tabacco strettamente correlate sono molto diversi, i metaboliti vengono identificati specificamente nell'aspetto qualitativo, quindi l'analisi è più approfondita. L'elaborazione del profilo metabolico acquisito tramite la teoria dell'informazione rivela che l'induzione da parte degli erbivori esacerba il compromesso tra diversità gamma metabolica e specializzazione. Il segnale JA gioca un ruolo centrale in questo compromesso. L'aumento della specializzazione del metaboloma è coerente con la principale previsione OD ed è positivamente correlato al segnale JA, mentre il segnale JA è negativamente correlato alla diversità gamma metabolica. Questi modelli indicano che la capacità OD delle piante è principalmente determinata dalla plasticità del JA, sia su scala microevolutiva che su scala evolutiva più ampia. Esperimenti di applicazione esogena di JA che aggirano i difetti di biosintesi del JA rivelano inoltre che le specie di tabacco strettamente correlate possono essere distinte in specie reattive al segnale e specie non reattive al segnale, così come la loro modalità di plasticità del JA e del metaboloma indotta dagli erbivori. Le specie non reattive al segnale non possono rispondere a causa della loro incapacità di produrre JA endogeno e sono quindi soggette a limitazioni fisiologiche. Ciò può essere causato da mutazioni in alcuni geni chiave nella via di segnalazione del JA (AOS e JAR4 in N. crescens). Questo risultato evidenzia che questi modelli macroevolutivi interspecifici possono essere principalmente guidati da cambiamenti nella percezione e nella risposta agli ormoni interni.
Oltre all'interazione tra piante ed erbivori, l'esplorazione della diversità metabolica è legata a tutti gli importanti progressi teorici nella ricerca sull'adattamento biologico all'ambiente e sull'evoluzione di tratti fenotipici complessi. Con l'aumento della quantità di dati acquisiti dai moderni strumenti MS, la verifica delle ipotesi sulla diversità metabolica può ora trascendere le differenze individuali/di categoria dei metaboliti ed eseguire analisi globali per rivelare modelli inaspettati. Nel processo di analisi su larga scala, una metafora importante è l'idea di concepire mappe significative che possano essere utilizzate per esplorare i dati. Pertanto, un risultato importante dell'attuale combinazione di metabolomica MS/MS imparziale e teoria dell'informazione è che fornisce una metrica semplice che può essere utilizzata per costruire mappe per esplorare la diversità metabolica su diverse scale tassonomiche. Questo è il requisito fondamentale di questo metodo. Lo studio della micro/macroevoluzione e dell'ecologia delle comunità.
A livello macro-evolutivo, il nucleo della teoria della coevoluzione pianta-insetto di Ehrlich e Raven (51) è quello di prevedere che la variazione della diversità metabolica interspecifica sia la causa della diversificazione dei lignaggi vegetali. Tuttavia, nei cinquant'anni trascorsi dalla pubblicazione di questo lavoro fondamentale, questa ipotesi è stata raramente testata (52). Ciò è dovuto in gran parte alle caratteristiche filogenetiche di caratteristiche metaboliche comparabili tra lignaggi vegetali a lunga distanza. La rarità può essere utilizzata per ancorare i metodi di analisi target. L'attuale flusso di lavoro MS/MS elaborato dalla teoria dell'informazione quantifica la somiglianza strutturale MS/MS di metaboliti sconosciuti (senza selezione preliminare dei metaboliti) e converte questi MS/MS in un insieme di MS/MS, quindi nel metabolismo professionale Questi modelli macro-evolutivi vengono confrontati in scala di classificazione. Semplici indicatori statistici. Il processo è simile all'analisi filogenetica, che può utilizzare l'allineamento di sequenze per quantificare il tasso di diversificazione o di evoluzione dei caratteri senza predizione preliminare.
A livello biochimico, l'ipotesi di screening di Firn e Jones (53) mostra che la diversità metabolica viene mantenuta a diversi livelli per fornire materie prime per esercitare le attività biologiche di metaboliti precedentemente non correlati o sostituiti. I metodi della teoria dell'informazione forniscono un quadro in cui queste transizioni evolutive specifiche dei metaboliti che si verificano durante la specializzazione dei metaboliti possono essere quantificate come parte del processo di screening evolutivo proposto: adattamento biologicamente attivo da bassa specificità ad alta specificità Metaboliti inibiti di un dato ambiente.
Nel complesso, agli albori della biologia molecolare, sono state sviluppate importanti teorie sulla difesa delle piante e i metodi deduttivi basati su ipotesi sono ampiamente considerati l'unico mezzo per il progresso scientifico. Ciò è dovuto in gran parte alle limitazioni tecniche della misurazione dell'intero metaboloma. Sebbene i metodi basati su ipotesi siano particolarmente utili nella scelta di altri meccanismi causali, la loro capacità di far progredire la nostra comprensione delle reti biochimiche è più limitata rispetto ai metodi computazionali attualmente disponibili nella scienza contemporanea ad alta intensità di dati. Pertanto, le teorie che non possono essere previste sono ben oltre la portata dei dati disponibili, quindi il ciclo ipotetico formula/test del progresso nel campo della ricerca non può essere abolito (4). Prevediamo che il flusso di lavoro computazionale della metabolomica qui introdotto possa riaccendere l'interesse per le questioni recenti (come) e finali (perché) della diversità metabolica e contribuire a una nuova era di scienza dei dati guidata dalla teoria. L'era ha riesaminato le importanti teorie che hanno ispirato le generazioni precedenti.
L'alimentazione diretta degli erbivori è stata effettuata allevando una larva di secondo stadio (larva Sl) su una singola foglia di pianta carnivora di colore chiaro di una singola pianta di rosa in fiore, con 10 repliche per pianta. Le larve dell'insetto sono state fissate con delle pinze e il tessuto fogliare rimanente è stato raccolto 24 e 72 ore dopo l'infezione, congelato rapidamente e i metaboliti sono stati estratti.
Simulare il trattamento erbivoro in modo altamente sincronizzato. Il metodo consiste nell'utilizzare ruote di tessuto per forare tre file di spine su ciascun lato della nervatura centrale delle tre foglie completamente espanse della pianta durante la fase di crescita della ghirlanda di tessuto e applicare immediatamente Ms diluito 1:5. Oppure utilizzare dita guantate per inserire S1 OS nella ferita da puntura. Raccogliere e lavorare una foglia come descritto sopra. Utilizzare il metodo precedentemente descritto per estrarre i metaboliti primari e gli ormoni vegetali (54).
Per le applicazioni esogene di JA, le tre foglie picciolate di ciascuna delle sei piante di rosa in fiore di ogni specie sono state trattate con 20 μl di pasta di lanolina contenente 150 μg di MeJA (Lan + MeJA), e con 20 μl di lanolina più trattamento della ferita (Lan + W), oppure sono stati utilizzati 20 μl di lanolina pura come controllo. Le foglie sono state raccolte 72 ore dopo il trattamento, congelate rapidamente in azoto liquido e conservate a -80 °C fino all'utilizzo.
Quattro linee transgeniche JA ed ET, ovvero irAOC (36), irCOI1 (55), irACO e sETR1 (48), sono state identificate nel nostro gruppo di ricerca. irAOC ha mostrato una forte diminuzione dei livelli di JA e JA-Ile, mentre irCOI1 non era sensibile ai JA. Rispetto a EV, l'accumulo di JA-Ile è aumentato. Allo stesso modo, irACO ridurrà la produzione di ET e, rispetto a EV, sETR1, che è insensibile a ET, aumenterà la produzione di ET.
Per la misurazione non invasiva dell'ET (evapotraspirazione) è stato utilizzato uno spettrometro laser fotoacustico (sensore ET in tempo reale Sensor Sense ETD-300). Immediatamente dopo il trattamento, metà delle foglie sono state tagliate e trasferite in una fiala di vetro sigillata da 4 ml, lasciando accumulare l'aria nello spazio di testa per 5 ore. Durante la misurazione, ogni fiala è stata spurgata con un flusso di 2 litri/ora di aria pura per 8 minuti, precedentemente fatta passare attraverso un catalizzatore fornito da Sensor Sense per rimuovere CO2 e acqua.
I dati del microarray sono stati originariamente pubblicati in (35) e salvati nel database completo dell'espressione genica del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (numero di accesso GSE30287). Per questo studio sono stati estratti i dati corrispondenti alle foglie causate dal trattamento W + OSMs e dal controllo non danneggiato. L'intensità grezza è log2. Prima dell'analisi statistica, la linea di base è stata convertita e normalizzata al suo 75° percentile utilizzando il pacchetto software R.
I dati originali di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) delle specie di Nicotiana sono stati recuperati dagli archivi di lettura breve NCBI (SRA), il numero di progetto è PRJNA301787, che è stato riportato da Zhou et al. (39) e procede come descritto in (56). I dati grezzi elaborati da W + W, W + OSM e W + OSS1 corrispondenti alle specie di Nicotiana sono stati selezionati per l'analisi in questo studio e sono stati elaborati nel modo seguente: in primo luogo, le letture grezze RNA-seq sono state convertite in formato FASTQ. HISAT2 converte FASTQ in SAM e SAMtools converte i file SAM in file BAM ordinati. StringTie viene utilizzato per calcolare l'espressione genica e il suo metodo di espressione è che ci sono frammenti per mille frammenti di base per milione di frammenti di trascrizione sequenziati.
La colonna cromatografica Acclaim (150 mm x 2,1 mm; dimensione delle particelle 2,2 μm) utilizzata nell'analisi e la precolonna da 4 mm x 4 mm sono costituite dallo stesso materiale. Nel sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC) Dionex UltiMate 3000 viene utilizzato il seguente gradiente binario: da 0 a 0,5 minuti, isocratico 90% A [acqua deionizzata, 0,1% (v/v) acetonitrile e 0,05% acido formico], 10% B (acetonitrile e 0,05% acido formico); da 0,5 a 23,5 minuti, la fase di gradiente è rispettivamente 10% A e 90% B; da 23,5 a 25 minuti, isocratico 10% A e 90% B. La velocità di flusso è di 400 μl/min. Per tutte le analisi MS, iniettare l'eluente della colonna in un analizzatore quadrupolo e tempo di volo (qTOF) dotato di una sorgente elettrospray operante in modalità di ionizzazione positiva (tensione capillare 4500 V; uscita capillare 130 V; temperatura di essiccazione 200 °C; flusso d'aria di essiccazione 10 litri/min).
Eseguire un'analisi dei frammenti MS/MS (di seguito denominata MS/MS) irrilevante o indistinguibile dai dati per ottenere informazioni strutturali sul profilo metabolico complessivo rilevabile. Il concetto del metodo MS/MS indiscriminato si basa sul fatto che il quadrupolo ha una finestra di isolamento di massa molto ampia [pertanto, considerare tutti i segnali del rapporto massa/carica (m/z) come frammenti]. Per questo motivo, poiché lo strumento Impact II non era in grado di creare un'inclinazione CE, sono state eseguite diverse analisi indipendenti utilizzando valori di energia di collisione (CE) di dissociazione indotta da collisione aumentati. In breve, analizzare prima il campione mediante UHPLC-ionizzazione elettrospray/qTOF-MS utilizzando la modalità di spettrometria di massa singola (condizioni di bassa frammentazione generate dalla frammentazione in sorgente), scansionando da m/z 50 a 1500 a una frequenza di ripetizione di 5 Hz. Utilizzare azoto come gas di collisione per l'analisi MS/MS ed eseguire misurazioni indipendenti alle seguenti quattro diverse tensioni di dissociazione indotta da collisione: 20, 30, 40 e 50 eV. Durante l'intero processo di misurazione, il quadrupolo ha la finestra di isolamento di massa più ampia, da m/z 50 a 1500. Quando l'esperimento m/z e larghezza di isolamento del corpo anteriore è impostato su 200, l'intervallo di massa viene attivato automaticamente dal software operativo dello strumento e 0 Da. Scansionare i frammenti di massa come in modalità massa singola. Utilizzare formiato di sodio (50 ml di isopropanolo, 200 μl di acido formico e 1 ml di soluzione acquosa di NaOH 1M) per la calibrazione di massa. Utilizzando l'algoritmo di calibrazione ad alta precisione di Bruker, il file di dati viene calibrato dopo aver eseguito lo spettro medio in un dato periodo di tempo. Utilizzare la funzione di esportazione del software Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Brema, Germania) per convertire i file di dati grezzi in formato NetCDF. Il set di dati MS/MS è stato salvato nel database aperto di metabolomica MetaboLights (www.ebi.ac.uk) con il numero di accesso MTBLS1471.
L'assemblaggio MS/MS può essere realizzato tramite l'analisi di correlazione tra i segnali di qualità MS1 e MS/MS per bassa e alta energia di collisione e le regole recentemente implementate. Lo script R viene utilizzato per realizzare l'analisi di correlazione della distribuzione del precursore al prodotto, e lo script C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) viene utilizzato per implementare le regole.
Al fine di ridurre gli errori di falso positivo causati dal rumore di fondo e le false correlazioni dovute al rilevamento di determinate caratteristiche m/z in pochi campioni, utilizziamo la funzione "filled peak" del pacchetto R XCMS (per la correzione del rumore di fondo) per sostituire l'intensità "NA" (picco non rilevato). Quando si utilizza la funzione fill peak, nel set di dati sono ancora presenti molti valori di intensità "0" che influenzano il calcolo della correlazione. Successivamente, confrontiamo i risultati dell'elaborazione dei dati ottenuti con e senza l'utilizzo della funzione fill peak, calcoliamo il valore del rumore di fondo in base al valore medio stimato corretto e quindi sostituiamo questi valori di intensità 0 con il valore di fondo calcolato. Abbiamo inoltre considerato solo le caratteristiche la cui intensità superava di tre volte il valore di fondo e le abbiamo considerate come "picchi veri". Per i calcoli PCC, vengono considerati solo i segnali m/z del precursore del campione (MS1) e i set di dati dei frammenti con almeno otto picchi veri.
Se l'intensità della caratteristica di qualità del precursore nell'intero campione è significativamente correlata con l'intensità ridotta della stessa caratteristica di qualità sottoposta a bassa o alta energia di collisione, e la caratteristica non è etichettata come picco isotopico da CAMERA, può essere ulteriormente definita. Quindi, calcolando tutte le possibili coppie precursore-prodotto entro 3 s (la finestra temporale di ritenzione stimata per la ritenzione del picco), viene eseguita l'analisi di correlazione. Solo quando il valore m/z è inferiore al valore del precursore e la frammentazione MS/MS si verifica nella stessa posizione del campione nel set di dati del precursore da cui deriva, viene considerato un frammento.
Sulla base di queste due semplici regole, escludiamo i frammenti specificati con valori m/z superiori a quelli del precursore identificato, in base alla posizione del campione in cui appare il precursore e il frammento specificato. È anche possibile selezionare le caratteristiche qualitative generate da molti frammenti in-source generati in modalità MS1 come potenziali precursori, generando così composti MS/MS ridondanti. Per ridurre questa ridondanza dei dati, se la similarità NDP degli spettri supera 0,6 e appartengono al cromatogramma "pcgroup" annotato da CAMERA, li uniamo. Infine, uniamo tutti e quattro i risultati CE associati al precursore e ai frammenti nello spettro composito deconvoluto finale, selezionando il picco di intensità più elevata tra tutti i picchi candidati con lo stesso valore m/z a diverse energie di collisione. Le fasi di elaborazione successive si basano sul concetto di spettro composito e tengono conto delle diverse condizioni CE necessarie per massimizzare la probabilità di frammentazione, poiché alcuni frammenti possono essere rilevati solo a una specifica energia di collisione.
RDPI (30) è stato utilizzato per calcolare l'inducibilità del profilo metabolico. La diversità dello spettro metabolico (indice Hj) è derivata dall'abbondanza dei precursori MS/MS utilizzando l'entropia di Shannon della distribuzione di frequenza MS/MS utilizzando la seguente equazione descritta da Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) dove Pij corrisponde alla frequenza relativa dell'i-esimo MS/MS nel j-esimo campione (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
La specificità metabolica (indice Si) è definita come l'identità di espressione di un dato MS/MS in relazione alla frequenza tra i campioni considerati. La specificità MS/MS è calcolata come Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Utilizzare la seguente formula per misurare l'indice δj specifico del metaboloma di ciascun campione j e la media della specificità MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Gli spettri MS/MS vengono allineati a coppie e la similarità viene calcolata in base ai due punteggi. Innanzitutto, utilizzando il metodo NDP standard (noto anche come metodo di correlazione coseno), si utilizza la seguente equazione per calcolare la similarità del segmento tra gli spettri: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 dove S1 e S2 sono rispettivamente. Per lo spettro 1 e lo spettro 2, così come per WS1, i e WS2, i rappresenta il peso basato sull'intensità del picco in modo che la differenza del picco comune i-esimo tra i due spettri sia inferiore a 0,01 Da. Il peso viene calcolato come segue: W = [intensità del picco] m [qualità] n, m = 0,5, n = 2, come suggerito da MassBank.
È stato implementato un secondo metodo di punteggio, che prevedeva l'analisi degli NL condivisi tra MS/MS. A tal fine, abbiamo utilizzato in tandem le 52 liste di NL frequentemente riscontrate durante il processo di frammentazione MS e gli NL più specifici (file di dati S1) che sono stati precedentemente annotati per lo spettro MS/MS dei metaboliti secondari delle specie di Nepenthes indebolite (9, 26). Creare un vettore binario di 1 e 0 per ogni MS/MS, corrispondente rispettivamente alla presenza e all'assenza di alcuni NL. In base alla similarità della distanza euclidea, viene calcolato il punteggio di similarità degli NL per ogni coppia di vettori binari di NL.
Per eseguire il clustering duale, abbiamo utilizzato il pacchetto R DiffCoEx, basato su un'estensione dell'analisi di co-espressione genica ponderata (WGCNA). Utilizzando le matrici di punteggio NDP e NL degli spettri MS/MS, abbiamo utilizzato DiffCoEx per calcolare la matrice di correlazione comparativa. Il clustering binario viene eseguito impostando il parametro "cutreeDynamic" su method = "hybrid", cutHeight = 0,9999, deepSplit = T e minClusterSize = 10. Il codice sorgente R di DiffCoEx è stato scaricato dal file aggiuntivo 1 da Tesson et al. (57); il pacchetto software R WGCNA richiesto può essere trovato in https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Per eseguire l'analisi della rete molecolare MS/MS, abbiamo calcolato la connettività spettrale accoppiata in base ai tipi di similarità NDP e NL e abbiamo utilizzato il software Cytoscape per visualizzare la topologia della rete utilizzando il layout organico nell'applicazione di estensione dell'algoritmo di layout yFiles di CyFilescape.
Per l'analisi statistica dei dati è stata utilizzata la versione 3.0.1 di R. La significatività statistica è stata valutata mediante analisi della varianza a due vie (ANOVA), seguita dal test post-hoc di Tukey per la differenza onestamente significativa (HSD). Per analizzare la differenza tra il trattamento erbivoro e il controllo, è stata analizzata la distribuzione a due code dei due gruppi di campioni con la stessa varianza utilizzando il test t di Student.
Per consultare il materiale supplementare relativo a questo articolo, si prega di visitare il sito http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
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La teoria dell'informazione fornisce una valuta universale per il confronto di metabolomi specifici e per la previsione di teorie di difesa nei test.
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©2021 Associazione americana per il progresso della scienza. tutti i diritti riservati. AAAS è partner di HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.