Grazie per aver visitato nature.com. La versione del browser che stai utilizzando ha un supporto CSS limitato. Per un'esperienza ottimale, ti consigliamo di utilizzare la versione più recente del browser (o di disattivare la modalità compatibilità in Internet Explorer). Inoltre, per garantire un supporto continuo, questo sito non includerà stili o JavaScript.
Le tempeste di polvere rappresentano una seria minaccia per molti paesi in tutto il mondo a causa del loro impatto distruttivo sull'agricoltura, sulla salute umana, sulle reti di trasporto e sulle infrastrutture. Di conseguenza, l'erosione eolica è considerata un problema globale. Uno degli approcci ecocompatibili per frenare l'erosione eolica è l'uso della precipitazione carbonatica indotta microbica (MICP). Tuttavia, i sottoprodotti della MICP basata sulla degradazione dell'urea, come l'ammoniaca, non sono ideali se prodotti in grandi quantità. Questo studio presenta due formulazioni di batteri del formiato di calcio per la degradazione della MICP senza produrre urea e confronta in modo completo le loro prestazioni con due formulazioni di batteri dell'acetato di calcio non produttori di ammoniaca. I batteri considerati sono Bacillus subtilis e Bacillus amyloliquefaciens. In primo luogo, sono stati determinati i valori ottimizzati dei fattori che controllano la formazione di CaCO3. Sono stati quindi condotti test in galleria del vento su campioni di dune di sabbia trattati con le formulazioni ottimizzate e sono state misurate la resistenza all'erosione eolica, la velocità di soglia di stripping e la resistenza al bombardamento di sabbia. Gli allomorfi di carbonato di calcio (CaCO3) sono stati valutati utilizzando microscopia ottica, microscopia elettronica a scansione (SEM) e analisi di diffrazione a raggi X. Le formulazioni a base di formiato di calcio hanno ottenuto risultati significativamente migliori rispetto a quelle a base di acetato in termini di formazione di carbonato di calcio. Inoltre, B. subtilis ha prodotto più carbonato di calcio rispetto a B. amyloliquefaciens. Le micrografie SEM hanno mostrato chiaramente il legame e l'imprinting di batteri attivi e inattivi sul carbonato di calcio causato dalla sedimentazione. Tutte le formulazioni hanno ridotto significativamente l'erosione eolica.
L'erosione eolica è da tempo riconosciuta come un grave problema che affligge le regioni aride e semi-aride come gli Stati Uniti sudoccidentali, la Cina occidentale, l'Africa sahariana e gran parte del Medio Oriente1. Le scarse precipitazioni nei climi aridi e iper-aridi hanno trasformato gran parte di queste regioni in deserti, dune di sabbia e terreni incolti. La continua erosione eolica rappresenta una minaccia ambientale per le infrastrutture come le reti di trasporto, i terreni agricoli e industriali, causando cattive condizioni di vita e alti costi di sviluppo urbano in queste regioni2,3,4. È importante sottolineare che l'erosione eolica non solo ha un impatto sul luogo in cui si verifica, ma causa anche problemi sanitari ed economici nelle comunità remote poiché trasporta particelle attraverso il vento in aree lontane dalla fonte5,6.
Il controllo dell'erosione eolica rimane un problema globale. Diversi metodi di stabilizzazione del suolo vengono utilizzati per controllare l'erosione eolica. Questi metodi includono materiali come l'applicazione di acqua7, pacciamature oleose8, biopolimeri5, precipitazione carbonatica indotta da microbi (MICP)9,10,11,12 e precipitazione carbonatica indotta da enzimi (EICP)1. La bagnatura del terreno è un metodo standard per l'abbattimento delle polveri in campo. Tuttavia, la sua rapida evaporazione rende questo metodo di limitata efficacia nelle regioni aride e semi-aride1. L'applicazione di composti per pacciamatura oleosa aumenta la coesione della sabbia e l'attrito interparticellare. La loro proprietà coesiva lega insieme i granelli di sabbia; tuttavia, le pacciamature oleose presentano anche altri problemi: il loro colore scuro aumenta l'assorbimento di calore e porta alla morte di piante e microrganismi. Il loro odore e i loro fumi possono causare problemi respiratori e, soprattutto, il loro costo elevato rappresenta un ulteriore ostacolo. I biopolimeri sono uno dei metodi ecocompatibili recentemente proposti per mitigare l'erosione eolica; vengono estratti da fonti naturali come piante, animali e batteri. Gomma di xantano, gomma di guar, chitosano e gomma di gellano sono i biopolimeri più comunemente utilizzati nelle applicazioni ingegneristiche5. Tuttavia, i biopolimeri idrosolubili possono perdere resistenza e dilavarsi dal terreno se esposti all'acqua13,14. L'EICP ha dimostrato di essere un metodo efficace di soppressione delle polveri per una varietà di applicazioni, tra cui strade sterrate, bacini di decantazione e cantieri edili. Sebbene i suoi risultati siano incoraggianti, devono essere considerati alcuni potenziali svantaggi, come il costo e la mancanza di siti di nucleazione (che accelera la formazione e la precipitazione dei cristalli di CaCO315,16).
La MICP fu descritta per la prima volta alla fine del XIX secolo da Murray e Irwin (1890) e Steinmann (1901) nel loro studio sulla degradazione dell'urea da parte di microrganismi marini17. La MICP è un processo biologico naturale che coinvolge una varietà di attività microbiche e processi chimici in cui il carbonato di calcio viene precipitato dalla reazione degli ioni carbonato provenienti dai metaboliti microbici con gli ioni calcio presenti nell'ambiente18,19. La MICP che coinvolge il ciclo dell'azoto degradante l'urea (MICP degradante l'urea) è il tipo più comune di precipitazione del carbonato indotta da microbi, in cui l'ureasi prodotta dai batteri catalizza l'idrolisi dell'urea20,21,22,23,24,25,26,27 come segue:
Nella MICP che coinvolge il ciclo del carbonio dell'ossidazione dei sali organici (MICP senza degradazione dell'urea), i batteri eterotrofi utilizzano sali organici come acetato, lattato, citrato, succinato, ossalato, malato e gliossilato come fonti di energia per produrre minerali carbonatici28. In presenza di lattato di calcio come fonte di carbonio e ioni calcio, la reazione chimica di formazione del carbonato di calcio è mostrata nell'equazione (5).
Nel processo MICP, le cellule batteriche forniscono siti di nucleazione particolarmente importanti per la precipitazione del carbonato di calcio; la superficie cellulare batterica è caricata negativamente e può fungere da adsorbente per cationi bivalenti come gli ioni calcio. Adsorbendo gli ioni calcio sulle cellule batteriche, quando la concentrazione di ioni carbonato è sufficiente, i cationi calcio e gli anioni carbonato reagiscono e il carbonato di calcio viene precipitato sulla superficie batterica29,30. Il processo può essere riassunto come segue31,32:
I cristalli di carbonato di calcio biogenerati possono essere suddivisi in tre tipi: calcite, vaterite e aragonite. Tra questi, calcite e vaterite sono gli allomorfi di carbonato di calcio indotti battericamente più comuni33,34. La calcite è l'allomorfo di carbonato di calcio più stabile termodinamicamente35. Sebbene sia stato riportato che la vaterite sia metastabile, alla fine si trasforma in calcite36,37. La vaterite è il più denso di questi cristalli. È un cristallo esagonale che ha una migliore capacità di riempimento dei pori rispetto ad altri cristalli di carbonato di calcio grazie alle sue maggiori dimensioni38. Sia la MICP degradata dall'urea che quella non degradata possono portare alla precipitazione di vaterite13,39,40,41.
Sebbene la MICP abbia mostrato un potenziale promettente nella stabilizzazione di terreni problematici e suscettibili all'erosione eolica42,43,44,45,46,47,48, uno dei sottoprodotti dell'idrolisi dell'urea è l'ammoniaca, che può causare problemi di salute da lievi a gravi a seconda del livello di esposizione49. Questo effetto collaterale rende controverso l'uso di questa particolare tecnologia, soprattutto quando è necessario trattare ampie aree, come ad esempio per l'abbattimento delle polveri. Inoltre, l'odore dell'ammoniaca è intollerabile quando il processo viene eseguito ad alte velocità di applicazione e grandi volumi, il che può influire sulla sua applicabilità pratica. Sebbene studi recenti abbiano dimostrato che gli ioni ammonio possono essere ridotti convertendoli in altri prodotti come la struvite, questi metodi non rimuovono completamente gli ioni ammonio50. Pertanto, è ancora necessario esplorare soluzioni alternative che non generino ioni ammonio. L'uso di percorsi di degradazione diversi dall'urea per la MICP potrebbe fornire una potenziale soluzione che è stata scarsamente esplorata nel contesto della mitigazione dell'erosione eolica. Fattahi et al. hanno studiato la degradazione del MICP senza urea utilizzando acetato di calcio e Bacillus megaterium41, mentre Mohebbi et al. hanno utilizzato acetato di calcio e Bacillus amyloliquefaciens9. Tuttavia, il loro studio non è stato confrontato con altre fonti di calcio e batteri eterotrofi che potrebbero in definitiva migliorare la resistenza all'erosione eolica. Vi è inoltre una mancanza di letteratura che confronti i percorsi di degradazione senza urea con i percorsi di degradazione dell'urea nella mitigazione dell'erosione eolica.
Inoltre, la maggior parte degli studi sull'erosione eolica e sul controllo delle polveri sono stati condotti su campioni di terreno con superfici piane.1,51,52,53 Tuttavia, le superfici piane sono meno comuni in natura rispetto a colline e depressioni. Questo è il motivo per cui le dune di sabbia sono l'elemento paesaggistico più comune nelle regioni desertiche.
Per superare le carenze sopra menzionate, questo studio mirava a introdurre una nuova serie di agenti batterici non produttori di ammoniaca. A tal fine, abbiamo considerato percorsi di degradazione della MICP non ureica. È stata studiata l'efficienza di due fonti di calcio (formiato di calcio e acetato di calcio). Per quanto a conoscenza degli autori, la precipitazione del carbonato utilizzando due combinazioni di fonti di calcio e batteri (ovvero formiato di calcio-Bacillus subtilis e formiato di calcio-Bacillus amyloliquefaciens) non è stata studiata in studi precedenti. La scelta di questi batteri si è basata sugli enzimi da essi prodotti, che catalizzano l'ossidazione del formiato di calcio e dell'acetato di calcio per formare la precipitazione microbica del carbonato. Abbiamo progettato uno studio sperimentale approfondito per individuare i fattori ottimali quali pH, tipi di batteri e fonti di calcio e relative concentrazioni, il rapporto tra batteri e soluzione di origine di calcio e il tempo di polimerizzazione. Infine, l'efficacia di questo insieme di agenti batterici nel sopprimere l'erosione eolica attraverso la precipitazione di carbonato di calcio è stata studiata eseguendo una serie di test in galleria del vento su dune di sabbia per determinare l'entità dell'erosione eolica, la velocità di rottura della soglia e la resistenza al bombardamento del vento della sabbia; sono state inoltre eseguite misurazioni penetrometriche e studi microstrutturali (ad esempio analisi di diffrazione dei raggi X (XRD) e microscopia elettronica a scansione (SEM))
La produzione di carbonato di calcio richiede ioni calcio e ioni carbonato. Gli ioni calcio possono essere ottenuti da varie fonti di calcio come cloruro di calcio, idrossido di calcio e latte scremato in polvere54,55. Gli ioni carbonato possono essere prodotti con vari metodi microbici come l'idrolisi dell'urea e l'ossidazione aerobica o anaerobica di materia organica56. In questo studio, gli ioni carbonato sono stati ottenuti dalla reazione di ossidazione di formiato e acetato. Inoltre, abbiamo utilizzato sali di calcio di formiato e acetato per produrre carbonato di calcio puro, ottenendo così solo CO₂ e H₂O come sottoprodotti. In questo processo, una sola sostanza funge da fonte di calcio e da fonte di carbonato, e non viene prodotta ammoniaca. Queste caratteristiche rendono il metodo di produzione di fonte di calcio e carbonato che abbiamo considerato molto promettente.
Le corrispondenti reazioni del formiato di calcio e dell'acetato di calcio per formare carbonato di calcio sono illustrate nelle formule (7)-(14). Le formule (7)-(11) mostrano che il formiato di calcio si dissolve in acqua per formare acido formico o formiato. La soluzione è quindi una fonte di ioni calcio e idrossido liberi (formule 8 e 9). Come risultato dell'ossidazione dell'acido formico, gli atomi di carbonio nell'acido formico vengono convertiti in anidride carbonica (formula 10). Alla fine si forma carbonato di calcio (formule 11 e 12).
Allo stesso modo, il carbonato di calcio si forma dall'acetato di calcio (equazioni 13–15), con la differenza che al posto dell'acido formico si forma acido acetico o acetato.
Senza la presenza di enzimi, acetato e formiato non possono essere ossidati a temperatura ambiente. FDH (formiato deidrogenasi) e CoA (coenzima A) catalizzano l'ossidazione di formiato e acetato per formare anidride carbonica, rispettivamente (Eq. 16, 17) 57, 58, 59. Vari batteri sono in grado di produrre questi enzimi e in questo studio sono stati utilizzati batteri eterotrofi, ovvero Bacillus subtilis (PTCC #1204 (Persian Type Culture Collection), noto anche come NCIMB #13061 (International Collection of Bacteria, Yeast, Phage, Plasmids, Plant Seeds and Plant Cell Tissue Cultures)) e Bacillus amyloliquefaciens (PTCC #1732, NCIMB #12077). Questi batteri sono stati coltivati ​​in un terreno contenente peptone di carne (5 g/L) ed estratto di carne (3 g/L), denominato brodo nutritivo (NBR) (105443 Merck).
Sono state quindi preparate quattro formulazioni per indurre la precipitazione del carbonato di calcio utilizzando due fonti di calcio e due batteri: formiato di calcio e Bacillus subtilis (FS), formiato di calcio e Bacillus amyloliquefaciens (FA), acetato di calcio e Bacillus subtilis (AS) e acetato di calcio e Bacillus amyloliquefaciens (AA).
Nella prima parte del disegno sperimentale, sono stati condotti test per determinare la combinazione ottimale che avrebbe consentito di ottenere la massima produzione di carbonato di calcio. Poiché i campioni di terreno contenevano carbonato di calcio, è stata progettata una serie di test di valutazione preliminare per misurare accuratamente la CaCO3 prodotta dalle diverse combinazioni, e sono state valutate miscele di terreno di coltura e soluzioni di fonte di calcio. Per ciascuna combinazione di fonte di calcio e soluzione batterica definita sopra (FS, FA, AS e AA), sono stati derivati ​​fattori di ottimizzazione (concentrazione della fonte di calcio, tempo di polimerizzazione, concentrazione della soluzione batterica misurata dalla densità ottica della soluzione (OD), rapporto tra fonte di calcio e soluzione batterica e pH) e utilizzati nei test in galleria del vento per il trattamento delle dune di sabbia descritti nelle sezioni seguenti.
Per ciascuna combinazione, sono stati condotti 150 esperimenti per studiare l'effetto della precipitazione di CaCO3 e valutare vari fattori, in particolare la concentrazione della fonte di calcio, il tempo di polimerizzazione, il valore di densità ottica batterica, il rapporto tra fonte di calcio e soluzione batterica e il pH durante l'ossidazione aerobica della materia organica (Tabella 1). L'intervallo di pH per il processo ottimizzato è stato selezionato in base alle curve di crescita di Bacillus subtilis e Bacillus amyloliquefaciens, al fine di ottenere una crescita più rapida. Questo aspetto è spiegato più dettagliatamente nella sezione Risultati.
Per preparare i campioni per la fase di ottimizzazione sono stati utilizzati i seguenti passaggi. La soluzione MICP è stata inizialmente preparata regolando il pH iniziale del terreno di coltura e poi autoclavata a 121 °C per 15 minuti. Il ceppo è stato quindi inoculato in un flusso d'aria laminare e mantenuto in un incubatore agitante a 30 °C e 180 giri al minuto. Una volta che la densità ottica dei batteri ha raggiunto il livello desiderato, è stata miscelata con la soluzione di calcio nella proporzione desiderata (Figura 1a). La soluzione MICP è stata lasciata reagire e solidificare in un incubatore agitante a 220 giri al minuto e 30 °C per un tempo che ha raggiunto il valore target. Il CaCO3 precipitato è stato separato dopo centrifugazione a 6000 g per 5 minuti e quindi essiccato a 40 °C per preparare i campioni per il test al calcimetro (Figura 1b). La precipitazione di CaCO3 è stata quindi misurata utilizzando un calcimetro Bernard, in cui la polvere di CaCO3 reagisce con HCl 1,0 N (ASTM-D4373-02) per produrre CO2; il volume di questo gas è una misura del contenuto di CaCO3 (Figura 1c). Per convertire il volume di CO2 in contenuto di CaCO3, è stata generata una curva di calibrazione lavando la polvere di CaCO3 pura con HCl 1 N e riportandola in funzione della CO2 sviluppata. La morfologia e la purezza della polvere di CaCO3 precipitata sono state studiate utilizzando immagini SEM e analisi XRD. Un microscopio ottico con un ingrandimento di 1000 è stato utilizzato per studiare la formazione di carbonato di calcio attorno ai batteri, la fase del carbonato di calcio formato e l'attività dei batteri.
Il bacino di Dejegh è una nota regione altamente erosa nella provincia sud-occidentale di Fars, in Iran, e i ricercatori hanno raccolto campioni di terreno eroso dal vento dall'area. I campioni sono stati prelevati dalla superficie del terreno per lo studio. I test indicatori sui campioni di terreno hanno mostrato che il terreno era sabbioso scarsamente selezionato con limo ed è stato classificato come SP-SM secondo il Sistema di Classificazione Unificato dei Suoli (USC) (Figura 2a). L'analisi XRD ha mostrato che il terreno di Dejegh era composto principalmente da calcite e quarzo (Figura 2b). Inoltre, l'analisi EDX ha mostrato che altri elementi come Al, K e Fe erano presenti anche in proporzioni minori.
Per preparare le dune di laboratorio per i test di erosione eolica, il terreno è stato frantumato da un'altezza di 170 mm attraverso un imbuto di 10 mm di diametro fino a raggiungere una superficie compatta, ottenendo una duna tipica di 60 mm di altezza e 210 mm di diametro. In natura, le dune di sabbia a più bassa densità si formano tramite processi eolici. Analogamente, il campione preparato con la procedura sopra descritta presentava la densità relativa più bassa, γ = 14,14 kN/m³, formando un cono di sabbia depositato su una superficie orizzontale con un angolo di riposo di circa 29,7°.
La soluzione MICP ottimale ottenuta nella sezione precedente è stata spruzzata sul pendio della duna con velocità di applicazione di 1, 2 e 3 lm-2 e poi i campioni sono stati conservati in un'incubatrice a 30 °C (Fig. 3) per 9 giorni (ovvero il tempo di polimerizzazione ottimale) e poi estratti per i test nella galleria del vento.
Per ciascun trattamento, sono stati preparati quattro provini, uno per misurare il contenuto di carbonato di calcio e la resistenza superficiale utilizzando un penetrometro, e i restanti tre provini sono stati utilizzati per test di erosione a tre diverse velocità. Nei test in galleria del vento, l'entità dell'erosione è stata determinata a diverse velocità del vento, quindi la velocità di rottura soglia per ciascun provino di trattamento è stata determinata utilizzando un grafico che mostra l'entità dell'erosione in funzione della velocità del vento. Oltre ai test di erosione eolica, i provini trattati sono stati sottoposti a bombardamento di sabbia (ovvero esperimenti di salto). A tale scopo sono stati preparati due provini aggiuntivi con velocità di applicazione di 2 e 3 L m−2. Il test di bombardamento di sabbia è durato 15 minuti con un flusso di 120 g m−1, che rientra nell'intervallo di valori selezionati in studi precedenti60,61,62. La distanza orizzontale tra l'ugello abrasivo e la base della duna era di 800 mm, situata 100 mm sopra il fondo della galleria. Questa posizione è stata impostata in modo che quasi tutte le particelle di sabbia saltate cadessero sulla duna.
Il test in galleria del vento è stato condotto in una galleria del vento aperta, lunga 8 m, larga 0,4 m e alta 1 m (Figura 4a). La galleria del vento è realizzata in lamiera di acciaio zincato e può generare una velocità del vento fino a 25 m/s. Inoltre, un convertitore di frequenza viene utilizzato per regolare la frequenza del ventilatore e aumentarla gradualmente fino a raggiungere la velocità del vento desiderata. La Figura 4b mostra lo schema delle dune di sabbia erose dal vento e il profilo della velocità del vento misurata nella galleria del vento.
Infine, per confrontare i risultati della formulazione di MICP non urealitica proposta in questo studio con i risultati del test di controllo MICP urealitico, i campioni di duna sono stati preparati e trattati con una soluzione biologica contenente urea, cloruro di calcio e Sporosarcina pasteurii (poiché Sporosarcina pasteurii ha una significativa capacità di produrre ureasi63). La densità ottica della soluzione batterica era 1,5 e le concentrazioni di urea e cloruro di calcio erano 1 M (selezionate in base ai valori raccomandati in studi precedenti36,64,65). Il terreno di coltura era costituito da brodo nutritivo (8 g/L) e urea (20 g/L). La soluzione batterica è stata spruzzata sulla superficie della duna e lasciata agire per 24 ore per l'adesione batterica. Dopo 24 ore di adesione, è stata spruzzata una soluzione cementante (cloruro di calcio e urea). Il test di controllo MICP urealitico è di seguito denominato UMC. Il contenuto di carbonato di calcio nei campioni di terreno trattati urealiticamente e non urealiticamente è stato ottenuto mediante lavaggio secondo la procedura proposta da Choi et al.66
La Figura 5 mostra le curve di crescita di Bacillus amyloliquefaciens e Bacillus subtilis nel terreno di coltura (soluzione nutritiva) con un intervallo di pH iniziale compreso tra 5 e 10. Come mostrato in figura, Bacillus amyloliquefaciens e Bacillus subtilis sono cresciuti più rapidamente a pH rispettivamente 6-8 e 7-9. Pertanto, questo intervallo di pH è stato adottato nella fase di ottimizzazione.
Curve di crescita di (a) Bacillus amyloliquefaciens e (b) Bacillus subtilis a diversi valori iniziali di pH del mezzo nutritivo.
La Figura 6 mostra la quantità di anidride carbonica prodotta nel limemetro Bernard, che rappresenta il carbonato di calcio precipitato (CaCO3). Poiché un fattore è stato fissato in ciascuna combinazione e gli altri fattori sono stati variati, ogni punto su questi grafici corrisponde al volume massimo di anidride carbonica in quella serie di esperimenti. Come mostrato in figura, all'aumentare della concentrazione della fonte di calcio, è aumentata la produzione di carbonato di calcio. Pertanto, la concentrazione della fonte di calcio influenza direttamente la produzione di carbonato di calcio. Poiché la fonte di calcio e la fonte di carbonio sono le stesse (ovvero, formiato di calcio e acetato di calcio), più ioni calcio vengono rilasciati, maggiore è la quantità di carbonato di calcio formata (Figura 6a). Nelle formulazioni AS e AA, la produzione di carbonato di calcio ha continuato ad aumentare con l'aumentare del tempo di polimerizzazione fino a quando la quantità di precipitato è rimasta pressoché invariata dopo 9 giorni. Nella formulazione FA, il tasso di formazione di carbonato di calcio è diminuito quando il tempo di polimerizzazione ha superato i 6 giorni. Rispetto ad altre formulazioni, la formulazione FS ha mostrato un tasso di formazione di carbonato di calcio relativamente basso dopo 3 giorni (Figura 6b). Nelle formulazioni FA e FS, il 70% e l'87% della produzione totale di carbonato di calcio è stata ottenuta dopo tre giorni, mentre nelle formulazioni AA e AS, questa percentuale era rispettivamente solo del 46% e del 45%. Ciò indica che la formulazione a base di acido formico presenta una velocità di formazione di CaCO3 più elevata nella fase iniziale rispetto alla formulazione a base di acetato. Tuttavia, la velocità di formazione rallenta con l'aumentare del tempo di polimerizzazione. Dalla Figura 6c si può concludere che anche a concentrazioni batteriche superiori a OD1, non vi è alcun contributo significativo alla formazione di carbonato di calcio.
Variazione del volume di CO2 (e corrispondente contenuto di CaCO3) misurato dal calcimetro Bernard in funzione di (a) concentrazione della fonte di calcio, (b) tempo di presa, (c) OD, (d) pH iniziale, (e) rapporto tra fonte di calcio e soluzione batterica (per ciascuna formulazione); e (f) quantità massima di carbonato di calcio prodotto per ciascuna combinazione di fonte di calcio e batteri.
Per quanto riguarda l'effetto del pH iniziale del mezzo, la Figura 6d mostra che per FA e FS, la produzione di CaCO3 ha raggiunto un valore massimo a pH 7. Questa osservazione è coerente con studi precedenti secondo cui gli enzimi FDH sono più stabili a pH 7-6,7. Tuttavia, per AA e AS, la precipitazione di CaCO3 è aumentata quando il pH ha superato 7. Studi precedenti hanno anche dimostrato che l'intervallo di pH ottimale per l'attività enzimatica del CoA è compreso tra 8 e 9,2-6,8. Considerando che gli intervalli di pH ottimali per l'attività enzimatica del CoA e la crescita di B. amyloliquefaciens sono rispettivamente (8-9,2) e (6-8) (Figura 5a), si prevede che il pH ottimale della formulazione di AA sia 8, e i due intervalli di pH si sovrappongono. Questo fatto è stato confermato dagli esperimenti, come mostrato nella Figura 6d. Poiché il pH ottimale per la crescita di B. subtilis è 7-9 (Figura 5b) e il pH ottimale per l'attività enzimatica del CoA è 8-9,2, si prevede che la massima resa di precipitazione di CaCO3 sia compresa nell'intervallo di pH 8-9, il che è confermato dalla Figura 6d (ovvero, il pH ottimale di precipitazione è 9). I risultati mostrati nella Figura 6e indicano che il rapporto ottimale tra soluzione di origine di calcio e soluzione batterica è 1 sia per le soluzioni di acetato che di formiato. A scopo di confronto, le prestazioni di diverse formulazioni (ovvero AA, AS, FA e FS) sono state valutate in base alla massima produzione di CaCO3 in diverse condizioni (ovvero, concentrazione della fonte di calcio, tempo di polimerizzazione, OD, rapporto tra fonte di calcio e soluzione batterica e pH iniziale). Tra le formulazioni studiate, la formulazione FS ha prodotto la più alta produzione di CaCO3, che era circa tre volte superiore a quella della formulazione AA (Figura 6f). Sono stati condotti quattro esperimenti di controllo senza batteri per entrambe le fonti di calcio e non è stata osservata alcuna precipitazione di CaCO3 dopo 30 giorni.
Le immagini di microscopia ottica di tutte le formulazioni hanno mostrato che la vaterite era la fase principale in cui si formava il carbonato di calcio (Figura 7). I cristalli di vaterite erano di forma sferica69,70,71. Si è scoperto che il carbonato di calcio precipitava sulle cellule batteriche perché la superficie delle cellule batteriche era carica negativamente e poteva agire come adsorbente per i cationi bivalenti. Prendendo la formulazione FS come esempio in questo studio, dopo 24 ore, il carbonato di calcio ha iniziato a formarsi su alcune cellule batteriche (Figura 7a) e dopo 48 ore, il numero di cellule batteriche rivestite di carbonato di calcio è aumentato significativamente. Inoltre, come mostrato in Figura 7b, è stato possibile rilevare anche particelle di vaterite. Infine, dopo 72 ore, un gran numero di batteri sembrava essere legato dai cristalli di vaterite e il numero di particelle di vaterite è aumentato significativamente (Figura 7c).
Osservazioni di microscopia ottica della precipitazione di CaCO3 nelle composizioni FS nel tempo: (a) 24, (b) 48 e (c) 72 ore.
Per approfondire la morfologia della fase precipitata, sono state eseguite analisi di diffrazione dei raggi X (XRD) e SEM delle polveri. Gli spettri XRD (Fig. 8a) e le micrografie SEM (Fig. 8b, c) hanno confermato la presenza di cristalli di vaterite, che presentavano una forma a lattuga e una corrispondenza tra i picchi di vaterite e quelli del precipitato.
(a) Confronto degli spettri di diffrazione dei raggi X del CaCO3 formato e della vaterite. Micrografie SEM della vaterite rispettivamente a (b) 1 kHz e (c) 5,27 kHz di ingrandimento.
I risultati dei test in galleria del vento sono mostrati nelle Figure 9a e b. Dalla Figura 9a si può osservare che la velocità di erosione soglia (TDV) della sabbia non trattata è di circa 4,32 m/s. Alla velocità di applicazione di 1 l/m² (Figura 9a), le pendenze delle linee di velocità di perdita di suolo per le frazioni FA, FS, AA e UMC sono approssimativamente le stesse della duna non trattata. Ciò indica che il trattamento a questa velocità di applicazione è inefficace e non appena la velocità del vento supera la TDV, la sottile crosta di suolo scompare e la velocità di erosione della duna è la stessa della duna non trattata. La pendenza di erosione della frazione AS è inoltre inferiore a quella delle altre frazioni con ascisse inferiori (ovvero TDV) (Figura 9a). Le frecce nella Figura 9b indicano che alla velocità massima del vento di 25 m/s, non si è verificata alcuna erosione nelle dune trattate alle velocità di applicazione di 2 e 3 l/m². In altre parole, per FS, FA, AS e UMC, le dune erano più resistenti all'erosione eolica causata dalla deposizione di CaCO³ alle velocità di applicazione di 2 e 3 l/m² rispetto alla velocità massima del vento (ovvero 25 m/s). Pertanto, il valore TDV di 25 m/s ottenuto in questi test è il limite inferiore per le velocità di applicazione mostrate in Figura 9b, ad eccezione del caso di AA, dove il TDV è quasi uguale alla velocità massima della galleria del vento.
Test di erosione eolica (a) Perdita di peso in funzione della velocità del vento (tasso di applicazione 1 l/m2), (b) Velocità di strappo limite in funzione del tasso di applicazione e della formulazione (CA per acetato di calcio, CF per formiato di calcio).
La Figura 10 mostra l'erosione superficiale delle dune di sabbia trattate con diverse formulazioni e velocità di applicazione dopo il test di bombardamento con sabbia e i risultati quantitativi sono mostrati nella Figura 11. Il caso non trattato non è mostrato perché non ha mostrato alcuna resistenza ed è stato completamente eroso (perdita di massa totale) durante il test di bombardamento con sabbia. Dalla Figura 11 è chiaro che il campione trattato con biocomposizione AA ha perso l'83,5% del suo peso alla velocità di applicazione di 2 l/m², mentre tutti gli altri campioni hanno mostrato un'erosione inferiore al 30% durante il processo di bombardamento con sabbia. Quando la velocità di applicazione è stata aumentata a 3 l/m², tutti i campioni trattati hanno perso meno del 25% del loro peso. A entrambe le velocità di applicazione, il composto FS ha mostrato la migliore resistenza al bombardamento con sabbia. La resistenza massima e minima al bombardamento nei campioni trattati con FS e AA può essere attribuita alla loro massima e minima precipitazione di CaCO3 (Figura 6f).
Risultati del bombardamento di dune di sabbia di diversa composizione a portate di 2 e 3 l/m2 (le frecce indicano la direzione del vento, le croci indicano la direzione del vento perpendicolare al piano del disegno).
Come mostrato in Figura 12, il contenuto di carbonato di calcio di tutte le formule è aumentato all'aumentare del dosaggio da 1 L/m² a 3 L/m². Inoltre, a tutti i dosaggi, la formula con il contenuto di carbonato di calcio più elevato è stata FS, seguita da FA e UMC. Ciò suggerisce che queste formule potrebbero avere una maggiore resistenza superficiale.
La Figura 13a mostra la variazione della resistenza superficiale di campioni di terreno non trattati, di controllo e trattati, misurata mediante permeametro. Da questa figura, è evidente che la resistenza superficiale delle formulazioni UMC, AS, FA e FS è aumentata significativamente con l'aumento della velocità di applicazione. Tuttavia, l'aumento della resistenza superficiale è stato relativamente modesto nella formulazione AA. Come mostrato in figura, le formulazioni FA e FS di MICP non degradato dall'urea presentano una migliore permeabilità superficiale rispetto alle MICP degradate dall'urea. La Figura 13b mostra la variazione del TDV in base alla resistenza superficiale del terreno. Da questa figura, è chiaramente evidente che per dune con resistenza superficiale superiore a 100 kPa, la velocità di strippaggio di soglia supererà i 25 m/s. Poiché la resistenza superficiale in situ può essere facilmente misurata mediante permeametro, questa conoscenza può aiutare a stimare il TDV in assenza di test in galleria del vento, fungendo così da indicatore di controllo qualità per le applicazioni sul campo.
I risultati SEM sono mostrati nella Figura 14. Le Figure 14a-b mostrano le particelle ingrandite del campione di terreno non trattato, il che indica chiaramente che è coeso e non presenta legami o cementazioni naturali. La Figura 14c mostra la micrografia SEM del campione di controllo trattato con MICP degradato dall'urea. Questa immagine mostra la presenza di precipitati di CaCO3 come polimorfi di calcite. Come mostrato nelle Figure 14d-o, il CaCO3 precipitato lega insieme le particelle; nelle micrografie SEM si possono identificare anche cristalli sferici di vaterite. I risultati di questo studio e di studi precedenti indicano che i legami di CaCO3 formati come polimorfi di vaterite possono anche fornire una ragionevole resistenza meccanica; i nostri risultati mostrano che la resistenza superficiale aumenta fino a 350 kPa e la velocità di separazione di soglia aumenta da 4,32 a oltre 25 m/s. Questo risultato è coerente con i risultati di studi precedenti secondo cui la matrice di CaCO3 precipitato con MICP è vaterite, che ha una ragionevole resistenza meccanica e resistenza all'erosione del vento13,40 e può mantenere una ragionevole resistenza all'erosione del vento anche dopo 180 giorni di esposizione alle condizioni ambientali sul campo13.
(a, b) Micrografie SEM di terreno non trattato, (c) controllo della degradazione dell'urea MICP, (df) campioni trattati con AA, (gi) campioni trattati con AS, (jl) campioni trattati con FA e (mo) campioni trattati con FS a una velocità di applicazione di 3 L/m2 a diversi ingrandimenti.
La Figura 14d-f mostra che, dopo il trattamento con composti di AA, il carbonato di calcio è precipitato sulla superficie e tra i granelli di sabbia, mentre sono stati osservati anche alcuni granelli di sabbia non rivestiti. Per i componenti di AS, sebbene la quantità di CaCO3 formata non sia aumentata significativamente (Fig. 6f), la quantità di contatti tra i granelli di sabbia causata da CaCO3 è aumentata significativamente rispetto ai composti di AA (Fig. 14g-i).
Dalle Figure 14j-l e 14m-o è chiaro che l'uso del formiato di calcio come fonte di calcio porta a un ulteriore aumento della precipitazione di CaCO3 rispetto al composto AS, il che è coerente con le misurazioni del misuratore di calcio in Figura 6f. Questo CaCO3 aggiuntivo sembra depositarsi principalmente sulle particelle di sabbia e non migliora necessariamente la qualità del contatto. Ciò conferma il comportamento precedentemente osservato: nonostante le differenze nella quantità di precipitazione di CaCO3 (Figura 6f), le tre formulazioni (AS, FA e FS) non differiscono significativamente in termini di prestazioni anti-eoliche (vento) (Figura 11) e resistenza superficiale (Figura 13a).
Per visualizzare meglio le cellule batteriche ricoperte di CaCO3 e l'impronta batterica sui cristalli precipitati, sono state eseguite micrografie SEM ad alto ingrandimento e i risultati sono mostrati in Figura 15. Come mostrato, il carbonato di calcio precipita sulle cellule batteriche e fornisce i nuclei necessari per la precipitazione. La figura mostra anche i legami attivi e inattivi indotti dal CaCO3. Si può concludere che qualsiasi aumento dei legami inattivi non porta necessariamente a un ulteriore miglioramento del comportamento meccanico. Pertanto, l'aumento della precipitazione di CaCO3 non porta necessariamente a una maggiore resistenza meccanica e il modello di precipitazione gioca un ruolo importante. Questo punto è stato studiato anche nei lavori di Terzis e Laloui72 e Soghi e Al-Kabani45,73. Per esplorare ulteriormente la relazione tra modello di precipitazione e resistenza meccanica, si raccomandano studi MICP utilizzando l'imaging µCT, che esula dallo scopo di questo studio (vale a dire, introdurre diverse combinazioni di fonte di calcio e batteri per MICP senza ammoniaca).
Il CaCO3 ha indotto legami attivi e inattivi nei campioni trattati con (a) composizione AS e (b) composizione FS e ha lasciato un'impronta di cellule batteriche sul sedimento.
Come mostrato nelle Figure 14j-o e 15b, è presente un film di CaCO (secondo l'analisi EDX, la composizione percentuale di ciascun elemento nel film è carbonio 11%, ossigeno 46,62% e calcio 42,39%, molto vicina alla percentuale di CaCO in Figura 16). Questo film ricopre i cristalli di vaterite e le particelle di suolo, contribuendo a mantenere l'integrità del sistema suolo-sedimento. La presenza di questo film è stata osservata solo nei campioni trattati con la formulazione a base di formiato.
La Tabella 2 confronta la resistenza superficiale, la velocità di distacco soglia e il contenuto di CaCO3 bioindotto di suoli trattati con percorsi MICP degradanti e non degradanti l'urea in studi precedenti e in questo studio. Gli studi sulla resistenza all'erosione eolica di campioni di dune trattati con MICP sono limitati. Meng et al. hanno studiato la resistenza all'erosione eolica di campioni di dune degradanti l'urea trattati con MICP utilizzando un soffiatore per foglie,13 mentre in questo studio, campioni di dune non degradanti l'urea (così come controlli degradanti l'urea) sono stati testati in una galleria del vento e trattati con quattro diverse combinazioni di batteri e sostanze.
Come si può vedere, alcuni studi precedenti hanno considerato tassi di applicazione elevati superiori a 4 L/m213,41,74. Vale la pena notare che tassi di applicazione elevati potrebbero non essere facilmente applicabili sul campo da un punto di vista economico a causa dei costi associati all'approvvigionamento idrico, al trasporto e all'applicazione di grandi volumi d'acqua. Anche tassi di applicazione inferiori, come 1,62-2 L/m2, hanno ottenuto resistenze superficiali discrete, fino a 190 kPa, e TDV superiori a 25 m/s. Nel presente studio, le dune trattate con MICP a base di formiato senza degradazione dell'urea hanno ottenuto resistenze superficiali elevate, paragonabili a quelle ottenute con il percorso di degradazione dell'urea nello stesso intervallo di tassi di applicazione (ovvero, i campioni trattati con MICP a base di formiato senza degradazione dell'urea sono stati anche in grado di raggiungere lo stesso intervallo di valori di resistenza superficiale come riportato da Meng et al., 13, Figura 13a) a tassi di applicazione più elevati. Si può anche osservare che con un tasso di applicazione di 2 L/m2, la resa di carbonato di calcio per la mitigazione dell'erosione eolica a una velocità del vento di 25 m/s è stata del 2,25% per il MICP a base di formiato senza degradazione dell'urea, che è molto vicino alla quantità richiesta di CaCO3 (ovvero 2,41%) rispetto alle dune trattate con il MICP di controllo con degradazione dell'urea allo stesso tasso di applicazione e alla stessa velocità del vento (25 m/s).
Pertanto, da questa tabella si può concludere che sia il percorso di degradazione dell'urea sia quello senza urea possono fornire prestazioni abbastanza accettabili in termini di resistenza superficiale e TDV. La differenza principale è che il percorso di degradazione senza urea non contiene ammoniaca e quindi ha un impatto ambientale inferiore. Inoltre, il metodo MICP basato su formiato senza degradazione dell'urea proposto in questo studio sembra funzionare meglio del metodo MICP basato su acetato senza degradazione dell'urea. Sebbene Mohebbi et al. abbiano studiato il metodo MICP basato su acetato senza degradazione dell'urea, il loro studio ha incluso campioni su superfici piane9. A causa del maggiore grado di erosione causato dalla formazione di vortici attorno ai campioni di dune e del taglio risultante, che si traduce in un TDV inferiore, si prevede che l'erosione eolica dei campioni di dune sia più evidente rispetto a quella delle superfici piane alla stessa velocità.