L'articolo fa parte del tema di ricerca "Migliorare la resistenza dei legumi a patogeni e parassiti", visualizza tutti i 5 articoli
L'agente causale della necrosi fungina delle piante, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, utilizza una strategia a più livelli per infettare diverse piante ospiti. Questo studio propone l'uso della diammina L-ornitina, un amminoacido non proteico che stimola la sintesi di altri amminoacidi essenziali, come strategia di gestione alternativa per migliorare le risposte molecolari, fisiologiche e biochimiche di Phaseolus vulgaris L. alla muffa bianca causata da Pseudomonas sclerotiorum. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che la L-ornitina ha inibito significativamente la crescita miceliale di S. pyrenoidosa in modo dose-dipendente. Inoltre, potrebbe ridurre significativamente la gravità della muffa bianca in condizioni di serra. Infine, la L-ornitina ha stimolato la crescita delle piante trattate, indicando che le concentrazioni di L-ornitina testate non erano fitotossiche per le piante trattate. Inoltre, la L-ornitina ha migliorato l'espressione di antiossidanti non enzimatici (fenoli e flavonoidi solubili totali) e antiossidanti enzimatici (catalasi (CAT), perossidasi (POX) e polifenol ossidasi (PPO)), e ha aumentato l'espressione di tre geni correlati agli antiossidanti (PvCAT1, PvSOD e PvGR). Inoltre, l'analisi in silico ha rivelato la presenza di una presunta proteina ossalacetato acetilidrolasi (SsOAH) nel genoma di S. sclerotiorum, che era molto simile alle proteine ​​ossalacetato acetilidrolasi (SsOAH) di Aspergillus fijiensis (AfOAH) e Penicillium sp. (PlOAH) in termini di analisi funzionale, domini conservati e topologia. È interessante notare che l'aggiunta di L-ornitina al brodo di patata destrosio (PDB) ha ridotto significativamente l'espressione del gene SsOAH nei miceli di S. sclerotiorum. Analogamente, l'applicazione esogena di L-ornitina ha ridotto significativamente l'espressione del gene SsOAH nei miceli fungini raccolti da piante trattate. Infine, l'applicazione di L-ornitina ha ridotto significativamente la secrezione di acido ossalico sia nel terreno di coltura PDB che nelle foglie infette. In conclusione, la L-ornitina svolge un ruolo chiave nel mantenimento dello stato redox e nel miglioramento della risposta difensiva delle piante infette. I risultati di questo studio possono contribuire allo sviluppo di metodi innovativi ed ecocompatibili per controllare la muffa bianca e mitigarne l'impatto sulla produzione di fagioli e altre colture.
La muffa bianca, causata dal fungo necrotrofico Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, è una malattia devastante che riduce la resa e rappresenta una seria minaccia per la produzione globale di fagiolo (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum è uno dei patogeni fungini del suolo più difficili da controllare, con un'ampia gamma di ospiti di oltre 600 specie vegetali e la capacità di macerare rapidamente i tessuti ospiti in modo non specifico (Liang e Rollins, 2018). In condizioni sfavorevoli, attraversa una fase critica del suo ciclo vitale, rimanendo dormiente per lunghi periodi di tempo sotto forma di strutture nere, dure e simili a semi chiamate "sclerozi" nel terreno o di escrescenze bianche e soffici nel micelio o nel midollo del fusto delle piante infette (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum è in grado di formare sclerozi, che gli consentono di sopravvivere nei campi infetti per lunghi periodi di tempo e di persistere durante la malattia (Schwartz et al., 2005). Gli sclerozi sono ricchi di nutrienti, possono persistere nel terreno per lunghi periodi e fungono da inoculo primario per le infezioni successive (Schwartz et al., 2005). In condizioni favorevoli, gli sclerozi germinano e producono spore trasportate dall'aria che possono infettare tutte le parti aeree della pianta, inclusi, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, fiori, steli o baccelli (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum utilizza una strategia a più livelli per infettare le piante ospiti, che prevede una serie di eventi coordinati, dalla germinazione degli sclerozi allo sviluppo dei sintomi. Inizialmente, S. sclerotiorum produce spore sospese (chiamate ascospore) da strutture simili a funghi chiamate apoteci, che si diffondono nell'aria e si sviluppano in sclerozi immobili sui detriti vegetali infetti (Bolton et al., 2006). Il fungo secerne quindi acido ossalico, un fattore di virulenza, per controllare il pH della parete cellulare vegetale, promuovere la degradazione enzimatica e l'invasione dei tessuti (Hegedus e Rimmer, 2005) e sopprimere l'esplosione ossidativa della pianta ospite. Questo processo di acidificazione indebolisce la parete cellulare vegetale, fornendo un ambiente favorevole al normale ed efficiente funzionamento degli enzimi che degradano la parete cellulare fungina (CWDE), consentendo al patogeno di superare la barriera fisica e penetrare nei tessuti ospiti (Marciano et al., 1983). Una volta penetrato, S. sclerotiorum secerne diversi CWDE, come la poligalatturonasi e la cellulasi, che ne facilitano la disseminazione nei tessuti infetti e ne causano la necrosi. La progressione delle lesioni e delle ife porta ai sintomi caratteristici della muffa bianca (Hegedus e Rimmer, 2005). Nel frattempo, le piante ospiti riconoscono i pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP) attraverso i recettori di riconoscimento dei pattern (PRR), innescando una serie di eventi di segnalazione che alla fine attivano le risposte di difesa.
Nonostante decenni di sforzi per il controllo delle malattie, nel fagiolo, come in altre colture commerciali, permangono carenze di germoplasma resistente adeguato, a causa della resistenza, della sopravvivenza e dell'adattabilità del patogeno. La gestione delle malattie è quindi estremamente impegnativa e richiede una strategia integrata e multiforme che includa una combinazione di pratiche colturali, controllo biologico e fungicidi chimici (O'Sullivan et al., 2021). Il controllo chimico della muffa bianca è il più efficace perché i fungicidi, se applicati correttamente e al momento giusto, possono controllare efficacemente la diffusione della malattia, ridurre la gravità dell'infezione e minimizzare le perdite di resa. Tuttavia, l'uso eccessivo e l'eccessiva dipendenza dai fungicidi possono portare alla comparsa di ceppi resistenti di S. sclerotiorum e avere un impatto negativo sugli organismi non bersaglio, sulla salute del suolo e sulla qualità dell'acqua (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Pertanto, trovare alternative ecocompatibili è diventata una priorità assoluta.
Le poliammine (PA), come putrescina, spermidina, spermina e cadaverina, possono rappresentare promettenti alternative contro i patogeni vegetali presenti nel suolo, riducendo così completamente o parzialmente l'uso di fungicidi chimici pericolosi (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Nelle piante superiori, le PA sono coinvolte in molti processi fisiologici, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la divisione cellulare, la differenziazione e la risposta a stress abiotici e biotici (Killiny e Nehela, 2020). Possono agire come antiossidanti, aiutare a eliminare le specie reattive dell'ossigeno (ROS), mantenere l'omeostasi redox (Nehela e Killiny, 2023), indurre geni correlati alla difesa (Romero et al., 2018), regolare varie vie metaboliche (Nehela e Killiny, 2023), modulare i fitormoni endogeni (Nehela e Killiny, 2019), stabilire una resistenza acquisita sistemica (SAR) e regolare le interazioni pianta-patogeno (Nehela e Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). È importante notare che i meccanismi e i ruoli specifici degli AP nella difesa delle piante variano a seconda della specie vegetale, dei patogeni e delle condizioni ambientali. L'AP più abbondante nelle piante è biosintetizzata dalla poliammina essenziale L-ornitina (Killiny e Nehela, 2020).
La L-ornitina svolge molteplici ruoli nella crescita e nello sviluppo delle piante. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che nel riso (Oryza sativa), l'ornitina può essere associata al riciclo dell'azoto (Liu et al., 2018), alla resa, alla qualità e all'aroma del riso (Lu et al., 2020) e alla risposta allo stress idrico (Yang et al., 2000). Inoltre, l'applicazione esogena di L-ornitina ha migliorato significativamente la tolleranza alla siccità nella barbabietola da zucchero (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) e ha alleviato lo stress salino nelle piante di cipolla (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu e Çavuşoǧlu, 2021) e anacardio (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Il potenziale ruolo della L-ornitina nella difesa dallo stress abiotico potrebbe essere dovuto al suo coinvolgimento nell'accumulo di prolina nelle piante trattate. Ad esempio, è stato precedentemente segnalato che geni correlati al metabolismo della prolina, come l'ornitina delta aminotransferasi (delta-OAT) e i geni della prolina deidrogenasi (ProDH1 e ProDH2), sono coinvolti nella difesa di Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana contro ceppi non ospiti di Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar e Mysore, 2012). D'altra parte, l'ornitina decarbossilasi fungina (ODC) è necessaria per la crescita del patogeno (Singh et al., 2020). Il targeting dell'ODC di Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici tramite silenziamento genico indotto dall'ospite (HIGS) ha migliorato significativamente la resistenza delle piante di pomodoro alla fusariosi (Singh et al., 2020). Tuttavia, il potenziale ruolo dell'applicazione esogena di ornitina contro stress biotici come quelli causati da fitopatogeni non è stato ancora ben studiato. Ancora più importante, gli effetti dell'ornitina sulla resistenza alle malattie e sui fenomeni biochimici e fisiologici associati restano in gran parte inesplorati.
Comprendere la complessità dell'infezione da S. sclerotiorum nelle leguminose è importante per lo sviluppo di strategie di controllo efficaci. In questo studio, abbiamo mirato a identificare il potenziale ruolo della diammina L-ornitina come fattore chiave nel potenziamento dei meccanismi di difesa e della resistenza delle leguminose all'infezione da Sclerotinia sclerotiorum. Ipotizziamo che, oltre a potenziare le risposte di difesa delle piante infette, la L-ornitina svolga anche un ruolo chiave nel mantenimento dello stato redox. Proponiamo che i potenziali effetti della L-ornitina siano correlati alla regolazione dei meccanismi di difesa antiossidanti enzimatici e non enzimatici e all'interferenza con i fattori di patogenicità/virulenza fungini e le proteine ​​associate. Questa duplice funzionalità della L-ornitina la rende un candidato promettente per una strategia sostenibile volta a mitigare l'impatto della muffa bianca e a migliorare la resistenza delle comuni colture di leguminose a questo potente patogeno fungino. I risultati del presente studio potrebbero contribuire allo sviluppo di metodi innovativi ed ecocompatibili per controllare la muffa bianca e mitigarne l'impatto sulla produzione di leguminose.
In questo studio, è stata utilizzata come materiale sperimentale una varietà commerciale suscettibile di fagiolo comune, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Semi sani sono stati gentilmente forniti dal Legume Research Department, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Egitto. Cinque semi sono stati seminati in vasi di plastica (diametro interno 35 cm, profondità 50 cm) riempiti con terreno infetto da S. sclerotiorum in condizioni di serra (25 ± 2 °C, umidità relativa 75 ± 1%, 8 ore di luce/16 ore di buio). Dopo 7-10 giorni dalla semina (DPS), le piantine sono state diradate in modo da lasciare solo due piantine con crescita uniforme e tre foglie completamente espanse in ogni vaso. Tutte le piante in vaso sono state annaffiate una volta ogni due settimane e concimate mensilmente alla dose raccomandata per la varietà in questione.
Per preparare una concentrazione di 500 mg/L di L-ornitinediammina (nota anche come acido (+)-(S)-2,5-diamminopentanoico; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), 50 mg sono stati prima sciolti in 100 mL di acqua distillata sterile. La soluzione madre è stata quindi diluita e utilizzata negli esperimenti successivi. In breve, sei serie di concentrazioni di L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) sono state testate in vitro. Inoltre, è stata utilizzata acqua distillata sterile come controllo negativo (Mock) e il fungicida commerciale "Rizolex-T" in polvere bagnabile al 50% (toclofos-metile 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Governatorato di Gharbia, Egitto) è stato utilizzato come controllo positivo. Il fungicida commerciale “Rizolex-T” è stato testato in vitro a cinque concentrazioni (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L).
Campioni di steli e baccelli di fagiolo comune che mostravano i tipici sintomi della muffa bianca (tasso di infestazione: 10-30%) sono stati raccolti da aziende agricole commerciali. Sebbene la maggior parte del materiale vegetale infetto fosse identificata per specie/varietà (varietà commerciale suscettibile Giza 3), altri, soprattutto quelli ottenuti dai mercati locali, appartenevano a specie sconosciute. Il materiale infetto raccolto è stato prima disinfettato superficialmente con una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5% per 3 minuti, quindi risciacquato più volte con acqua distillata sterile e asciugato con carta da filtro sterile per rimuovere l'acqua in eccesso. Gli organi infetti sono stati quindi tagliati in piccoli pezzi dal tessuto intermedio (tra i tessuti sani e infetti), coltivati ​​su terreno di coltura agar destrosio di patata (PDA) e incubati a 25 ± 2 °C con un ciclo di 12 ore di luce/12 ore di buio per 5 giorni per stimolare la formazione di sclerozi. Il metodo della punta miceliare è stato utilizzato anche per purificare isolati fungini da colture miste o contaminate. L'isolato fungino purificato è stato inizialmente identificato in base alle sue caratteristiche morfologiche colturali e poi confermato come S. sclerotiorum in base alle caratteristiche microscopiche. Infine, tutti gli isolati purificati sono stati testati per la patogenicità sulla cultivar di fagiolo comune suscettibile Giza 3, per soddisfare i postulati di Koch.
Inoltre, l'isolato di S. sclerotiorum più invasivo (isolato n. 3) è stato ulteriormente confermato sulla base del sequenziamento con spaziatore trascritto interno (ITS) come descritto da White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. In breve, gli isolati sono stati coltivati ​​in brodo di patata e destrosio (PDB) e incubati a 25 ± 2 °C per 5-7 giorni. Il micelio fungino è stato quindi raccolto, filtrato attraverso una garza, lavato due volte con acqua sterile e asciugato con carta da filtro sterile. Il DNA genomico è stato isolato utilizzando il kit Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). La regione rDNA dell'ITS è stata quindi amplificata utilizzando la coppia di primer specifici ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; dimensione prevista: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). I prodotti di PCR purificati sono stati inviati per il sequenziamento (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Le sequenze rDNA dell'ITS sono state sequenziate bidirezionalmente utilizzando il metodo di sequenziamento Sanger. Le sequenze di query assemblate sono state quindi confrontate con i dati più recenti di GenBank e del National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) utilizzando il software BLASTn. La sequenza di query è stata confrontata con altri 20 ceppi/isolati di S. sclerotiorum recuperati dai dati più recenti in NCBI GenBank (Tabella Supplementare S1) utilizzando ClustalW nel pacchetto di analisi genetica evolutiva molecolare (MEGA-11; versione 11) (Kumar et al., 2024). L'analisi evolutiva è stata eseguita utilizzando il metodo della massima verosimiglianza e il modello generale di sostituzione nucleotidica reversibile nel tempo (Nei e Kumar, 2000). È mostrato l'albero con la più alta verosimiglianza logaritmica. L'albero iniziale per la ricerca euristica viene selezionato scegliendo l'albero con la più alta verosimiglianza logaritmica tra l'albero di neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) e l'albero di massima parsimonia (MP). L'albero NJ è stato costruito utilizzando una matrice di distanza a coppie calcolata utilizzando il modello generale reversibile nel tempo (Nei e Kumar, 2000).
L'attività antibatterica della L-ornitina e del battericida "Rizolex-T" è stata determinata in vitro mediante il metodo di diffusione in agar. Metodo: Prelevare la quantità appropriata di soluzione madre di L-ornitina (500 mg/L) e mescolarla accuratamente con 10 ml di terreno nutritivo PDA per preparare soluzioni con concentrazioni finali rispettivamente di 12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L. Cinque concentrazioni del fungicida "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L) e acqua distillata sterile sono state utilizzate come controllo. Dopo la solidificazione del terreno, un tampone miceliale appena preparato di coltura di Sclerotinia sclerotiorum, di 4 mm di diametro, è stato trasferito al centro della piastra Petri e coltivato a 25±2 °C fino a quando il micelio non ha ricoperto l'intera piastra Petri di controllo, dopodiché è stata registrata la crescita fungina. Calcolare la percentuale di inibizione della crescita radiale di S. sclerotiorum utilizzando l'equazione 1:
L'esperimento è stato ripetuto due volte, con sei repliche biologiche per ciascun gruppo di controllo/sperimentale e cinque vasi (due piante per vaso) per ciascuna replica biologica. Ogni replica biologica è stata analizzata due volte (due repliche tecniche) per garantire l'accuratezza, l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati sperimentali. Inoltre, è stata utilizzata l'analisi di regressione probit per calcolare la concentrazione inibitoria semimassimale (IC50) e l'IC99 (Prentice, 1976).
Per valutare il potenziale della L-ornitina in condizioni di serra, sono stati condotti due esperimenti consecutivi in ​​vaso. In breve, i vasi sono stati riempiti con terreno argilloso-sabbioso sterilizzato (3:1) e inoculati con una coltura di S. sclerotiorum appena preparata. Innanzitutto, l'isolato più invasivo di S. sclerotiorum (isolato n. 3) è stato coltivato tagliando a metà uno sclerozio, posizionandolo a faccia in giù su un PDA e incubandolo a 25 °C in buio costante (24 ore) per 4 giorni per stimolare la crescita miceliale. Quattro tamponi di agar di 5 mm di diametro sono stati quindi prelevati dal bordo anteriore e inoculati con 100 g di una miscela sterile di crusca di frumento e riso (1:1, v/v) e tutte le fiasche sono state incubate a 25 ± 2 °C con un ciclo di 12 ore di luce/12 ore di buio per 5 giorni per stimolare la formazione di sclerozi. Il contenuto di tutte le fiasche è stato accuratamente miscelato per garantire l'omogeneità prima di aggiungere il terreno. Successivamente, 100 g della miscela di crusca colonizzante sono stati aggiunti a ciascun vaso per garantire una concentrazione costante di patogeni. I vasi inoculati sono stati annaffiati per attivare la crescita fungina e posti in condizioni di serra per 7 giorni.
In ogni vaso sono stati quindi seminati cinque semi della varietà Giza 3. Per i vasi trattati con L-ornitina e il fungicida Rizolex-T, i semi sterilizzati sono stati prima immersi per due ore in una soluzione acquosa dei due composti con una concentrazione finale di IC99 di circa 250 mg/L e 50 mg/L, rispettivamente, e poi essiccati all'aria per un'ora prima della semina. D'altra parte, i semi sono stati immersi in acqua distillata sterile come controllo negativo. Dopo 10 giorni, prima della prima irrigazione, le piantine sono state diradate, lasciando solo due piantine sane in ogni vaso. Inoltre, per garantire l'infezione da S. sclerotiorum, i fusti di piante di fagiolo allo stesso stadio di sviluppo (10 giorni) sono stati tagliati in due punti diversi utilizzando un bisturi sterilizzato e circa 0,5 g della miscela di crusca colonizzante sono stati inseriti in ogni ferita, seguita da un'elevata umidità per stimolare l'infezione e lo sviluppo della malattia in tutte le piante inoculate. Le piante di controllo sono state ferite in modo simile e una quantità uguale (0,5 g) di miscela di crusca sterile e non colonizzata è stata inserita nella ferita e mantenuta in condizioni di elevata umidità per simulare l'ambiente adatto allo sviluppo della malattia e garantire la coerenza tra i gruppi di trattamento.
Metodo di trattamento: Le piantine di fagiolo sono state irrigate con 500 ml di una soluzione acquosa di L-ornitina (250 mg/l) o del fungicida Rizolex-T (50 mg/l) irrigando il terreno, quindi il trattamento è stato ripetuto tre volte a intervalli di 10 giorni. I controlli trattati con placebo sono stati irrigati con 500 ml di acqua distillata sterile. Tutti i trattamenti sono stati effettuati in condizioni di serra (25 ± 2 °C, 75 ± 1% di umidità relativa e un fotoperiodo di 8 ore di luce/16 ore di buio). Tutti i vasi sono stati irrigati ogni due settimane e trattati mensilmente con un fertilizzante NPK bilanciato (20-20-20, con il 3,6% di zolfo e microelementi TE; Zain Seeds, Egitto) a una concentrazione di 3-4 g/l mediante irrorazione fogliare secondo le raccomandazioni per la varietà specifica e le istruzioni del produttore. Salvo diversa indicazione, le foglie mature completamente espanse (2a e 3a foglia dall'alto) sono state raccolte da ciascuna replica biologica a 72 ore dal trattamento (hpt), omogeneizzate, riunite e conservate a -80 °C per ulteriori analisi, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la localizzazione istochimica in situ degli indicatori di stress ossidativo, della perossidazione lipidica, degli antiossidanti enzimatici e non enzimatici e dell'espressione genica.
L'intensità dell'infezione da muffa bianca è stata valutata settimanalmente 21 giorni dopo l'inoculazione (dpi) utilizzando una scala da 1 a 9 (Tabella Supplementare S2) basata sulla scala di Petzoldt e Dickson (1996) modificata da Teran et al. (2006). In breve, i fusti e i rami delle piante di fagiolo sono stati esaminati a partire dal punto di inoculazione per seguire la progressione delle lesioni lungo internodi e nodi. È stata quindi misurata la distanza della lesione dal punto di inoculazione al punto più lontano lungo il fusto o il ramo e un punteggio da 1 a 9 è stato assegnato in base alla posizione della lesione, dove (1) indicava l'assenza di infezione visibile in prossimità del punto di inoculazione e (2-9) indicava un graduale aumento delle dimensioni della lesione e della progressione lungo nodi/internodi (Tabella Supplementare S2). L'intensità dell'infezione da muffa bianca è stata quindi convertita in percentuale utilizzando la formula 2:
Inoltre, l'area sotto la curva di progressione della malattia (AUDPC) è stata calcolata utilizzando la formula (Shaner e Finney, 1977), che è stata recentemente adattata per il marciume bianco del fagiolo comune (Chauhan et al., 2020) utilizzando l'equazione 3:
Dove Yi = gravità della malattia al tempo ti, Yi+1 = gravità della malattia al tempo successivo ti+1, ti = tempo della prima misurazione (in giorni), ti+1 = tempo della misurazione successiva (in giorni), n = numero totale di punti temporali o punti di osservazione. I parametri di crescita delle piante di fagiolo, tra cui altezza della pianta (cm), numero di rami per pianta e numero di foglie per pianta, sono stati registrati settimanalmente per 21 giorni in tutte le repliche biologiche.
In ogni replica biologica, campioni di foglie (seconda e terza foglia completamente sviluppata dall'alto) sono stati raccolti il ​​45° giorno dopo il trattamento (15 giorni dopo l'ultimo trattamento). Ogni replica biologica era composta da cinque vasi (due piante per vaso). Circa 500 mg del tessuto frantumato sono stati utilizzati per l'estrazione dei pigmenti fotosintetici (clorofilla a, clorofilla b e carotenoidi) utilizzando acetone all'80% a 4 °C al buio. Dopo 24 ore, i campioni sono stati centrifugati e il surnatante è stato raccolto per la determinazione del contenuto di clorofilla a, clorofilla b e carotenoidi per via colorimetrica utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone) secondo il metodo di (Lichtenthaler, 1987) misurando l'assorbanza a tre diverse lunghezze d'onda (A470, A646 e A663 nm). Infine, il contenuto di pigmenti fotosintetici è stato calcolato utilizzando le seguenti formule 4–6 descritte da Lichtenthaler (1987).
A 72 ore dal trattamento (hpt), le foglie (seconda e terza foglia completamente sviluppata dall'alto) sono state raccolte da ciascuna replica biologica per la localizzazione istochimica in situ del perossido di idrogeno (H2O2) e dell'anione superossido (O2•−). Ogni replica biologica era composta da cinque vasi (due piante per vaso). Ogni replica biologica è stata analizzata in duplicato (due repliche tecniche) per garantire l'accuratezza, l'affidabilità e la riproducibilità del metodo. H2O2 e O2•− sono stati determinati utilizzando rispettivamente lo 0,1% di 3,3'-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) o nitroblu di tetrazolio (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), seguendo i metodi descritti da Romero-Puertas et al. (2004) e Adam et al. (1989) con piccole modifiche. Per la localizzazione istochimica di H₂O₂ in situ, i lembi sono stati infiltrati sotto vuoto con DAB allo 0,1% in tampone Tris 10 mM (pH 7,8) e poi incubati a temperatura ambiente alla luce per 60 minuti. I lembi sono stati sbiancati in TCA allo 0,15% (v/v) in etanolo:cloroformio 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Il Cairo, Egitto) e poi esposti alla luce fino a quando non si sono scuriti. Analogamente, le valvole sono state infiltrate sotto vuoto con tampone fosfato di potassio 10 mM (pH 7,8) contenente 0,1% p/v di HBT per la localizzazione istochimica di O₂₂− in situ. I lembi sono stati incubati alla luce a temperatura ambiente per 20 minuti, poi sbiancati come sopra e infine illuminati fino alla comparsa di macchie blu scuro/viola. L'intensità del colore marrone risultante (come indicatore di H2O2) o blu-violetto (come indicatore di O2•−) è stata valutata utilizzando la versione Fiji del pacchetto di elaborazione delle immagini ImageJ (http://fiji.sc; consultato il 7 marzo 2024).
La malondialdeide (MDA; come marcatore della perossidazione lipidica) è stata determinata secondo il metodo di Du e Bramlage (1992) con lievi modifiche. Le foglie di ciascuna replica biologica (seconda e terza foglia completamente sviluppata dall'alto) sono state raccolte 72 ore dopo il trattamento (hpt). Ogni replica biologica includeva cinque vasi (due piante per vaso). Ogni replica biologica è stata analizzata in duplicato (due repliche tecniche) per garantire l'accuratezza, l'affidabilità e la riproducibilità del metodo. In breve, 0,5 g di tessuto fogliare macinato sono stati utilizzati per l'estrazione di MDA con acido tricloroacetico al 20% (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) contenente lo 0,01% di butilidrossitoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Il contenuto di MDA nel surnatante è stato quindi determinato colorimetricamente misurando l'assorbanza a 532 e 600 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone) e quindi espresso come nmol g−1 FW.
Per la valutazione degli antiossidanti enzimatici e non enzimatici, le foglie (seconda e terza foglia completamente sviluppata dall'alto) sono state raccolte da ciascuna replica biologica a 72 ore dal trattamento (hpt). Ogni replica biologica era composta da cinque vasi (due piante per vaso). Ogni campione biologico è stato analizzato in duplicato (due campioni tecnici). Due foglie sono state macinate con azoto liquido e utilizzate direttamente per la determinazione degli antiossidanti enzimatici e non enzimatici, degli amminoacidi totali, del contenuto di prolina, dell'espressione genica e della quantificazione degli ossalati.
I fenoli solubili totali sono stati determinati utilizzando il reagente Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) con lievi modifiche al metodo descritto da Kahkonen et al. (1999). In breve, circa 0,1 g di tessuto fogliare omogeneizzato sono stati estratti con 20 ml di metanolo all'80% al buio per 24 ore e il surnatante è stato raccolto dopo centrifugazione. 0,1 ml dell'estratto del campione sono stati miscelati con 0,5 ml di reagente Folin-Ciocalteu (10%), agitati per 30 secondi e lasciati al buio per 5 minuti. Quindi, 0,5 ml di soluzione di carbonato di sodio al 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Il Cairo, Egitto) sono stati aggiunti a ciascuna provetta, mescolati accuratamente e incubati a temperatura ambiente al buio per 1 ora. Dopo l'incubazione, l'assorbanza della miscela di reazione è stata misurata a 765 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone). La concentrazione di fenoli solubili totali negli estratti del campione è stata determinata utilizzando una curva di calibrazione dell'acido gallico (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ed espressa come milligrammi di acido gallico equivalente per grammo di peso fresco (mg GAE g-1 peso fresco).
Il contenuto totale di flavonoidi solubili è stato determinato secondo il metodo di Djeridane et al. (2006) con lievi modifiche. In breve, 0,3 ml dell'estratto metanolo sopra indicato sono stati miscelati con 0,3 ml di soluzione di cloruro di alluminio al 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), agitati energicamente e quindi incubati a temperatura ambiente per 5 minuti, seguiti dall'aggiunta di 0,3 ml di soluzione di acetato di potassio al 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Il Cairo, Egitto), miscelati accuratamente e incubati a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Dopo l'incubazione, l'assorbanza della miscela di reazione è stata misurata a 430 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone). La concentrazione di flavonoidi solubili totali negli estratti campione è stata determinata utilizzando una curva di calibrazione della rutina (TCI America, Portland, OR, USA) e quindi espressa come milligrammi di rutina equivalente per grammo di peso fresco (mg RE g-1 peso fresco).
Il contenuto totale di aminoacidi liberi nelle foglie di fagiolo è stato determinato utilizzando un reagente a base di ninidrina modificato (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) basato sul metodo proposto da Yokoyama e Hiramatsu (2003) e modificato da Sun et al. (2006). In breve, 0,1 g di tessuto macinato sono stati estratti con tampone a pH 5,4 e 200 μL del surnatante sono stati fatti reagire con 200 μL di ninidrina (2%) e 200 μL di piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), incubati in un bagno d'acqua bollente per 30 minuti, quindi raffreddati e misurati a 580 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone). D'altra parte, la prolina è stata determinata con il metodo Bates (Bates et al., 1973). La prolina è stata estratta con acido solfosalicilico al 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) e, dopo centrifugazione, 0,5 ml del surnatante sono stati miscelati con 1 ml di acido acetico glaciale (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) e reagente ninidrina, incubati a 90 °C per 45 minuti, raffreddati e misurati a 520 nm utilizzando lo stesso spettrofotometro di cui sopra. Gli amminoacidi liberi totali e la prolina negli estratti fogliari sono stati determinati utilizzando rispettivamente le curve di calibrazione di glicina e prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ed espressi come mg/g di peso fresco.
Per determinare l'attività enzimatica degli enzimi antiossidanti, circa 500 mg di tessuto omogeneizzato sono stati estratti con 3 ml di tampone Tris 50 mM (pH 7,8) contenente 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e 7,5% di polivinilpirrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugati a 10.000 × g per 20 min in frigorifero (4 °C) e il surnatante (estratto enzimatico grezzo) è stato raccolto (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). La catalasi (CAT) è stata quindi fatta reagire con 2 ml di tampone fosfato di sodio 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e 100 μl di soluzione di H2O2 269 mM per determinarne l'attività enzimatica secondo il metodo di Aebi (1984) con lievi modifiche (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). L'attività enzimatica della perossidasi guaiacolo-dipendente (POX) è stata determinata utilizzando il metodo di Harrach et al. (2009). (2008) con piccole modifiche (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) e l'attività enzimatica della polifenol ossidasi (PPO) è stata determinata dopo reazione con 2,2 ml di tampone fosfato di sodio 100 mM (pH 6,0), 100 μl di guaiacolo (TCI chemicals, Portland, OR, USA) e 100 μl di H2O2 12 mM. Il metodo è stato leggermente modificato rispetto a (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Il test è stato eseguito dopo reazione con 3 ml di soluzione di catecolo (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) preparata di fresco in tampone fosfato 0,1 M (pH 6,0). L'attività CAT è stata misurata monitorando la decomposizione di H2O2 a 240 nm (A240), l'attività POX è stata misurata monitorando l'aumento dell'assorbanza a 436 nm (A436) e l'attività PPO è stata misurata registrando le fluttuazioni dell'assorbanza a 495 nm (A495) ogni 30 s per 3 min utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu, Giappone).
La RT-PCR in tempo reale è stata utilizzata per rilevare i livelli di trascrizione di tre geni correlati agli antiossidanti, tra cui la catalasi perossisomiale (PvCAT1; numero di accesso GenBank KF033307.1), la superossido dismutasi (PvSOD; numero di accesso GenBank XM_068639556.1) e la glutatione reduttasi (PvGR; numero di accesso GenBank KY195009.1), nelle foglie di fagiolo (la seconda e la terza foglia completamente sviluppate dall'alto) 72 ore dopo l'ultimo trattamento. In breve, l'RNA è stato isolato utilizzando il kit di estrazione di RNA totale Simply P (numero di catalogo BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Cina) secondo il protocollo del produttore. Successivamente, il cDNA è stato sintetizzato utilizzando il kit di sintesi di cDNA TOP script™ secondo le istruzioni del produttore. Le sequenze dei primer dei tre geni sopra menzionati sono elencate nella Tabella supplementare S3. PvActin-3 (numero di accesso GenBank: XM_068616709.1) è stato utilizzato come gene housekeeping e l'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001). È stata dimostrata la stabilità dell'actina in condizioni di stress biotico (interazione incompatibile tra leguminose comuni e il fungo antracnoso Colletotrichum lindemuthianum) e abiotico (siccità, salinità, basse temperature) (Borges et al., 2012).
Inizialmente abbiamo eseguito un'analisi in silico a livello genomico delle proteine ​​ossalacetato acetilidrolasi (OAH) in S. sclerotiorum utilizzando lo strumento BLAST proteina-proteina (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). In breve, abbiamo utilizzato OAH da Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; numero di accesso GenBank XP_040799428.1; 342 aminoacidi) e Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; numero di accesso GenBank XP_056833920.1; 316 aminoacidi) come sequenze di query per mappare la proteina omologa in S. sclerotiorum (taxide: 5180). BLASTp è stato eseguito sui dati del genoma di S. sclerotiorum più recentemente disponibili in GenBank sul sito web del National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Inoltre, il gene OAH previsto da S. sclerotiorum (SsOAH) e l'analisi evolutiva e l'albero filogenetico di AfOAH da A. fijiensis CBS 313.89 e PlOAH da P. lagena sono stati dedotti utilizzando il metodo della massima verosimiglianza in MEGA11 (Tamura et al., 2021) e il modello basato sulla matrice JTT (Jones et al., 1992). L'albero filogenetico è stato combinato con l'analisi di allineamento multiplo delle sequenze proteiche di tutti i geni OAH previsti (SsOAH) da S. sclerotiorum e la sequenza di query utilizzando il Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos e Agarwala, 2007). Inoltre, le sequenze di amminoacidi più corrispondenti di SsOAH da S. sclerotiorum sono state allineate con le sequenze di query (AfOAH e PlOAH) (Larkin et al., 2007) utilizzando ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) e le regioni conservate nell'allineamento sono state visualizzate utilizzando lo strumento ESPript (versione 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Inoltre, i domini rappresentativi funzionali previsti e i siti conservati di SsOAH di S. sclerotiorum sono stati classificati interattivamente in diverse famiglie utilizzando lo strumento InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Infine, la modellazione strutturale tridimensionale (3D) della SsOAH prevista di S. sclerotiorum è stata eseguita utilizzando il Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server versione 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) e convalidata utilizzando il server SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Le strutture tridimensionali previste (formato PDB) sono state visualizzate interattivamente utilizzando il pacchetto UCSF-Chimera (versione 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
La PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale è stata utilizzata per determinare il livello trascrizionale dell'ossalacetato acetilidrolasi (SsOAH; numero di accesso GenBank: XM_001590428.1) nel micelio di Sclerotinia sclerotiorum. In breve, S. sclerotiorum è stato inoculato in una fiasca contenente PDB e posto in un incubatore con agitazione (modello: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) a 25 ± 2 °C per 24 ore a 150 rpm e in oscurità costante (24 ore) per stimolare la crescita miceliale. Successivamente, le cellule sono state trattate con L-ornitina e il fungicida Rizolex-T alle concentrazioni finali di IC50 (rispettivamente circa 40 e 3,2 mg/L) e quindi coltivate per altre 24 ore nelle stesse condizioni. Dopo l'incubazione, le colture sono state centrifugate a 2500 rpm per 5 minuti e il surnatante (micelio fungino) è stato raccolto per l'analisi dell'espressione genica. Analogamente, il micelio fungino è stato raccolto a 0, 24, 48, 72, 96 e 120 ore dopo l'infezione da piante infette che avevano formato muffa bianca e micelio cotonoso sulla superficie dei tessuti infetti. L'RNA è stato estratto dal micelio fungino e quindi il cDNA è stato sintetizzato come descritto sopra. Le sequenze dei primer per SsOAH sono elencate nella Tabella Supplementare S3. SsActin (numero di accesso GenBank: XM_001589919.1) è stato utilizzato come gene housekeeping e l'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001).
L'acido ossalico è stato determinato in brodo di patata destrosio (PDB) e campioni vegetali contenenti il ​​patogeno fungino Sclerotinia sclerotiorum secondo il metodo di Xu e Zhang (2000) con lievi modifiche. In breve, gli isolati di S. sclerotiorum sono stati inoculati in fiasche contenenti PDB e quindi coltivati ​​in un incubatore con agitazione (modello I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) a 150 rpm a 25 ± 2 °C per 3-5 giorni in oscurità costante (24 ore) per stimolare la crescita miceliale. Dopo l'incubazione, la coltura fungina è stata prima filtrata su carta da filtro Whatman n. 1 e poi centrifugata a 2500 rpm per 5 minuti per rimuovere il micelio residuo. Il surnatante è stato raccolto e conservato a 4 °C per un'ulteriore determinazione quantitativa dell'ossalato. Per la preparazione dei campioni vegetali, circa 0,1 g di frammenti di tessuto vegetale sono stati estratti tre volte con acqua distillata (2 ml ciascuna). I campioni sono stati quindi centrifugati a 2500 giri al minuto per 5 minuti, il surnatante è stato filtrato a secco su carta da filtro Whatman n. 1 e raccolto per ulteriori analisi.
Per l'analisi quantitativa dell'acido ossalico, la miscela di reazione è stata preparata in una provetta con tappo di vetro nel seguente ordine: 0,2 ml di campione (o filtrato di coltura PDB o soluzione standard di acido ossalico), 0,11 ml di blu di bromofenolo (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml di acido solforico 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Il Cairo, Egitto) e 0,176 ml di bicromato di potassio 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA); la soluzione è stata quindi diluita a 4,8 ml con acqua distillata, mescolata energicamente e immediatamente posta in un bagno d'acqua a 60 °C. Dopo 10 minuti, la reazione è stata interrotta aggiungendo 0,5 ml di soluzione di idrossido di sodio (NaOH; 0,75 M). L'assorbanza (A600) della miscela di reazione è stata misurata a 600 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-160 (Shimadzu Corporation, Giappone). PDB e acqua distillata sono stati utilizzati come controlli per la quantificazione rispettivamente dei filtrati di coltura e dei campioni vegetali. Le concentrazioni di acido ossalico nei filtrati di coltura, espresse come microgrammi di acido ossalico per millilitro di terreno PDB (μg.mL−1), e negli estratti fogliari, espresse come microgrammi di acido ossalico per grammo di peso fresco (μg.g−1 FW), sono state determinate utilizzando una curva di calibrazione dell'acido ossalico (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Durante lo studio, tutti gli esperimenti sono stati progettati secondo un disegno completamente randomizzato (CRD) con sei repliche biologiche per trattamento e cinque vasi per replica biologica (due piante per vaso), salvo diversa indicazione. Le repliche biologiche sono state analizzate in duplicato (due repliche tecniche). Le repliche tecniche sono state utilizzate per verificare la riproducibilità dello stesso esperimento, ma non sono state utilizzate nell'analisi statistica per evitare repliche spurie. I dati sono stati analizzati statisticamente utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA) seguita dal test di differenza onestamente significativa (HSD) di Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Per gli esperimenti in vitro, i valori di IC50 e IC99 sono stati calcolati utilizzando il modello probit e sono stati calcolati gli intervalli di confidenza al 95%.
Sono stati raccolti in totale quattro isolati da diversi campi di soia nel governatorato di El Ghabiya, in Egitto. Su terreno di coltura in PDA, tutti gli isolati hanno prodotto un micelio bianco crema che è rapidamente diventato bianco cotonoso (Figura 1A) e poi beige o marrone allo stadio di sclerozio. Gli sclerozi sono solitamente densi, neri, di forma sferica o irregolare, lunghi da 5,2 a 7,7 mm e con un diametro da 3,4 a 5,3 mm (Figura 1B). Sebbene quattro isolati abbiano sviluppato una distribuzione marginale di sclerozi ai margini del terreno di coltura dopo 10-12 giorni di incubazione a 25 ± 2 °C (Fig. 1A), il numero di sclerozi per piastra è risultato significativamente diverso tra loro (P < 0,001), con l'isolato 3 che presentava il numero più elevato di sclerozi (32,33 ± 1,53 sclerozi per piastra; Fig. 1C). Analogamente, l'isolato n. 3 ha prodotto più acido ossalico in PDB rispetto ad altri isolati (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). L'isolato n. 3 ha mostrato caratteristiche morfologiche e microscopiche tipiche del fungo fitopatogeno Sclerotinia sclerotiorum. Ad esempio, su PDA, le colonie dell'isolato n. 3 sono cresciute rapidamente, erano di colore bianco crema (Figura 1A), beige invertito o giallo-marrone salmone chiaro e hanno richiesto 6-7 giorni a 25 ± 2 °C per coprire completamente la superficie di una piastra di 9 cm di diametro. Sulla base delle caratteristiche morfologiche e microscopiche sopra descritte, l'isolato n. 3 è stato identificato come Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Caratteristiche e patogenicità degli isolati di S. sclerotiorum da colture di leguminose comuni. (A) Crescita miceliale di quattro isolati di S. sclerotiorum su terreno PDA, (B) sclerozi di quattro isolati di S. sclerotiorum, (C) numero di sclerozi (per piastra), (D) secrezione di acido ossalico su terreno PDB (μg.mL−1) e (E) gravità della malattia (%) di quattro isolati di S. sclerotiorum su cultivar di leguminose commerciali suscettibili Giza 3 in condizioni di serra. I valori rappresentano la media ± DS di cinque repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i trattamenti (p < 0,05). (F–H) I tipici sintomi della muffa bianca sono comparsi rispettivamente sui fusti e sulle silique fuori terra, 10 giorni dopo l'inoculazione con l'isolato n. 3 (dpi). (I) L'analisi evolutiva della regione dello spaziatore trascritto interno (ITS) dell'isolato n. 3 di S. sclerotiorum è stata eseguita utilizzando il metodo della massima verosimiglianza e confrontata con 20 isolati/ceppi di riferimento ottenuti dal database del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). I numeri sopra le linee di clustering indicano la copertura della regione (%), mentre i numeri sotto le linee di clustering indicano la lunghezza del ramo.
Inoltre, per confermare la patogenicità, quattro isolati di S. sclerotiorum ottenuti sono stati utilizzati per inoculare la cultivar di fagiolo commerciale suscettibile Giza 3 in condizioni di serra, il che è coerente con i postulati di Koch (Fig. 1E). Sebbene tutti gli isolati fungini ottenuti fossero patogeni e potessero infettare il fagiolo verde (cv. Giza 3), causando i tipici sintomi della muffa bianca su tutte le parti aeree (Fig. 1F), in particolare su steli (Fig. 1G) e baccelli (Fig. 1H) a 10 giorni dall'inoculazione (dpi), l'isolato 3 è risultato l'isolato più aggressivo in due esperimenti indipendenti. L'isolato 3 ha mostrato la più alta gravità della malattia (%) sulle piante di fagiolo (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 e 76,7 ± 3,1 rispettivamente a 7, 14 e 21 giorni dall'infezione; Figura 1F).
L'identificazione dell'isolato di S. sclerotiorum più invasivo n. 3 è stata ulteriormente confermata sulla base del sequenziamento con tecnica ITS (Internal Transcribed Spacer) (Fig. 1I). L'analisi filogenetica tra l'isolato n. 3 e 20 isolati/ceppi di riferimento ha mostrato un'elevata similarità (>99%). È interessante notare che l'isolato di S. sclerotiorum n. 3 (533 bp) presenta un'elevata similarità con l'isolato americano di S. sclerotiorum LPM36, isolato da semi di pisello secchi (numero di accesso GenBank MK896659.1; 540 bp) e con l'isolato cinese di S. sclerotiorum YKY211 (numero di accesso GenBank OR206374.1; 548 bp), che causa il marciume dello stelo della violetta (Matthiola incana), tutti raggruppati separatamente nella parte superiore del dendrogramma (Figura 1I). La nuova sequenza è stata depositata nel database NCBI e denominata "Sclerotinia sclerotiorum – isolato YN-25" (numero di accesso GenBank PV202792). Come si può osservare, l'isolato 3 è quello più invasivo; pertanto, è stato scelto per lo studio in tutti gli esperimenti successivi.
L'attività antibatterica della diammina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) a diverse concentrazioni (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) contro l'isolato 3 di S. sclerotiorum è stata studiata in vitro. È interessante notare che la L-ornitina ha esercitato un effetto antibatterico e ha gradualmente inibito la crescita radiale delle ife di S. sclerotiorum in modo dose-dipendente (Figura 2A, B). Alla massima concentrazione testata (125 mg/L), la L-ornitina ha dimostrato il più alto tasso di inibizione della crescita miceliale (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), equivalente al fungicida commerciale Rizolex-T (tasso di inibizione 99,45 ± 0,39%; Figura 2C) alla massima concentrazione testata (10 mg/L), indicando un'efficacia simile.
Figura 2. Attività antibatterica in vitro della L-ornitina contro Sclerotinia sclerotiorum. (A) Confronto dell'attività antibatterica di diverse concentrazioni di L-ornitina contro S. sclerotiorum con il fungicida commerciale Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Tasso di inibizione (%) della crescita miceliare di S. sclerotiorum dopo trattamento con diverse concentrazioni di L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) o Rizolex-T (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L), rispettivamente. I valori rappresentano la media ± DS di cinque repliche biologiche (n = 5). Le diverse lettere indicano differenze statistiche tra i trattamenti (p < 0,05). (D, E) Analisi di regressione del modello probit rispettivamente per L-ornitina e fungicida commerciale Rizolex-T. La retta di regressione del modello probit è rappresentata da una linea blu continua, mentre l'intervallo di confidenza (95%) è rappresentato da una linea rossa tratteggiata.
Inoltre, è stata eseguita un'analisi di regressione probit e i grafici corrispondenti sono mostrati nella Tabella 1 e nelle Figure 2D,E. In breve, il valore di pendenza accettabile (y = 2,92x − 4,67) e le statistiche significative associate (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 e p < 0,0001; Figura 2D) della L-ornitina hanno indicato un'attività antifungina migliorata contro S. sclerotiorum rispetto al fungicida commerciale Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 e p < 0,0001) (Tabella 1).
Tabella 1. Valori della concentrazione inibitoria massima (IC50) e IC99 (mg/l) di L-ornitina e del fungicida commerciale “Rizolex-T” contro S. sclerotiorum.
Nel complesso, la L-ornitina (250 mg/L) ha ridotto significativamente lo sviluppo e la gravità della muffa bianca sulle piante di fagiolo comune trattate rispetto alle piante infette da S. sclerotiorum non trattate (controllo; Figura 3A). In breve, sebbene la gravità della malattia nelle piante di controllo infette non trattate sia gradualmente aumentata (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 e 92,33 ± 3,06%), la L-ornitina ha ridotto significativamente la gravità della malattia (%) durante l'esperimento (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 e 26,36 ± 3,07) rispettivamente a 7, 14 e 21 giorni dal trattamento (dpt) (Figura 3A). Allo stesso modo, quando le piante di fagiolo infette da S. sclerotiorum sono state trattate con 250 mg/L di L-ornitina, l'area sotto la curva di progressione della malattia (AUDPC) è diminuita da 1274,33 ± 33,13 nel controllo non trattato a 281,03 ± 7,95, un valore leggermente inferiore a quello del controllo positivo trattato con 50 mg/L di fungicida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). La stessa tendenza è stata osservata nel secondo esperimento.
Fig. 3. Effetto dell'applicazione esogena di L-ornitina sullo sviluppo del marciume bianco del fagiolo comune causato da Sclerotinia sclerotiorum in condizioni di serra. (A) Curva di progressione della malattia della muffa bianca del fagiolo comune dopo il trattamento con 250 mg/L di L-ornitina. (B) Area sotto la curva di progressione della malattia (AUDPC) della muffa bianca del fagiolo comune dopo il trattamento con L-ornitina. I valori rappresentano la media ± DS di cinque repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i trattamenti (p < 0,05).
L'applicazione esogena di 250 mg/L di L-ornitina ha aumentato gradualmente l'altezza della pianta (Fig. 4A), il numero di rami per pianta (Fig. 4B) e il numero di foglie per pianta (Fig. 4C) dopo 42 giorni. Mentre il fungicida commerciale Rizolex-T (50 mg/L) ha avuto il maggiore effetto su tutti i parametri nutrizionali studiati, l'applicazione esogena di 250 mg/L di L-ornitina ha avuto il secondo maggiore effetto rispetto ai controlli non trattati (Figg. 4A–C). D'altro canto, il trattamento con L-ornitina non ha avuto effetti significativi sul contenuto di pigmenti fotosintetici clorofilla a (Fig. 4D) e clorofilla b (Fig. 4E), ma ha leggermente aumentato il contenuto totale di carotenoidi (0,56 ± 0,03 mg/g in peso) rispetto al controllo negativo (0,44 ± 0,02 mg/g in peso) e al controllo positivo (0,46 ± 0,02 mg/g in peso; Fig. 4F). Nel complesso, questi risultati indicano che la L-ornitina non è fitotossica per i legumi trattati e può persino stimolarne la crescita.
Fig. 4. Effetto dell'applicazione esogena di L-ornitina sulle caratteristiche di crescita e sui pigmenti fotosintetici delle foglie di fagiolo infette da Sclerotinia sclerotiorum in condizioni di serra. (A) Altezza della pianta (cm), (B) Numero di rami per pianta, (C) Numero di foglie per pianta, (D) Contenuto di clorofilla a (mg g-1 fr wt), (E) Contenuto di clorofilla b (mg g-1 fr wt), (F) Contenuto totale di carotenoidi (mg g-1 fr wt). I valori sono la media ± DS di cinque repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i trattamenti (p < 0,05).
La localizzazione istochimica in situ delle specie reattive dell'ossigeno (ROS; espresse come perossido di idrogeno [H2O2]) e dei radicali liberi (espressi come anioni superossido [O2•−]) ha rivelato che l'applicazione esogena di L-ornitina (250 mg/L) ha ridotto significativamente l'accumulo di H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) e O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) rispetto all'accumulo di piante infette non trattate (rispettivamente 173,31 ± 12,06 e 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) e piante trattate con 50 mg/L del fungicida commerciale Rizolex-T (170,12 ± 9,50 e 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, rispettivamente) a 72 ore. Livelli elevati di H2O2 e O2•− si sono accumulati sotto hpt (Fig. 5A, B). Analogamente, il test della malondialdeide (MDA) basato su TCA ha mostrato che le piante di fagiolo infette da S. sclerotiorum hanno accumulato livelli più elevati di MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) nelle loro foglie (Fig. 5C). Tuttavia, l'applicazione esogena di L-ornitina ha ridotto significativamente la perossidazione lipidica, come evidenziato dalla diminuzione del contenuto di MDA nelle piante trattate (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effetto dell'applicazione esogena di L-ornitina sui principali marcatori dello stress ossidativo e sui meccanismi di difesa antiossidanti non enzimatici nelle foglie di fagiolo infette da S. sclerotiorum 72 ore dopo l'infezione in condizioni di serra. (A) Perossido di idrogeno (H2O2; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (B) anione superossido (O2•−; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (C) malondialdeide (MDA; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (D) fenoli solubili totali (mg GAE g−1 FW) a 72 hpt, (E) flavonoidi solubili totali (mg RE g−1 FW) a 72 hpt, (F) amminoacidi liberi totali (mg g−1 FW) a 72 hpt e (G) contenuto di prolina (mg g−1 FW) a 72 hpt. I valori rappresentano la media ± deviazione standard (media ± DS) di 5 repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i trattamenti (p < 0,05).