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Le tempeste di sabbia rappresentano una seria minaccia per molti paesi in tutto il mondo a causa del loro impatto distruttivo sull'agricoltura, sulla salute umana, sulle reti di trasporto e sulle infrastrutture. Di conseguenza, l'erosione eolica è considerata un problema globale. Uno degli approcci ecocompatibili per contrastare l'erosione eolica è l'utilizzo della precipitazione di carbonato indotta da microrganismi (MICP). Tuttavia, i sottoprodotti della MICP basata sulla degradazione dell'urea, come l'ammoniaca, non sono ideali se prodotti in grandi quantità. Questo studio presenta due formulazioni di batteri del formiato di calcio per la degradazione della MICP senza produzione di urea e ne confronta in modo esaustivo le prestazioni con due formulazioni di batteri dell'acetato di calcio non produttori di ammoniaca. I batteri considerati sono Bacillus subtilis e Bacillus amyloliquefaciens. In primo luogo, sono stati determinati i valori ottimizzati dei fattori che controllano la formazione di CaCO3. Sono stati quindi condotti test in galleria del vento su campioni di dune sabbiose trattati con le formulazioni ottimizzate e sono state misurate la resistenza all'erosione eolica, la velocità di soglia di strippaggio e la resistenza al bombardamento di sabbia. Gli allomorfi del carbonato di calcio (CaCO3) sono stati valutati mediante microscopia ottica, microscopia elettronica a scansione (SEM) e analisi di diffrazione dei raggi X. Le formulazioni a base di formiato di calcio hanno mostrato prestazioni significativamente migliori rispetto alle formulazioni a base di acetato in termini di formazione di carbonato di calcio. Inoltre, B. subtilis ha prodotto più carbonato di calcio di B. amyloliquefaciens. Le micrografie SEM hanno mostrato chiaramente il legame e l'impronta dei batteri attivi e inattivi sul carbonato di calcio causati dalla sedimentazione. Tutte le formulazioni hanno ridotto significativamente l'erosione eolica.
L'erosione eolica è da tempo riconosciuta come un grave problema per le regioni aride e semiaride, come il sud-ovest degli Stati Uniti, la Cina occidentale, l'Africa sahariana e gran parte del Medio Oriente1. Le scarse precipitazioni nei climi aridi e iperaridi hanno trasformato ampie zone di queste regioni in deserti, dune di sabbia e terreni incolti. La continua erosione eolica rappresenta una minaccia ambientale per infrastrutture come reti di trasporto, terreni agricoli e aree industriali, con conseguenti condizioni di vita precarie e costi elevati per lo sviluppo urbano in queste regioni2,3,4. È importante sottolineare che l'erosione eolica non solo ha un impatto sul luogo in cui si verifica, ma causa anche problemi sanitari ed economici nelle comunità remote, trasportando particelle di materiale dal vento in aree distanti dalla fonte5,6.
Il controllo dell'erosione eolica rimane un problema globale. Diversi metodi di stabilizzazione del suolo vengono utilizzati per contrastare l'erosione eolica. Questi metodi includono materiali come l'applicazione di acqua7, pacciamatura con olio8, biopolimeri5, precipitazione di carbonato indotta da microrganismi (MICP)9,10,11,12 e precipitazione di carbonato indotta da enzimi (EICP)1. L'umidificazione del suolo è un metodo standard per la soppressione della polvere in campo. Tuttavia, la sua rapida evaporazione rende questo metodo di efficacia limitata nelle regioni aride e semiaride1. L'applicazione di composti per pacciamatura con olio aumenta la coesione della sabbia e l'attrito interparticellare. La loro proprietà coesiva lega insieme i granelli di sabbia; tuttavia, la pacciamatura con olio presenta anche altri problemi: il loro colore scuro aumenta l'assorbimento di calore e porta alla morte di piante e microrganismi. Il loro odore e i loro fumi possono causare problemi respiratori e, soprattutto, il loro costo elevato rappresenta un ulteriore ostacolo. I biopolimeri sono uno dei metodi ecocompatibili proposti di recente per mitigare l'erosione eolica; vengono estratti da fonti naturali come piante, animali e batteri. La gomma di xantano, la gomma di guar, il chitosano e la gomma di gellano sono i biopolimeri più comunemente utilizzati nelle applicazioni ingegneristiche5. Tuttavia, i biopolimeri idrosolubili possono perdere resistenza e disperdersi dal terreno se esposti all'acqua13,14. L'EICP si è dimostrato un metodo efficace di soppressione della polvere per una varietà di applicazioni, tra cui strade non asfaltate, bacini di decantazione e cantieri edili. Sebbene i risultati siano incoraggianti, è necessario considerare alcuni potenziali svantaggi, come il costo e la mancanza di siti di nucleazione (che accelera la formazione e la precipitazione di cristalli di CaCO315,16).
Il MICP è stato descritto per la prima volta alla fine del XIX secolo da Murray e Irwin (1890) e Steinmann (1901) nel loro studio sulla degradazione dell'urea da parte di microrganismi marini17. Il MICP è un processo biologico naturale che coinvolge una varietà di attività microbiche e processi chimici in cui il carbonato di calcio viene precipitato dalla reazione degli ioni carbonato provenienti dai metaboliti microbici con gli ioni calcio presenti nell'ambiente18,19. Il MICP che coinvolge il ciclo dell'azoto che degrada l'urea (MICP che degrada l'urea) è il tipo più comune di precipitazione del carbonato indotta da microbi, in cui l'ureasi prodotta dai batteri catalizza l'idrolisi dell'urea20,21,22,23,24,25,26,27 come segue:
Nel MICP che coinvolge il ciclo del carbonio dell'ossidazione dei sali organici (MICP senza degradazione dell'urea), i batteri eterotrofi utilizzano sali organici come acetato, lattato, citrato, succinato, ossalato, malato e gliossilato come fonti di energia per produrre minerali carbonatici28. In presenza di lattato di calcio come fonte di carbonio e ioni calcio, la reazione chimica di formazione del carbonato di calcio è mostrata nell'equazione (5).
Nel processo MICP, le cellule batteriche forniscono siti di nucleazione particolarmente importanti per la precipitazione del carbonato di calcio; la superficie delle cellule batteriche è carica negativamente e può agire da adsorbente per cationi bivalenti come gli ioni calcio. Adsorbendo gli ioni calcio sulle cellule batteriche, quando la concentrazione di ioni carbonato è sufficiente, i cationi calcio e gli anioni carbonato reagiscono e il carbonato di calcio precipita sulla superficie batterica29,30. Il processo può essere riassunto come segue31,32:
I cristalli di carbonato di calcio di origine biologica possono essere suddivisi in tre tipi: calcite, vaterite e aragonite. Tra questi, la calcite e la vaterite sono gli allomorfi di carbonato di calcio più comuni indotti dai batteri33,34. La calcite è l'allomorfo di carbonato di calcio termodinamicamente più stabile35. Sebbene sia stato riportato che la vaterite sia metastabile, alla fine si trasforma in calcite36,37. La vaterite è il più denso di questi cristalli. È un cristallo esagonale che ha una migliore capacità di riempimento dei pori rispetto ad altri cristalli di carbonato di calcio grazie alle sue dimensioni maggiori38. Sia il MICP degradato dall'urea che quello non degradato dall'urea possono portare alla precipitazione della vaterite13,39,40,41.
Sebbene il MICP abbia mostrato un potenziale promettente nella stabilizzazione di terreni problematici e suscettibili all'erosione eolica42,43,44,45,46,47,48, uno dei sottoprodotti dell'idrolisi dell'urea è l'ammoniaca, che può causare problemi di salute da lievi a gravi a seconda del livello di esposizione49. Questo effetto collaterale rende controverso l'uso di questa particolare tecnologia, soprattutto quando è necessario trattare grandi aree, come nel caso della soppressione delle polveri. Inoltre, l'odore di ammoniaca è intollerabile quando il processo viene eseguito ad alti tassi di applicazione e grandi volumi, il che può influire sulla sua applicabilità pratica. Sebbene studi recenti abbiano dimostrato che gli ioni ammonio possono essere ridotti convertendoli in altri prodotti come la struvite, questi metodi non rimuovono completamente gli ioni ammonio50. Pertanto, è ancora necessario esplorare soluzioni alternative che non generino ioni ammonio. L'uso di percorsi di degradazione non basati sull'urea per il MICP potrebbe fornire una potenziale soluzione che è stata poco esplorata nel contesto della mitigazione dell'erosione eolica. Fattahi et al. hanno studiato la degradazione del MICP senza urea utilizzando acetato di calcio e Bacillus megaterium41, mentre Mohebbi et al. hanno utilizzato acetato di calcio e Bacillus amyloliquefaciens9. Tuttavia, il loro studio non è stato confrontato con altre fonti di calcio e batteri eterotrofi che potrebbero in definitiva migliorare la resistenza all'erosione eolica. Inoltre, manca letteratura che confronti i percorsi di degradazione senza urea con i percorsi di degradazione con urea nella mitigazione dell'erosione eolica.
Inoltre, la maggior parte degli studi sull'erosione eolica e sul controllo della polvere sono stati condotti su campioni di suolo con superfici piane.1,51,52,53 Tuttavia, le superfici piane sono meno comuni in natura rispetto a colline e depressioni. Questo è il motivo per cui le dune di sabbia sono la caratteristica paesaggistica più comune nelle regioni desertiche.
Per superare le suddette carenze, questo studio si è proposto di introdurre una nuova serie di agenti batterici non produttori di ammoniaca. A tal fine, sono stati presi in considerazione i percorsi MICP non degradanti l'urea. È stata studiata l'efficienza di due fonti di calcio (formiato di calcio e acetato di calcio). Per quanto a conoscenza degli autori, la precipitazione di carbonato utilizzando due combinazioni di fonti di calcio e batteri (ovvero formiato di calcio-Bacillus subtilis e formiato di calcio-Bacillus amyloliquefaciens) non è stata indagata in studi precedenti. La scelta di questi batteri si è basata sugli enzimi che producono, i quali catalizzano l'ossidazione del formiato di calcio e dell'acetato di calcio per formare la precipitazione microbica di carbonato. È stato progettato uno studio sperimentale approfondito per individuare i fattori ottimali quali pH, tipologia di batteri e fonti di calcio e le loro concentrazioni, rapporto tra batteri e soluzione di fonte di calcio e tempo di maturazione. Infine, l'efficacia di questo insieme di agenti batterici nel sopprimere l'erosione eolica attraverso la precipitazione di carbonato di calcio è stata studiata conducendo una serie di test in galleria del vento su dune di sabbia per determinare l'entità dell'erosione eolica, la velocità di distacco di soglia e la resistenza al bombardamento del vento della sabbia; sono state inoltre effettuate misurazioni penetrometriche e studi microstrutturali (ad esempio, analisi di diffrazione dei raggi X (XRD) e microscopia elettronica a scansione (SEM)).
La produzione di carbonato di calcio richiede ioni calcio e ioni carbonato. Gli ioni calcio possono essere ottenuti da varie fonti di calcio come cloruro di calcio, idrossido di calcio e latte scremato in polvere54,55. Gli ioni carbonato possono essere prodotti mediante vari metodi microbici come l'idrolisi dell'urea e l'ossidazione aerobica o anaerobica della materia organica56. In questo studio, gli ioni carbonato sono stati ottenuti dalla reazione di ossidazione di formiato e acetato. Inoltre, abbiamo utilizzato sali di calcio di formiato e acetato per produrre carbonato di calcio puro, ottenendo così come sottoprodotti solo CO2 e H2O. In questo processo, una sola sostanza funge da fonte di calcio e di carbonato, e non viene prodotta ammoniaca. Queste caratteristiche rendono il metodo di produzione di carbonato e fonte di calcio che abbiamo considerato molto promettente.
Le reazioni corrispondenti del formiato di calcio e dell'acetato di calcio per formare carbonato di calcio sono mostrate nelle formule (7)-(14). Le formule (7)-(11) mostrano che il formiato di calcio si dissolve in acqua per formare acido formico o formiato. La soluzione è quindi una fonte di ioni calcio e idrossido liberi (formule 8 e 9). Come risultato dell'ossidazione dell'acido formico, gli atomi di carbonio nell'acido formico vengono convertiti in anidride carbonica (formula 10). Si forma infine il carbonato di calcio (formule 11 e 12).
Analogamente, il carbonato di calcio si forma dall'acetato di calcio (equazioni 13-15), con la differenza che al posto dell'acido formico si forma acido acetico o acetato.
In assenza di enzimi, l'acetato e il formiato non possono essere ossidati a temperatura ambiente. La FDH (formiato deidrogenasi) e il CoA (coenzima A) catalizzano rispettivamente l'ossidazione del formiato e dell'acetato per formare anidride carbonica (Eq. 16, 17) 57, 58, 59. Diversi batteri sono in grado di produrre questi enzimi e in questo studio sono stati utilizzati batteri eterotrofi, in particolare Bacillus subtilis (PTCC #1204 (Persian Type Culture Collection), noto anche come NCIMB #13061 (International Collection of Bacteria, Yeast, Phage, Plasmids, Plant Seeds and Plant Cell Tissue Cultures)) e Bacillus amyloliquefaciens (PTCC #1732, NCIMB #12077). Questi batteri sono stati coltivati ​​in un terreno contenente peptone di carne (5 g/L) ed estratto di carne (3 g/L), denominato brodo nutritivo (NBR) (105443 Merck).
Sono state quindi preparate quattro formulazioni per indurre la precipitazione del carbonato di calcio utilizzando due fonti di calcio e due batteri: formiato di calcio e Bacillus subtilis (FS), formiato di calcio e Bacillus amyloliquefaciens (FA), acetato di calcio e Bacillus subtilis (AS) e acetato di calcio e Bacillus amyloliquefaciens (AA).
Nella prima parte della progettazione sperimentale, sono stati condotti test per determinare la combinazione ottimale che avrebbe permesso di ottenere la massima produzione di carbonato di calcio. Poiché i campioni di terreno contenevano carbonato di calcio, è stata progettata una serie di test di valutazione preliminare per misurare con precisione il CaCO3 prodotto dalle diverse combinazioni, e sono state valutate miscele di terreno di coltura e soluzioni di fonte di calcio. Per ciascuna combinazione di fonte di calcio e soluzione batterica definita in precedenza (FS, FA, AS e AA), sono stati derivati ​​i fattori di ottimizzazione (concentrazione della fonte di calcio, tempo di maturazione, concentrazione della soluzione batterica misurata tramite densità ottica della soluzione (DO), rapporto tra fonte di calcio e soluzione batterica e pH) e utilizzati nei test in galleria del vento per il trattamento delle dune sabbiose descritti nelle sezioni successive.
Per ciascuna combinazione, sono stati condotti 150 esperimenti per studiare l'effetto della precipitazione di CaCO3 e valutare vari fattori, vale a dire la concentrazione della fonte di calcio, il tempo di stagionatura, il valore OD batterico, il rapporto tra fonte di calcio e soluzione batterica e il pH durante l'ossidazione aerobica della sostanza organica (Tabella 1). L'intervallo di pH per il processo ottimizzato è stato selezionato in base alle curve di crescita di Bacillus subtilis e Bacillus amyloliquefaciens al fine di ottenere una crescita più rapida. Questo è spiegato più dettagliatamente nella sezione Risultati.
Per la preparazione dei campioni per la fase di ottimizzazione sono stati utilizzati i seguenti passaggi. La soluzione MICP è stata preparata regolando il pH iniziale del terreno di coltura e quindi sterilizzata in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Il ceppo è stato quindi inoculato in un flusso d'aria laminare e mantenuto in un incubatore a scuotimento a 30 °C e 180 rpm. Una volta che la densità ottica (OD) dei batteri ha raggiunto il livello desiderato, è stata miscelata con la soluzione di fonte di calcio nella proporzione desiderata (Figura 1a). La soluzione MICP è stata lasciata reagire e solidificare in un incubatore a scuotimento a 220 rpm e 30 °C per un tempo tale da raggiungere il valore target. Il CaCO3 precipitato è stato separato dopo centrifugazione a 6000 g per 5 minuti e quindi essiccato a 40 °C per preparare i campioni per il test calcimetrico (Figura 1b). La precipitazione di CaCO3 è stata quindi misurata utilizzando un calcimetro di Bernard, in cui la polvere di CaCO3 reagisce con HCl 1,0 N (ASTM-D4373-02) per produrre CO2, e il volume di questo gas è una misura del contenuto di CaCO3 (Figura 1c). Per convertire il volume di CO2 in contenuto di CaCO3, è stata generata una curva di calibrazione lavando la polvere di CaCO3 pura con HCl 1 N e riportandola in funzione della CO2 prodotta. La morfologia e la purezza della polvere di CaCO3 precipitata sono state studiate mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) e analisi di diffrazione dei raggi X (XRD). Un microscopio ottico con un ingrandimento di 1000x è stato utilizzato per studiare la formazione di carbonato di calcio attorno ai batteri, la fase del carbonato di calcio formatosi e l'attività dei batteri.
Il bacino di Dejegh è una regione ben nota per la sua elevata erosione, situata nella provincia sud-occidentale di Fars, in Iran. I ricercatori hanno raccolto campioni di suolo eroso dal vento in quest'area. I campioni sono stati prelevati dalla superficie del suolo per lo studio. Le analisi sugli indicatori di composizione del suolo hanno mostrato che si trattava di un terreno sabbioso scarsamente selezionato con limo, classificato come SP-SM secondo il Sistema Unificato di Classificazione dei Suoli (USC) (Figura 2a). L'analisi XRD ha rivelato che il suolo di Dejegh era composto principalmente da calcite e quarzo (Figura 2b). Inoltre, l'analisi EDX ha mostrato la presenza, in proporzioni minori, di altri elementi come Al, K e Fe.
Per preparare le dune di laboratorio per le prove di erosione eolica, il terreno è stato frantumato da un'altezza di 170 mm attraverso un imbuto di 10 mm di diametro fino a ottenere una superficie compatta, con conseguente formazione di una duna tipica di 60 mm di altezza e 210 mm di diametro. In natura, le dune di sabbia a densità più bassa si formano per processi eolici. Analogamente, il campione preparato con la procedura sopra descritta presentava la densità relativa più bassa, γ = 14,14 kN/m³, formando un cono di sabbia depositato su una superficie orizzontale con un angolo di riposo di circa 29,7°.
La soluzione MICP ottimale ottenuta nella sezione precedente è stata spruzzata sul pendio della duna a velocità di applicazione di 1, 2 e 3 lm-2 e quindi i campioni sono stati conservati in un incubatore a 30 °C (Fig. 3) per 9 giorni (ovvero il tempo di indurimento ottimale) e poi prelevati per i test in galleria del vento.
Per ciascun trattamento, sono stati preparati quattro campioni: uno per la misurazione del contenuto di carbonato di calcio e della resistenza superficiale mediante penetrometro, e i restanti tre campioni sono stati utilizzati per prove di erosione a tre diverse velocità. Nelle prove in galleria del vento, è stata determinata la quantità di erosione a diverse velocità del vento, e successivamente è stata determinata la velocità di rottura di soglia per ciascun campione trattato utilizzando un grafico della quantità di erosione in funzione della velocità del vento. Oltre alle prove di erosione eolica, i campioni trattati sono stati sottoposti a bombardamento di sabbia (ovvero, esperimenti di salto). A tale scopo sono stati preparati due campioni aggiuntivi con tassi di applicazione di 2 e 3 L m−2. La prova di bombardamento di sabbia è durata 15 minuti con un flusso di 120 gm−1, che rientra nell'intervallo di valori selezionati in studi precedenti60,61,62. La distanza orizzontale tra l'ugello abrasivo e la base della duna era di 800 mm, posizionata 100 mm sopra il fondo della galleria. Questa posizione è stata impostata in modo che quasi tutte le particelle di sabbia in salto cadessero sulla duna.
Il test in galleria del vento è stato condotto in una galleria del vento aperta con una lunghezza di 8 m, una larghezza di 0,4 m e un'altezza di 1 m (Figura 4a). La galleria del vento è realizzata in lamiera d'acciaio zincata e può generare una velocità del vento fino a 25 m/s. Inoltre, un convertitore di frequenza viene utilizzato per regolare la frequenza della ventola e aumentarla gradualmente fino a raggiungere la velocità del vento desiderata. La Figura 4b mostra lo schema delle dune di sabbia erose dal vento e il profilo di velocità del vento misurato nella galleria del vento.
Infine, per confrontare i risultati della formulazione MICP non urealitica proposta in questo studio con i risultati del test di controllo MICP urealitico, sono stati preparati anche campioni di duna e trattati con una soluzione biologica contenente urea, cloruro di calcio e Sporosarcina pasteurii (poiché Sporosarcina pasteurii ha una significativa capacità di produrre ureasi63). La densità ottica della soluzione batterica era 1,5 e le concentrazioni di urea e cloruro di calcio erano 1 M (selezionate in base ai valori raccomandati in studi precedenti36,64,65). Il terreno di coltura era costituito da brodo nutritivo (8 g/L) e urea (20 g/L). La soluzione batterica è stata spruzzata sulla superficie della duna e lasciata agire per 24 ore per l'adesione batterica. Dopo 24 ore di adesione, è stata spruzzata una soluzione cementante (cloruro di calcio e urea). Il test di controllo MICP urealitico viene di seguito indicato come UMC. Il contenuto di carbonato di calcio nei campioni di terreno trattati con e senza urealisi è stato ottenuto mediante lavaggio secondo la procedura proposta da Choi et al.66
La Figura 5 mostra le curve di crescita di Bacillus amyloliquefaciens e Bacillus subtilis nel terreno di coltura (soluzione nutritiva) con un intervallo di pH iniziale compreso tra 5 e 10. Come si evince dalla figura, Bacillus amyloliquefaciens e Bacillus subtilis sono cresciuti più velocemente rispettivamente a pH 6-8 e 7-9. Pertanto, questo intervallo di pH è stato adottato nella fase di ottimizzazione.
Curve di crescita di (a) Bacillus amyloliquefaciens e (b) Bacillus subtilis a diversi valori iniziali di pH del terreno di coltura.
La Figura 6 mostra la quantità di anidride carbonica prodotta nel calcemetro di Bernard, che rappresenta il carbonato di calcio precipitato (CaCO3). Poiché un fattore è stato fissato in ogni combinazione e gli altri fattori sono stati variati, ogni punto su questi grafici corrisponde al volume massimo di anidride carbonica in quella serie di esperimenti. Come mostrato in figura, all'aumentare della concentrazione della fonte di calcio, è aumentata la produzione di carbonato di calcio. Pertanto, la concentrazione della fonte di calcio influenza direttamente la produzione di carbonato di calcio. Poiché la fonte di calcio e la fonte di carbonio sono le stesse (ovvero, formiato di calcio e acetato di calcio), maggiore è la quantità di ioni calcio rilasciati, maggiore è la quantità di carbonato di calcio che si forma (Figura 6a). Nelle formulazioni AS e AA, la produzione di carbonato di calcio ha continuato ad aumentare con l'aumentare del tempo di stagionatura fino a quando la quantità di precipitato è rimasta pressoché invariata dopo 9 giorni. Nella formulazione FA, la velocità di formazione del carbonato di calcio è diminuita quando il tempo di stagionatura ha superato i 6 giorni. Rispetto alle altre formulazioni, la formulazione FS ha mostrato una velocità di formazione del carbonato di calcio relativamente bassa dopo 3 giorni (Figura 6b). Nelle formulazioni FA e FS, il 70% e l'87% della produzione totale di carbonato di calcio è stato ottenuto dopo tre giorni, mentre nelle formulazioni AA e AS, questa percentuale era solo del 46% e del 45%, rispettivamente. Ciò indica che la formulazione a base di acido formico ha una velocità di formazione di CaCO3 più elevata nella fase iniziale rispetto alla formulazione a base di acetato. Tuttavia, la velocità di formazione rallenta con l'aumentare del tempo di stagionatura. Dalla Figura 6c si può concludere che, anche a concentrazioni batteriche superiori a OD1, non vi è un contributo significativo alla formazione di carbonato di calcio.
Variazione del volume di CO2 (e del corrispondente contenuto di CaCO3) misurata dal calcimetro di Bernard in funzione di (a) concentrazione della fonte di calcio, (b) tempo di presa, (c) OD, (d) pH iniziale, (e) rapporto tra fonte di calcio e soluzione batterica (per ciascuna formulazione); e (f) quantità massima di carbonato di calcio prodotta per ciascuna combinazione di fonte di calcio e batteri.
Per quanto riguarda l'effetto del pH iniziale del mezzo, la Figura 6d mostra che per FA e FS, la produzione di CaCO3 ha raggiunto un valore massimo a pH 7. Questa osservazione è coerente con studi precedenti secondo cui gli enzimi FDH sono più stabili a pH 7-6,7. Tuttavia, per AA e AS, la precipitazione di CaCO3 è aumentata quando il pH ha superato 7. Studi precedenti hanno anche mostrato che l'intervallo di pH ottimale per l'attività dell'enzima CoA è compreso tra 8 e 9,2-6,8. Considerando che gli intervalli di pH ottimali per l'attività dell'enzima CoA e la crescita di B. amyloliquefaciens sono rispettivamente (8-9,2) e (6-8) (Figura 5a), ci si aspetta che il pH ottimale della formulazione AA sia 8 e che i due intervalli di pH si sovrappongano. Questo fatto è stato confermato dagli esperimenti, come mostrato nella Figura 6d. Poiché il pH ottimale per la crescita di B. subtilis è 7-9 (Figura 5b) e il pH ottimale per l'attività dell'enzima CoA è 8-9,2, si prevede che la resa massima di precipitazione di CaCO3 si trovi nell'intervallo di pH 8-9, come confermato dalla Figura 6d (ovvero, il pH ottimale di precipitazione è 9). I risultati mostrati nella Figura 6e indicano che il rapporto ottimale tra la soluzione di fonte di calcio e la soluzione batterica è 1 sia per le soluzioni di acetato che di formiato. Per confronto, le prestazioni di diverse formulazioni (ovvero AA, AS, FA e FS) sono state valutate in base alla massima produzione di CaCO3 in diverse condizioni (ovvero, concentrazione della fonte di calcio, tempo di stagionatura, OD, rapporto tra la fonte di calcio e la soluzione batterica e pH iniziale). Tra le formulazioni studiate, la formulazione FS ha mostrato la più alta produzione di CaCO3, circa tre volte superiore a quella della formulazione AA (Figura 6f). Sono stati condotti quattro esperimenti di controllo senza batteri per entrambe le fonti di calcio e non è stata osservata alcuna precipitazione di CaCO3 dopo 30 giorni.
Le immagini al microscopio ottico di tutte le formulazioni hanno mostrato che la vaterite era la fase principale in cui si formava il carbonato di calcio (Figura 7). I cristalli di vaterite avevano forma sferica69,70,71. È stato riscontrato che il carbonato di calcio precipitava sulle cellule batteriche perché la superficie delle cellule batteriche era carica negativamente e poteva agire come adsorbente per i cationi bivalenti. Prendendo come esempio la formulazione FS in questo studio, dopo 24 ore, il carbonato di calcio ha iniziato a formarsi su alcune cellule batteriche (Figura 7a) e dopo 48 ore, il numero di cellule batteriche rivestite di carbonato di calcio è aumentato significativamente. Inoltre, come mostrato nella Figura 7b, si potevano rilevare anche particelle di vaterite. Infine, dopo 72 ore, un gran numero di batteri sembrava essere legato ai cristalli di vaterite e il numero di particelle di vaterite è aumentato significativamente (Figura 7c).
Osservazioni al microscopio ottico della precipitazione di CaCO3 nelle composizioni FS nel tempo: (a) 24, (b) 48 e (c) 72 ore.
Per approfondire la morfologia della fase precipitata, sono state eseguite analisi di diffrazione a raggi X (XRD) e microscopia elettronica a scansione (SEM) sulle polveri. Gli spettri XRD (Fig. 8a) e le micrografie SEM (Fig. 8b, c) hanno confermato la presenza di cristalli di vaterite, che presentavano una forma a lattuga, e si è osservata una corrispondenza tra i picchi della vaterite e i picchi del precipitato.
(a) Confronto degli spettri di diffrazione dei raggi X del CaCO3 e della vaterite formati. Micrografie SEM della vaterite a (b) 1 kHz e (c) 5,27 kHz di ingrandimento, rispettivamente.
I risultati delle prove in galleria del vento sono mostrati nella Figura 9a, b. Dalla Figura 9a si può osservare che la velocità di erosione di soglia (TDV) della sabbia non trattata è di circa 4,32 m/s. Al tasso di applicazione di 1 l/m² (Figura 9a), le pendenze delle linee del tasso di perdita di suolo per le frazioni FA, FS, AA e UMC sono approssimativamente le stesse di quelle della duna non trattata. Ciò indica che il trattamento a questo tasso di applicazione è inefficace e non appena la velocità del vento supera la TDV, la sottile crosta di terreno scompare e il tasso di erosione della duna è lo stesso di quello della duna non trattata. La pendenza dell'erosione della frazione AS è anche inferiore a quella delle altre frazioni con ascisse inferiori (ovvero TDV) (Figura 9a). Le frecce nella Figura 9b indicano che alla velocità massima del vento di 25 m/s, non si è verificata erosione nelle dune trattate ai tassi di applicazione di 2 e 3 l/m². In altre parole, per FS, FA, AS e UMC, le dune sono risultate più resistenti all'erosione eolica causata dalla deposizione di CaCO³ ai tassi di applicazione di 2 e 3 l/m² rispetto alla velocità massima del vento (ovvero 25 m/s). Pertanto, il valore TDV di 25 m/s ottenuto in questi test rappresenta il limite inferiore per i tassi di applicazione mostrati nella Figura 9b, ad eccezione del caso di AA, dove il TDV è quasi uguale alla velocità massima della galleria del vento.
Test di erosione eolica (a) Perdita di peso in funzione della velocità del vento (tasso di applicazione 1 l/m2), (b) Velocità di distacco di soglia in funzione del tasso di applicazione e della formulazione (CA per acetato di calcio, CF per formiato di calcio).
La Figura 10 mostra l'erosione superficiale delle dune di sabbia trattate con diverse formulazioni e tassi di applicazione dopo il test di bombardamento di sabbia, mentre i risultati quantitativi sono riportati nella Figura 11. Il caso non trattato non è mostrato perché non ha mostrato alcuna resistenza ed è stato completamente eroso (perdita di massa totale) durante il test di bombardamento di sabbia. Dalla Figura 11 è evidente che il campione trattato con la biocomposizione AA ha perso l'83,5% del suo peso al tasso di applicazione di 2 l/m2, mentre tutti gli altri campioni hanno mostrato un'erosione inferiore al 30% durante il processo di bombardamento di sabbia. Quando il tasso di applicazione è stato aumentato a 3 l/m2, tutti i campioni trattati hanno perso meno del 25% del loro peso. A entrambi i tassi di applicazione, il composto FS ha mostrato la migliore resistenza al bombardamento di sabbia. La resistenza massima e minima al bombardamento nei campioni trattati con FS e AA può essere attribuita alla loro massima e minima precipitazione di CaCO3 (Figura 6f).
Risultati del bombardamento di dune sabbiose di diversa composizione a portate di 2 e 3 l/m2 (le frecce indicano la direzione del vento, le croci indicano la direzione del vento perpendicolare al piano del disegno).
Come illustrato nella Figura 12, il contenuto di carbonato di calcio di tutte le formulazioni è aumentato all'aumentare del tasso di applicazione da 1 L/m² a 3 L/m². Inoltre, a tutti i tassi di applicazione, la formulazione con il più alto contenuto di carbonato di calcio è risultata essere FS, seguita da FA e UMC. Ciò suggerisce che queste formulazioni potrebbero avere una maggiore resistenza superficiale.
La Figura 13a mostra la variazione della resistenza superficiale dei campioni di terreno non trattati, di controllo e trattati, misurata tramite test di permeametria. Da questa figura, è evidente che la resistenza superficiale delle formulazioni UMC, AS, FA e FS è aumentata significativamente con l'aumento del tasso di applicazione. Tuttavia, l'aumento della resistenza superficiale è stato relativamente piccolo nella formulazione AA. Come mostrato in figura, le formulazioni FA e FS di MICP non degradato con urea presentano una migliore permeabilità superficiale rispetto al MICP degradato con urea. La Figura 13b mostra la variazione del TDV con la resistenza superficiale del terreno. Da questa figura, è chiaramente evidente che per le dune con resistenza superficiale superiore a 100 kPa, la velocità di stripping di soglia supererà i 25 m/s. Poiché la resistenza superficiale in situ può essere facilmente misurata tramite permeametro, questa informazione può aiutare a stimare il TDV in assenza di test in galleria del vento, fungendo quindi da indicatore di controllo qualità per le applicazioni sul campo.
I risultati SEM sono mostrati nella Figura 14. Le Figure 14a-b mostrano le particelle ingrandite del campione di terreno non trattato, il che indica chiaramente che è coesivo e non presenta legami o cementazione naturali. La Figura 14c mostra la micrografia SEM del campione di controllo trattato con MICP degradato con urea. Questa immagine mostra la presenza di precipitati di CaCO3 come polimorfi di calcite. Come mostrato nelle Figure 14d-o, il CaCO3 precipitato lega insieme le particelle; nelle micrografie SEM si possono anche identificare cristalli sferici di vaterite. I risultati di questo studio e di studi precedenti indicano che i legami di CaCO3 formati come polimorfi di vaterite possono anche fornire una ragionevole resistenza meccanica; i nostri risultati mostrano che la resistenza superficiale aumenta a 350 kPa e la velocità di separazione di soglia aumenta da 4,32 a oltre 25 m/s. Questo risultato è coerente con i risultati di studi precedenti secondo cui la matrice del CaCO3 precipitato con MICP è vaterite, che ha una resistenza meccanica e una resistenza all'erosione eolica ragionevoli13,40 e può mantenere una resistenza all'erosione eolica ragionevole anche dopo 180 giorni di esposizione alle condizioni ambientali del campo13.
(a, b) Micrografie SEM del terreno non trattato, (c) controllo della degradazione dell'urea MICP, (df) campioni trattati con AA, (gi) campioni trattati con AS, (jl) campioni trattati con FA e (mo) campioni trattati con FS a un tasso di applicazione di 3 L/m2 a diversi ingrandimenti.
La Figura 14d-f mostra che, dopo il trattamento con composti AA, il carbonato di calcio è precipitato sulla superficie e tra i granelli di sabbia, mentre sono stati osservati anche alcuni granelli di sabbia non rivestiti. Per i componenti AS, sebbene la quantità di CaCO3 formatasi non sia aumentata in modo significativo (Fig. 6f), la quantità di contatti tra i granelli di sabbia causati dal CaCO3 è aumentata significativamente rispetto ai composti AA (Fig. 14g-i).
Dalle figure 14j-l e 14m-o è chiaro che l'uso di formiato di calcio come fonte di calcio porta a un ulteriore aumento della precipitazione di CaCO3 rispetto al composto AS, il che è coerente con le misurazioni del misuratore di calcio nella figura 6f. Questo CaCO3 aggiuntivo sembra depositarsi principalmente sulle particelle di sabbia e non migliora necessariamente la qualità del contatto. Ciò conferma il comportamento precedentemente osservato: nonostante le differenze nella quantità di precipitazione di CaCO3 (figura 6f), le tre formulazioni (AS, FA e FS) non differiscono in modo significativo in termini di prestazioni anti-eoliche (vento) (figura 11) e resistenza superficiale (figura 13a).
Per visualizzare meglio le cellule batteriche rivestite di CaCO3 e l'impronta batterica sui cristalli precipitati, sono state acquisite micrografie SEM ad alto ingrandimento, i cui risultati sono mostrati nella Figura 15. Come si può osservare, il carbonato di calcio precipita sulle cellule batteriche e fornisce i nuclei necessari per la precipitazione. La figura illustra anche i legami attivi e inattivi indotti dal CaCO3. Si può concludere che un aumento dei legami inattivi non porta necessariamente a un ulteriore miglioramento del comportamento meccanico. Pertanto, l'aumento della precipitazione di CaCO3 non si traduce necessariamente in una maggiore resistenza meccanica e il modello di precipitazione gioca un ruolo importante. Questo aspetto è stato studiato anche nei lavori di Terzis e Laloui72 e di Soghi e Al-Kabani45,73. Per approfondire la relazione tra modello di precipitazione e resistenza meccanica, si raccomandano studi MICP utilizzando l'imaging µCT, che esulano dall'ambito di questo studio (ovvero, l'introduzione di diverse combinazioni di fonte di calcio e batteri per MICP senza ammoniaca).
Il CaCO3 ha indotto legami attivi e inattivi nei campioni trattati con la composizione (a) AS e (b) FS e ha lasciato un'impronta di cellule batteriche sul sedimento.
Come mostrato nelle Figure 14j-o e 15b, è presente una pellicola di CaCO3 (secondo l'analisi EDX, la composizione percentuale di ciascun elemento nella pellicola è carbonio 11%, ossigeno 46,62% e calcio 42,39%, che è molto vicina alla percentuale di CaCO3 nella Figura 16). Questa pellicola ricopre i cristalli di vaterite e le particelle di suolo, contribuendo a mantenere l'integrità del sistema suolo-sedimento. La presenza di questa pellicola è stata osservata solo nei campioni trattati con la formulazione a base di formiato.
La Tabella 2 confronta la resistenza superficiale, la velocità di distacco di soglia e il contenuto di CaCO3 bioindotto dei suoli trattati con percorsi MICP degradanti l'urea e non degradanti l'urea in studi precedenti e in questo studio. Gli studi sulla resistenza all'erosione eolica dei campioni di dune trattati con MICP sono limitati. Meng et al. hanno studiato la resistenza all'erosione eolica di campioni di dune degradanti l'urea trattati con MICP utilizzando un soffiatore per foglie,13 mentre in questo studio, i campioni di dune non degradanti l'urea (così come i controlli degradanti l'urea) sono stati testati in una galleria del vento e trattati con quattro diverse combinazioni di batteri e sostanze.
Come si può notare, alcuni studi precedenti hanno considerato tassi di applicazione elevati, superiori a 4 L/m213,41,74. Vale la pena sottolineare che tassi di applicazione elevati potrebbero non essere facilmente applicabili sul campo da un punto di vista economico, a causa dei costi associati all'approvvigionamento idrico, al trasporto e all'applicazione di grandi volumi d'acqua. Tassi di applicazione inferiori, come 1,62-2 L/m2, hanno comunque raggiunto resistenze superficiali abbastanza buone, fino a 190 kPa, e TDV superiori a 25 m/s. Nel presente studio, le dune trattate con MICP a base di formiato senza degradazione dell'urea hanno raggiunto elevate resistenze superficiali, paragonabili a quelle ottenute con il percorso di degradazione dell'urea nello stesso intervallo di tassi di applicazione (ovvero, i campioni trattati con MICP a base di formiato senza degradazione dell'urea sono stati in grado di raggiungere lo stesso intervallo di valori di resistenza superficiale riportato da Meng et al., 13, Figura 13a) a tassi di applicazione più elevati. Si può inoltre osservare che, con un tasso di applicazione di 2 L/m2, la resa di carbonato di calcio per la mitigazione dell'erosione eolica a una velocità del vento di 25 m/s è stata del 2,25% per il MICP a base di formiato senza degradazione dell'urea, valore molto vicino alla quantità richiesta di CaCO3 (ovvero 2,41%) rispetto alle dune trattate con il MICP di controllo con degradazione dell'urea, allo stesso tasso di applicazione e alla stessa velocità del vento (25 m/s).
Da questa tabella si può quindi concludere che sia il percorso di degradazione con urea sia quello senza urea possono fornire prestazioni abbastanza accettabili in termini di resistenza superficiale e TDV. La differenza principale è che il percorso di degradazione senza urea non contiene ammoniaca e quindi ha un minore impatto ambientale. Inoltre, il metodo MICP a base di formiato senza degradazione con urea proposto in questo studio sembra avere prestazioni migliori rispetto al metodo MICP a base di acetato senza degradazione con urea. Sebbene Mohebbi et al. abbiano studiato il metodo MICP a base di acetato senza degradazione con urea, il loro studio includeva campioni su superfici piane9. A causa del maggiore grado di erosione causato dalla formazione di vortici attorno ai campioni di dune e del conseguente taglio, che si traduce in un TDV inferiore, ci si aspetta che l'erosione eolica dei campioni di dune sia più evidente rispetto a quella delle superfici piane alla stessa velocità.