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L'agente causale della malattia fungina della necrosi delle piante, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, utilizza una strategia a più livelli per infettare diverse piante ospiti. Questo studio propone l'uso della diammina L-ornitina, un amminoacido non proteico che stimola la sintesi di altri amminoacidi essenziali, come strategia di gestione alternativa per potenziare le risposte molecolari, fisiologiche e biochimiche di Phaseolus vulgaris L. alla muffa bianca causata da Pseudomonas sclerotiorum. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che la L-ornitina ha inibito significativamente la crescita miceliare di S. pyrenoidosa in modo dose-dipendente. Inoltre, è stata in grado di ridurre significativamente la gravità della muffa bianca in condizioni di serra. Infine, la L-ornitina ha stimolato la crescita delle piante trattate, indicando che le concentrazioni testate di L-ornitina non erano fitotossiche per le piante trattate. Inoltre, la L-ornitina ha potenziato l'espressione di antiossidanti non enzimatici (fenoli solubili totali e flavonoidi) e antiossidanti enzimatici (catalasi (CAT), perossidasi (POX) e polifenolo ossidasi (PPO)) e ha aumentato l'espressione di tre geni correlati agli antiossidanti (PvCAT1, PvSOD e PvGR). Inoltre, l'analisi in silico ha rivelato la presenza di una presunta proteina ossalacetato acetilidrolasi (SsOAH) nel genoma di S. sclerotiorum, che è risultata altamente simile alle proteine ​​ossalacetato acetilidrolasi (SsOAH) di Aspergillus fijiensis (AfOAH) e Penicillium sp. (PlOAH) in termini di analisi funzionale, domini conservati e topologia. È interessante notare che l'aggiunta di L-ornitina al terreno di coltura a base di brodo di patate destrosio (PDB) ha ridotto significativamente l'espressione del gene SsOAH nel micelio di S. sclerotiorum. Analogamente, l'applicazione esogena di L-ornitina ha ridotto significativamente l'espressione del gene SsOAH nel micelio fungino raccolto dalle piante trattate. Infine, l'applicazione di L-ornitina ha ridotto significativamente la secrezione di acido ossalico sia nel terreno PDB che nelle foglie infette. In conclusione, la L-ornitina svolge un ruolo chiave nel mantenimento dello stato redox e nel potenziamento della risposta di difesa delle piante infette. I risultati di questo studio potrebbero contribuire allo sviluppo di metodi innovativi ed ecocompatibili per il controllo della muffa bianca e per mitigarne l'impatto sulla produzione di fagioli e altre colture.
La muffa bianca, causata dal fungo necrotrofico Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, è una malattia devastante che riduce la resa e rappresenta una seria minaccia per la produzione globale di fagioli (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum è uno dei patogeni fungini delle piante trasmessi dal suolo più difficili da controllare, con un'ampia gamma di ospiti, oltre 600 specie vegetali, e la capacità di macerare rapidamente i tessuti dell'ospite in modo non specifico (Liang e Rollins, 2018). In condizioni sfavorevoli, attraversa una fase critica del suo ciclo vitale, rimanendo in uno stato di dormienza per lunghi periodi di tempo sotto forma di strutture nere, dure e simili a semi chiamate "sclerozi" nel terreno o come escrescenze bianche e soffici nel micelio o nel midollo del fusto delle piante infette (Schwartz et al., 2005). Lo S. sclerotiorum è in grado di formare sclerozi, che gli consentono di sopravvivere a lungo nei campi infetti e di persistere durante la malattia (Schwartz et al., 2005). Gli sclerozi sono ricchi di nutrienti, possono persistere nel terreno per lunghi periodi e fungono da inoculo primario per infezioni successive (Schwartz et al., 2005). In condizioni favorevoli, gli sclerozi germinano e producono spore aerodisperse che possono infettare tutte le parti aeree della pianta, inclusi, a titolo esemplificativo, fiori, steli o baccelli (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum utilizza una strategia a più livelli per infettare le sue piante ospiti, che prevede una serie di eventi coordinati dalla germinazione degli sclerozi allo sviluppo dei sintomi. Inizialmente, S. sclerotiorum produce spore sospese (chiamate ascospore) da strutture simili a funghi chiamate apoteci, che si disperdono nell'aria e si sviluppano in sclerozi immobili sui detriti vegetali infetti (Bolton et al., 2006). Il fungo secerne quindi acido ossalico, un fattore di virulenza, per controllare il pH della parete cellulare vegetale, promuovere la degradazione enzimatica e l'invasione dei tessuti (Hegedus e Rimmer, 2005) e sopprimere lo scoppio ossidativo della pianta ospite. Questo processo di acidificazione indebolisce la parete cellulare vegetale, fornendo un ambiente favorevole al normale ed efficiente funzionamento degli enzimi fungini che degradano la parete cellulare (CWDE), consentendo al patogeno di superare la barriera fisica e penetrare nei tessuti dell'ospite (Marciano et al., 1983). Una volta penetrato, S. sclerotiorum secerne una serie di enzimi CWDE, come la poligalatturnasi e la cellulasi, che ne facilitano la disseminazione nei tessuti infetti e causano necrosi tissutale. La progressione delle lesioni e dei tappeti ifali porta ai sintomi caratteristici della muffa bianca (Hegedus e Rimmer, 2005). Nel frattempo, le piante ospiti riconoscono i modelli molecolari associati ai patogeni (PAMP) attraverso i recettori di riconoscimento dei modelli (PRR), innescando una serie di eventi di segnalazione che attivano infine le risposte di difesa.
Nonostante decenni di sforzi per il controllo delle malattie, la carenza di germoplasma resistente adeguato persiste nel fagiolo, come in altre colture commerciali, a causa della resistenza, della sopravvivenza e dell'adattabilità dell'agente patogeno. La gestione della malattia è quindi estremamente complessa e richiede una strategia integrata e multiforme che includa una combinazione di pratiche colturali, lotta biologica e fungicidi chimici (O'Sullivan et al., 2021). Il controllo chimico della muffa bianca è il più efficace perché i fungicidi, se applicati correttamente e al momento giusto, possono controllare efficacemente la diffusione della malattia, ridurre la gravità dell'infezione e minimizzare le perdite di resa. Tuttavia, l'uso eccessivo e l'eccessiva dipendenza dai fungicidi possono portare all'emergere di ceppi resistenti di S. sclerotiorum e avere un impatto negativo sugli organismi non bersaglio, sulla salute del suolo e sulla qualità dell'acqua (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Pertanto, la ricerca di alternative ecocompatibili è diventata una priorità assoluta.
Le poliammine (PA), come putrescina, spermidina, spermina e cadaverina, possono rappresentare valide alternative contro i patogeni vegetali presenti nel suolo, riducendo in tutto o in parte l'uso di fungicidi chimici pericolosi (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Nelle piante superiori, le PA sono coinvolte in numerosi processi fisiologici, tra cui, a titolo esemplificativo, la divisione cellulare, la differenziazione e la risposta a stress abiotici e biotici (Killiny e Nehela, 2020). Possono agire come antiossidanti, contribuire a neutralizzare le specie reattive dell'ossigeno (ROS), mantenere l'omeostasi redox (Nehela e Killiny, 2023), indurre geni correlati alla difesa (Romero et al., 2018), regolare diverse vie metaboliche (Nehela e Killiny, 2023), modulare i fitormoni endogeni (Nehela e Killiny, 2019), stabilire la resistenza sistemica acquisita (SAR) e regolare le interazioni pianta-patogeno (Nehela e Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Vale la pena notare che i meccanismi e i ruoli specifici delle PA nella difesa delle piante variano a seconda della specie vegetale, dei patogeni e delle condizioni ambientali. La PA più abbondante nelle piante è biosintetizzata dalla poliammina essenziale L-ornitina (Killiny e Nehela, 2020).
L-ornitina svolge molteplici ruoli nella crescita e nello sviluppo delle piante. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che nel riso (Oryza sativa), l'ornitina può essere associata al riciclo dell'azoto (Liu et al., 2018), alla resa, alla qualità e all'aroma del riso (Lu et al., 2020) e alla risposta allo stress idrico (Yang et al., 2000). Inoltre, l'applicazione esogena di L-ornitina ha migliorato significativamente la tolleranza alla siccità nella barbabietola da zucchero (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) e ha alleviato lo stress salino nelle piante di cipolla (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu e Çavuşoǧlu, 2021) e di anacardio (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Il potenziale ruolo dell'L-ornitina nella difesa dallo stress abiotico potrebbe essere dovuto al suo coinvolgimento nell'accumulo di prolina nelle piante trattate. Ad esempio, è stato precedentemente riportato che geni correlati al metabolismo della prolina, come l'ornitina delta aminotransferasi (delta-OAT) e la prolina deidrogenasi (ProDH1 e ProDH2), sono coinvolti nella difesa di Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana contro ceppi non ospiti di Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar e Mysore, 2012). D'altra parte, l'ornitina decarbossilasi (ODC) fungina è necessaria per la crescita del patogeno (Singh et al., 2020). Il targeting dell'ODC di Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici tramite silenziamento genico indotto dall'ospite (HIGS) ha migliorato significativamente la resistenza delle piante di pomodoro all'avvizzimento da Fusarium (Singh et al., 2020). Tuttavia, il potenziale ruolo dell'applicazione esogena di ornitina contro stress biotici come i fitopatogeni non è stato ancora ben studiato. Ancora più importante, gli effetti dell'ornitina sulla resistenza alle malattie e i fenomeni biochimici e fisiologici ad essa associati rimangono in gran parte inesplorati.
Comprendere la complessità dell'infezione da S. sclerotiorum nelle leguminose è fondamentale per lo sviluppo di strategie di controllo efficaci. In questo studio, ci siamo proposti di identificare il potenziale ruolo della diammina L-ornitina come fattore chiave nel potenziamento dei meccanismi di difesa e della resistenza delle piante leguminose all'infezione da Sclerotinia sclerotiorum. Ipotizziamo che, oltre a potenziare le risposte difensive delle piante infette, la L-ornitina svolga anche un ruolo chiave nel mantenimento dello stato redox. Proponiamo che i potenziali effetti della L-ornitina siano correlati alla regolazione dei meccanismi di difesa antiossidante enzimatici e non enzimatici e all'interferenza con i fattori di patogenicità/virulenza fungina e le proteine ​​associate. Questa duplice funzionalità della L-ornitina la rende un candidato promettente per una strategia sostenibile volta a mitigare l'impatto della muffa bianca e a migliorare la resistenza delle colture leguminose comuni a questo potente patogeno fungino. I risultati del presente studio potrebbero contribuire allo sviluppo di metodi innovativi ed ecocompatibili per il controllo della muffa bianca e per mitigarne l'impatto sulla produzione di leguminose.
In questo studio, è stata utilizzata come materiale sperimentale una varietà commerciale suscettibile di fagiolo comune, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). I semi sani sono stati gentilmente forniti dal Dipartimento di Ricerca sulle Leguminose, Istituto di Ricerca sulle Colture da Campo (FCRI), Centro di Ricerca Agricola (ARC), Egitto. Cinque semi sono stati seminati in vasi di plastica (diametro interno 35 cm, profondità 50 cm) riempiti con terreno infetto da S. sclerotiorum in condizioni di serra (25 ± 2 °C, umidità relativa 75 ± 1%, 8 ore di luce/16 ore di buio). A 7-10 giorni dalla semina (DPS), le piantine sono state diradate lasciando solo due piantine con crescita uniforme e tre foglie completamente espanse in ogni vaso. Tutte le piante in vaso sono state irrigate una volta ogni due settimane e concimate mensilmente secondo le dosi raccomandate per la varietà in questione.
Per preparare una soluzione di L-ornitinidiammina (nota anche come acido (+)-(S)-2,5-diaminopentanoico; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) alla concentrazione di 500 mg/L, sono stati inizialmente disciolti 50 mg in 100 mL di acqua distillata sterile. La soluzione madre è stata quindi diluita e utilizzata negli esperimenti successivi. In breve, sono state testate in vitro sei serie di concentrazioni di L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L). Inoltre, è stata utilizzata acqua distillata sterile come controllo negativo (Mock) e il fungicida commerciale "Rizolex-T" in polvere bagnabile al 50% (toclofos-metile 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Governatorato di Gharbia, Egitto) come controllo positivo. Il fungicida commerciale “Rizolex-T” è stato testato in vitro a cinque concentrazioni (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L).
Campioni di steli e baccelli di fagiolo comune che mostravano sintomi tipici di muffa bianca (tasso di infestazione: 10-30%) sono stati raccolti da aziende agricole commerciali. Sebbene la maggior parte del materiale vegetale infetto fosse identificata per specie/varietà (varietà commerciale suscettibile Giza 3), altri, soprattutto quelli ottenuti dai mercati locali, erano di specie sconosciuta. Il materiale infetto raccolto è stato prima disinfettato superficialmente con una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5% per 3 minuti, quindi risciacquato più volte con acqua distillata sterile e asciugato con carta da filtro sterile per rimuovere l'acqua in eccesso. Gli organi infetti sono stati quindi tagliati in piccoli pezzi dal tessuto intermedio (tra tessuto sano e infetto), coltivati ​​su terreno agarizzato patata destrosio (PDA) e incubati a 25 ± 2 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore per 5 giorni per stimolare la formazione di sclerozi. Il metodo dell'apice miceliare è stato utilizzato anche per purificare gli isolati fungini da colture miste o contaminate. L'isolato fungino purificato è stato inizialmente identificato in base alle sue caratteristiche morfologiche colturali e successivamente confermato come S. sclerotiorum sulla base delle caratteristiche microscopiche. Infine, tutti gli isolati purificati sono stati testati per la patogenicità sulla cultivar di fagiolo comune suscettibile Giza 3 per soddisfare i postulati di Koch.
Inoltre, l'isolato di S. sclerotiorum più invasivo (isolato n. 3) è stato ulteriormente confermato sulla base del sequenziamento dello spaziatore trascritto interno (ITS) come descritto da White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. In breve, gli isolati sono stati coltivati ​​in brodo di patate destrosio (PDB) e incubati a 25 ± 2 °C per 5-7 giorni. Il micelio fungino è stato quindi raccolto, filtrato attraverso una garza, lavato due volte con acqua sterile e asciugato con carta da filtro sterile. Il DNA genomico è stato isolato utilizzando il kit Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). La regione ITS rDNA è stata quindi amplificata utilizzando la coppia di primer specifici ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; dimensione prevista: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). I prodotti PCR purificati sono stati inviati per il sequenziamento (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Le sequenze ITS rDNA sono state sequenziate bidirezionalmente utilizzando il metodo di sequenziamento Sanger. Le sequenze di query assemblate sono state quindi confrontate con i dati più recenti presenti in GenBank e nel National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) utilizzando il software BLASTn. La sequenza di query è stata confrontata con altri 20 ceppi/isolati di S. sclerotiorum recuperati dai dati più recenti in NCBI GenBank (Tabella supplementare S1) utilizzando ClustalW nel pacchetto di analisi genetica evolutiva molecolare (MEGA-11; versione 11) (Kumar et al., 2024). L'analisi evolutiva è stata eseguita utilizzando il metodo della massima verosimiglianza e il modello generale di sostituzione nucleotidica reversibile nel tempo (Nei e Kumar, 2000). Viene mostrato l'albero con la log-verosimiglianza più alta. L'albero iniziale per la ricerca euristica viene selezionato scegliendo l'albero con la log-verosimiglianza più alta tra l'albero neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) e l'albero di massima parsimonia (MP). L'albero NJ è stato costruito utilizzando una matrice di distanze a coppie calcolata utilizzando il modello generale reversibile nel tempo (Nei e Kumar, 2000).
L'attività antibatterica della L-ornitina e del battericida “Rizolex-T” è stata determinata in vitro mediante il metodo di diffusione su agar. Metodo: prelevare la quantità appropriata di soluzione madre di L-ornitina (500 mg/L) e mescolarla accuratamente con 10 ml di terreno nutritivo PDA per preparare soluzioni con concentrazioni finali rispettivamente di 12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L. Cinque concentrazioni del fungicida “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L) e acqua distillata sterile sono state utilizzate come controllo. Dopo la solidificazione del terreno, un dischetto di micelio di coltura di Sclerotinia sclerotiorum, di 4 mm di diametro, è stato trasferito al centro della piastra di Petri e incubato a 25±2°C fino a quando il micelio non ha ricoperto l'intera piastra di Petri di controllo, dopodiché è stata registrata la crescita fungina. Calcola la percentuale di inibizione della crescita radiale di S. sclerotiorum utilizzando l'equazione 1:
L'esperimento è stato ripetuto due volte, con sei repliche biologiche per ciascun gruppo di controllo/sperimentale e cinque vasi (due piante per vaso) per ogni replica biologica. Ogni replica biologica è stata analizzata due volte (due repliche tecniche) per garantire l'accuratezza, l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati sperimentali. Inoltre, è stata utilizzata l'analisi di regressione probit per calcolare la concentrazione inibitoria semimassimale (IC50) e IC99 (Prentice, 1976).
Per valutare il potenziale della L-ornitina in condizioni di serra, sono stati condotti due esperimenti consecutivi in ​​vaso. In breve, i vasi sono stati riempiti con terreno argilloso-sabbia sterilizzato (3:1) e inoculati con una coltura di S. sclerotiorum preparata di fresco. In primo luogo, l'isolato più invasivo di S. sclerotiorum (isolato n. 3) è stato coltivato tagliando uno sclerozio a metà, posizionandolo a faccia in giù su un PDA e incubandolo a 25 °C in oscurità costante (24 ore) per 4 giorni per stimolare la crescita miceliare. Quattro dischetti di agar di 5 mm di diametro sono stati quindi prelevati dal bordo anteriore e inoculati con 100 g di una miscela sterile di crusca di grano e riso (1:1, v/v) e tutte le fiasche sono state incubate a 25 ± 2 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore per 5 giorni per stimolare la formazione di sclerozi. Il contenuto di tutte le fiasche è stato accuratamente miscelato per garantire l'omogeneità prima di aggiungere il terreno. Successivamente, sono stati aggiunti 100 g della miscela di crusca colonizzante a ciascun vaso per garantire una concentrazione costante di agenti patogeni. I vasi inoculati sono stati irrigati per attivare la crescita fungina e posti in serra per 7 giorni.
Cinque semi della varietà Giza 3 sono stati seminati in ciascun vaso. Per i vasi trattati con L-ornitina e il fungicida Rizolex-T, i semi sterilizzati sono stati prima immersi per due ore in una soluzione acquosa dei due composti con una concentrazione finale di IC99 di circa 250 mg/L e 50 mg/L, rispettivamente, e poi lasciati asciugare all'aria per un'ora prima della semina. D'altra parte, i semi sono stati immersi in acqua distillata sterile come controllo negativo. Dopo 10 giorni, prima della prima irrigazione, le piantine sono state diradate, lasciando solo due piantine ordinate in ciascun vaso. Inoltre, per garantire l'infezione con S. sclerotiorum, gli steli delle piante di fagiolo allo stesso stadio di sviluppo (10 giorni) sono stati tagliati in due punti diversi utilizzando un bisturi sterilizzato e circa 0,5 g della miscela di crusca colonizzante sono stati posti in ciascuna ferita, seguiti da un'elevata umidità per stimolare l'infezione e lo sviluppo della malattia in tutte le piante inoculate. Le piante di controllo sono state ferite in modo simile e una quantità uguale (0,5 g) di miscela di crusca sterile e non colonizzata è stata posta nella ferita e mantenuta in condizioni di elevata umidità per simulare l'ambiente di sviluppo della malattia e garantire la coerenza tra i gruppi di trattamento.
Metodo di trattamento: Le piantine di fagiolo sono state irrigate con 500 ml di una soluzione acquosa di L-ornitina (250 mg/l) o del fungicida Rizolex-T (50 mg/l) mediante irrigazione del terreno, quindi il trattamento è stato ripetuto tre volte a intervalli di 10 giorni. I controlli trattati con placebo sono stati irrigati con 500 ml di acqua distillata sterile. Tutti i trattamenti sono stati effettuati in condizioni di serra (25 ± 2 °C, 75 ± 1% di umidità relativa e un fotoperiodo di 8 ore di luce/16 ore di buio). Tutti i vasi sono stati irrigati ogni due settimane e trattati mensilmente con un fertilizzante NPK bilanciato (20-20-20, con 3,6% di zolfo e microelementi TE; Zain Seeds, Egitto) a una concentrazione di 3-4 g/l mediante irrorazione fogliare secondo le raccomandazioni per la specifica varietà e le istruzioni del produttore. Salvo diversa indicazione, foglie mature completamente espanse (seconda e terza foglia dall'alto) sono state raccolte da ciascuna replica biologica 72 ore dopo il trattamento (hpt), omogeneizzate, raggruppate e conservate a -80 °C per ulteriori analisi, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la localizzazione istochimica in situ degli indicatori di stress ossidativo, la perossidazione lipidica, gli antiossidanti enzimatici e non enzimatici e l'espressione genica.
L'intensità dell'infezione da muffa bianca è stata valutata settimanalmente 21 giorni dopo l'inoculazione (dpi) utilizzando una scala da 1 a 9 (Tabella supplementare S2) basata sulla scala di Petzoldt e Dickson (1996) modificata da Teran et al. (2006). In breve, i fusti e i rami delle piante di fagiolo sono stati esaminati a partire dal punto di inoculazione per seguire la progressione delle lesioni lungo gli internodi e i nodi. La distanza della lesione dal punto di inoculazione al punto più lontano lungo il fusto o il ramo è stata quindi misurata e un punteggio da 1 a 9 è stato assegnato in base alla posizione della lesione, dove (1) indicava nessuna infezione visibile vicino al punto di inoculazione e (2-9) indicava un graduale aumento delle dimensioni della lesione e la progressione lungo nodi/internodi (Tabella supplementare S2). L'intensità dell'infezione da muffa bianca è stata quindi convertita in percentuale utilizzando la formula 2:
Inoltre, l'area sotto la curva di progressione della malattia (AUDPC) è stata calcolata utilizzando la formula (Shaner e Finney, 1977), che è stata recentemente adattata per la marciume bianca del fagiolo comune (Chauhan et al., 2020) utilizzando l'equazione 3:
Dove Yi = gravità della malattia al tempo ti, Yi+1 = gravità della malattia al tempo successivo ti+1, ti = tempo della prima misurazione (in giorni), ti+1 = tempo della misurazione successiva (in giorni), n = numero totale di punti temporali o punti di osservazione. I parametri di crescita delle piante di fagiolo, tra cui altezza della pianta (cm), numero di rami per pianta e numero di foglie per pianta, sono stati registrati settimanalmente per 21 giorni in tutte le repliche biologiche.
In ciascuna replica biologica, campioni di foglie (seconda e terza foglia completamente sviluppata dall'alto) sono stati raccolti il ​​45° giorno dopo il trattamento (15 giorni dopo l'ultimo trattamento). Ogni replica biologica era composta da cinque vasi (due piante per vaso). Circa 500 mg di tessuto tritato sono stati utilizzati per l'estrazione dei pigmenti fotosintetici (clorofilla a, clorofilla b e carotenoidi) utilizzando acetone all'80% a 4 °C al buio. Dopo 24 ore, i campioni sono stati centrifugati e il surnatante è stato raccolto per la determinazione colorimetrica del contenuto di clorofilla a, clorofilla b e carotenoidi utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone) secondo il metodo di (Lichtenthaler, 1987) misurando l'assorbanza a tre diverse lunghezze d'onda (A470, A646 e A663 nm). Infine, il contenuto di pigmenti fotosintetici è stato calcolato utilizzando le seguenti formule 4–6 descritte da Lichtenthaler (1987).
A 72 ore dal trattamento (hpt), sono state raccolte foglie (seconda e terza foglia completamente sviluppata dall'alto) da ciascuna replica biologica per la localizzazione istochimica in situ del perossido di idrogeno (H2O2) e dell'anione superossido (O2•−). Ciascuna replica biologica era composta da cinque vasi (due piante per vaso). Ciascuna replica biologica è stata analizzata in duplicato (due repliche tecniche) per garantire l'accuratezza, l'affidabilità e la riproducibilità del metodo. H2O2 e O2•− sono stati determinati utilizzando rispettivamente 3,3′-diaminobenzidina allo 0,1% (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) o nitroblu tetrazolio (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), seguendo i metodi descritti da Romero-Puertas et al. (2004) e Adam et al. (1989) con lievi modifiche. Per la localizzazione istochimica di H2O2 in situ, i lembi valvolari sono stati infiltrati sottovuoto con DAB allo 0,1% in tampone Tris 10 mM (pH 7,8) e quindi incubati a temperatura ambiente alla luce per 60 minuti. I lembi valvolari sono stati decolorati in TCA allo 0,15% (v/v) in etanolo:cloroformio 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egitto) e quindi esposti alla luce fino a quando non si sono scuriti. Analogamente, le valvole sono state infiltrate sottovuoto con tampone fosfato di potassio 10 mM (pH 7,8) contenente HBT allo 0,1% p/v per la localizzazione istochimica di O2•− in situ. I lembi valvolari sono stati incubati alla luce a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi decolorati come sopra e poi illuminati fino alla comparsa di macchie blu scuro/violette. L'intensità del colore marrone (come indicatore di H2O2) o blu-violetto (come indicatore di O2•−) risultante è stata valutata utilizzando la versione Fiji del pacchetto di elaborazione immagini ImageJ (http://fiji.sc; accesso 7 marzo 2024).
La malondialdeide (MDA; come marcatore della perossidazione lipidica) è stata determinata secondo il metodo di Du e Bramlage (1992) con lievi modifiche. Le foglie di ciascuna replica biologica (seconda e terza foglia completamente sviluppata dall'alto) sono state raccolte 72 ore dopo il trattamento (hpt). Ogni replica biologica comprendeva cinque vasi (due piante per vaso). Ciascuna replica biologica è stata analizzata in duplicato (due repliche tecniche) per garantire l'accuratezza, l'affidabilità e la riproducibilità del metodo. In breve, 0,5 g di tessuto fogliare macinato sono stati utilizzati per l'estrazione della MDA con acido tricloroacetico al 20% (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) contenente butilidrossitoluene allo 0,01% (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Il contenuto di MDA nel surnatante è stato quindi determinato colorimetricamente misurando l'assorbanza a 532 e 600 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone) ed espresso in nmol g−1 FW.
Per la valutazione degli antiossidanti enzimatici e non enzimatici, sono state raccolte foglie (seconda e terza foglia completamente sviluppata dall'alto) da ciascuna replica biologica 72 ore dopo il trattamento (hpt). Ogni replica biologica era composta da cinque vasi (due piante per vaso). Ogni campione biologico è stato analizzato in duplicato (due campioni tecnici). Due foglie sono state macinate con azoto liquido e utilizzate direttamente per la determinazione degli antiossidanti enzimatici e non enzimatici, degli amminoacidi totali, del contenuto di prolina, dell'espressione genica e della quantificazione dell'ossalato.
Il contenuto totale di fenoli solubili è stato determinato utilizzando il reagente di Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) con lievi modifiche al metodo descritto da Kahkonen et al. (1999). In breve, circa 0,1 g di tessuto fogliare omogeneizzato sono stati estratti con 20 ml di metanolo all'80% al buio per 24 ore e il surnatante è stato raccolto dopo centrifugazione. 0,1 ml dell'estratto del campione sono stati miscelati con 0,5 ml di reagente di Folin-Ciocalteu (10%), agitati per 30 secondi e lasciati al buio per 5 minuti. Quindi sono stati aggiunti 0,5 ml di soluzione di carbonato di sodio al 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egitto) a ciascuna provetta, mescolati accuratamente e incubati a temperatura ambiente al buio per 1 ora. Dopo l'incubazione, l'assorbanza della miscela di reazione è stata misurata a 765 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone). La concentrazione di fenoli solubili totali negli estratti del campione è stata determinata utilizzando una curva di calibrazione dell'acido gallico (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ed espressa in milligrammi di acido gallico equivalente per grammo di peso fresco (mg GAE g-1 peso fresco).
Il contenuto totale di flavonoidi solubili è stato determinato secondo il metodo di Djeridane et al. (2006) con lievi modifiche. In breve, 0,3 ml dell'estratto metanolico sopra descritto sono stati miscelati con 0,3 ml di soluzione di cloruro di alluminio al 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), agitati energicamente e quindi incubati a temperatura ambiente per 5 minuti, seguiti dall'aggiunta di 0,3 ml di soluzione di acetato di potassio al 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egitto), mescolati accuratamente e incubati a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Dopo l'incubazione, l'assorbanza della miscela di reazione è stata misurata a 430 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone). La concentrazione di flavonoidi solubili totali negli estratti del campione è stata determinata utilizzando una curva di calibrazione della rutina (TCI America, Portland, OR, USA) ed espressa in milligrammi di rutina equivalente per grammo di peso fresco (mg RE g-1 peso fresco).
Il contenuto totale di aminoacidi liberi nelle foglie di fagiolo è stato determinato utilizzando un reagente alla ninidrina modificato (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) basato sul metodo proposto da Yokoyama e Hiramatsu (2003) e modificato da Sun et al. (2006). In breve, 0,1 g di tessuto macinato sono stati estratti con tampone a pH 5,4 e 200 μL del surnatante sono stati fatti reagire con 200 μL di ninidrina (2%) e 200 μL di piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), incubati in un bagno d'acqua bollente per 30 minuti, quindi raffreddati e misurati a 580 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone). D'altra parte, la prolina è stata determinata con il metodo di Bates (Bates et al., 1973). La prolina è stata estratta con acido solfosalicilico al 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) e, dopo centrifugazione, 0,5 ml del surnatante sono stati miscelati con 1 ml di acido acetico glaciale (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) e reagente alla ninidrina, incubati a 90 °C per 45 min, raffreddati e misurati a 520 nm utilizzando lo stesso spettrofotometro di cui sopra. Gli amminoacidi liberi totali e la prolina negli estratti fogliari sono stati determinati utilizzando rispettivamente le curve di calibrazione della glicina e della prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ed espressi in mg/g di peso fresco.
Per determinare l'attività enzimatica degli enzimi antiossidanti, circa 500 mg di tessuto omogeneizzato sono stati estratti con 3 ml di tampone Tris 50 mM (pH 7,8) contenente 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e 7,5% di polivinilpirrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugati a 10.000 × g per 20 min sotto refrigerazione (4 °C) e il surnatante (estratto enzimatico grezzo) è stato raccolto (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). La catalasi (CAT) è stata quindi fatta reagire con 2 ml di tampone fosfato di sodio 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e 100 μl di soluzione di H2O2 269 mM per determinarne l'attività enzimatica secondo il metodo di Aebi (1984) con lievi modifiche (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). L'attività enzimatica della perossidasi dipendente dal guaiacolo (POX) è stata determinata utilizzando il metodo di Harrach et al. (2009). (2008) con piccole modifiche (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) e l'attività enzimatica della polifenolo ossidasi (PPO) è stata determinata dopo reazione con 2,2 ml di tampone fosfato di sodio 100 mM (pH 6,0), 100 μl di guaiacolo (TCI chemicals, Portland, OR, USA) e 100 μl di H2O2 12 mM. Il metodo è stato leggermente modificato da (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Il test è stato eseguito dopo reazione con 3 ml di soluzione di catecolo (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) preparata di fresco in tampone fosfato 0,1 M (pH 6,0). L'attività della CAT è stata misurata monitorando la decomposizione dell'H2O2 a 240 nm (A240), l'attività della POX è stata misurata monitorando l'aumento dell'assorbanza a 436 nm (A436) e l'attività della PPO è stata misurata registrando le fluttuazioni dell'assorbanza a 495 nm (A495) ogni 30 s per 3 min utilizzando uno spettrofotometro UV-160A (Shimadzu, Giappone).
La RT-PCR in tempo reale è stata utilizzata per rilevare i livelli di trascrizione di tre geni correlati agli antiossidanti, tra cui la catalasi perossisomiale (PvCAT1; numero di accesso GenBank KF033307.1), la superossido dismutasi (PvSOD; numero di accesso GenBank XM_068639556.1) e la glutatione reduttasi (PvGR; numero di accesso GenBank KY195009.1), nelle foglie di fagiolo (la seconda e la terza foglia completamente sviluppata dall'alto) 72 ore dopo l'ultimo trattamento. In breve, l'RNA è stato isolato utilizzando il kit Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. n. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Cina) secondo il protocollo del produttore. Successivamente, il cDNA è stato sintetizzato utilizzando il kit TOP script™ cDNA Synthesis Kit secondo le istruzioni del produttore. Le sequenze dei primer dei tre geni sopra menzionati sono elencate nella Tabella supplementare S3. PvActin-3 (numero di accesso GenBank: XM_068616709.1) è stato utilizzato come gene di riferimento e l'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001). È stata dimostrata la stabilità dell'actina in condizioni di stress biotico (interazione incompatibile tra leguminose comuni e il fungo dell'antracnosi Colletotrichum lindemuthianum) e abiotico (siccità, salinità, bassa temperatura) (Borges et al., 2012).
Abbiamo inizialmente eseguito un'analisi in silico a livello genomico delle proteine ​​ossalacetato acetilidrolasi (OAH) in S. sclerotiorum utilizzando lo strumento BLAST proteina-proteina (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). In breve, abbiamo utilizzato OAH di Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; tasso: 1191702; numero di accesso GenBank XP_040799428.1; 342 amminoacidi) e Penicillium lagena (PlOAH; tasso: 94218; numero di accesso GenBank XP_056833920.1; 316 amminoacidi) come sequenze di query per mappare la proteina omologa in S. sclerotiorum (taxide: 5180). È stata eseguita un'analisi BLASTp sui dati genomici più recenti di S. sclerotiorum disponibili in GenBank sul sito web del National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Inoltre, il gene OAH previsto da S. sclerotiorum (SsOAH) e l'analisi evolutiva e l'albero filogenetico di AfOAH da A. fijiensis CBS 313.89 e PlOAH da P. lagena sono stati inferiti utilizzando il metodo di massima verosimiglianza in MEGA11 (Tamura et al., 2021) e il modello basato sulla matrice JTT (Jones et al., 1992). L'albero filogenetico è stato combinato con l'analisi di allineamento multiplo delle sequenze proteiche di tutti i geni OAH previsti (SsOAH) da S. sclerotiorum e la sequenza di query utilizzando il Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos e Agarwala, 2007). Inoltre, le sequenze di amminoacidi di SsOAH di S. sclerotiorum che meglio corrispondevano sono state allineate con le sequenze di riferimento (AfOAH e PlOAH) (Larkin et al., 2007) utilizzando ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) e le regioni conservate nell'allineamento sono state visualizzate utilizzando lo strumento ESPript (versione 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Inoltre, i domini funzionali rappresentativi e i siti conservati previsti di SsOAH di S. sclerotiorum sono stati classificati interattivamente in diverse famiglie utilizzando lo strumento InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Infine, la modellazione della struttura tridimensionale (3D) della SsOAH di S. sclerotiorum prevista è stata eseguita utilizzando il Protein Homology/Analogy Recognition Engine (server Phyre2 versione 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) e convalidata utilizzando il server SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Le strutture tridimensionali previste (formato PDB) sono state visualizzate in modo interattivo utilizzando il pacchetto UCSF-Chimera (versione 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
La PCR quantitativa in tempo reale a fluorescenza è stata utilizzata per determinare il livello di trascrizione dell'ossalacetato acetilidrolasi (SsOAH; numero di accesso GenBank: XM_001590428.1) nel micelio di Sclerotinia sclerotiorum. In breve, S. sclerotiorum è stato inoculato in una fiasca contenente PDB e posto in un incubatore a scuotimento (modello: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) a 25 ± 2 °C per 24 ore a 150 rpm e in costante oscurità (24 ore) per stimolare la crescita miceliare. Successivamente, le cellule sono state trattate con L-ornitina e il fungicida Rizolex-T alle concentrazioni finali di IC50 (circa 40 e 3,2 mg/L, rispettivamente) e quindi coltivate per altre 24 ore nelle stesse condizioni. Dopo l'incubazione, le colture sono state centrifugate a 2500 rpm per 5 min e il surnatante (micelio fungino) è stato raccolto per l'analisi dell'espressione genica. Analogamente, il micelio fungino è stato raccolto a 0, 24, 48, 72, 96 e 120 ore post-infezione da piante infette che avevano formato muffa bianca e micelio cotonoso sulla superficie dei tessuti infetti. L'RNA è stato estratto dal micelio fungino e quindi il cDNA è stato sintetizzato come descritto sopra. Le sequenze dei primer per SsOAH sono elencate nella Tabella supplementare S3. SsActin (numero di accesso GenBank: XM_001589919.1) è stato utilizzato come gene di riferimento e l'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001).
L'acido ossalico è stato determinato in brodo di patate destrosio (PDB) e in campioni vegetali contenenti il ​​patogeno fungino Sclerotinia sclerotiorum secondo il metodo di Xu e Zhang (2000) con lievi modifiche. In breve, gli isolati di S. sclerotiorum sono stati inoculati in fiasche contenenti PDB e quindi coltivati ​​in un incubatore a scuotimento (modello I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) a 150 rpm a 25 ± 2 °C per 3-5 giorni in oscurità costante (24 ore) per stimolare la crescita miceliare. Dopo l'incubazione, la coltura fungina è stata prima filtrata attraverso carta da filtro Whatman n. 1 e poi centrifugata a 2500 rpm per 5 minuti per rimuovere il micelio residuo. Il surnatante è stato raccolto e conservato a 4 °C per la successiva determinazione quantitativa dell'ossalato. Per la preparazione dei campioni vegetali, circa 0,1 g di frammenti di tessuto vegetale sono stati estratti tre volte con acqua distillata (2 ml ogni volta). I campioni sono stati quindi centrifugati a 2500 giri/min per 5 minuti, il surnatante è stato filtrato a secco attraverso carta da filtro Whatman n. 1 e raccolto per ulteriori analisi.
Per l'analisi quantitativa dell'acido ossalico, la miscela di reazione è stata preparata in una provetta con tappo di vetro nel seguente ordine: 0,2 ml di campione (o filtrato di coltura PDB o soluzione standard di acido ossalico), 0,11 ml di blu di bromofenolo (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml di acido solforico 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egitto) e 0,176 ml di dicromato di potassio 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA). La soluzione è stata quindi diluita a 4,8 ml con acqua distillata, miscelata energicamente e immediatamente posta in un bagno termostatico a 60 °C. Dopo 10 minuti, la reazione è stata interrotta aggiungendo 0,5 ml di soluzione di idrossido di sodio (NaOH; 0,75 M). L'assorbanza (A600) della miscela di reazione è stata misurata a 600 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-160 (Shimadzu Corporation, Giappone). Il PDB e l'acqua distillata sono stati utilizzati rispettivamente come controlli per la quantificazione dei filtrati di coltura e dei campioni vegetali. Le concentrazioni di acido ossalico nei filtrati di coltura, espresse in microgrammi di acido ossalico per millilitro di terreno PDB (μg.mL−1), e negli estratti fogliari, espresse in microgrammi di acido ossalico per grammo di peso fresco (μg.g−1 FW), sono state determinate utilizzando una curva di calibrazione dell'acido ossalico (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Nel corso dello studio, tutti gli esperimenti sono stati progettati secondo un disegno completamente randomizzato (CRD) con sei repliche biologiche per trattamento e cinque vasi per replica biologica (due piante per vaso), salvo diversa indicazione. Le repliche biologiche sono state analizzate in duplicato (due repliche tecniche). Le repliche tecniche sono state utilizzate per verificare la riproducibilità dello stesso esperimento, ma non sono state utilizzate nell'analisi statistica per evitare repliche spurie. I dati sono stati analizzati statisticamente mediante analisi della varianza (ANOVA) seguita dal test di differenza significativa onesta (HSD) di Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Per gli esperimenti in vitro, i valori di IC50 e IC99 sono stati calcolati utilizzando il modello probit e sono stati calcolati gli intervalli di confidenza al 95%.
Sono stati raccolti in totale quattro isolati da diversi campi di soia nel Governatorato di El Ghabiya, in Egitto. Su terreno PDA, tutti gli isolati hanno prodotto un micelio bianco crema che è diventato rapidamente bianco cotonoso (Figura 1A) e poi beige o marrone allo stadio di sclerozio. Gli sclerozi sono solitamente densi, neri, di forma sferica o irregolare, lunghi da 5,2 a 7,7 mm e con un diametro da 3,4 a 5,3 mm (Figura 1B). Sebbene quattro isolati abbiano sviluppato un pattern marginale di sclerozi al bordo del terreno di coltura dopo 10-12 giorni di incubazione a 25 ± 2 °C (Fig. 1A), il numero di sclerozi per piastra era significativamente diverso tra loro (P < 0,001), con l'isolato 3 che presentava il numero più elevato di sclerozi (32,33 ± 1,53 sclerozi per piastra; Fig. 1C). Analogamente, l'isolato n. 3 ha prodotto più acido ossalico in PDB rispetto agli altri isolati (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). L'isolato n. 3 ha mostrato le tipiche caratteristiche morfologiche e microscopiche del fungo fitopatogeno Sclerotinia sclerotiorum. Ad esempio, su PDA, le colonie dell'isolato n. 3 crescevano rapidamente, erano di colore bianco crema (Figura 1A), beige inverso o giallo-marrone salmone chiaro, e richiedevano 6-7 giorni a 25 ± 2 °C per ricoprire completamente la superficie di una piastra di 9 cm di diametro. Sulla base delle suddette caratteristiche morfologiche e microscopiche, l'isolato n. 3 è stato identificato come Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Caratteristiche e patogenicità degli isolati di S. sclerotiorum provenienti da comuni colture di leguminose. (A) Crescita miceliare di quattro isolati di S. sclerotiorum su terreno PDA, (B) sclerozi di quattro isolati di S. sclerotiorum, (C) numero di sclerozi (per piastra), (D) secrezione di acido ossalico su terreno PDB (μg.mL−1) e (E) gravità della malattia (%) di quattro isolati di S. sclerotiorum sulla cultivar commerciale di leguminosa suscettibile Giza 3 in condizioni di serra. I valori rappresentano la media ± DS di cinque repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i trattamenti (p < 0,05). (F–H) Sintomi tipici di muffa bianca sono comparsi rispettivamente su fusti aerei e silique, 10 giorni dopo l'inoculazione con l'isolato n. 3 (dpi). (I) L'analisi evolutiva della regione dello spaziatore trascritto interno (ITS) dell'isolato n. 3 di S. sclerotiorum è stata eseguita utilizzando il metodo della massima verosimiglianza e confrontata con 20 isolati/ceppi di riferimento ottenuti dal database del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). I numeri sopra le linee di clustering indicano la copertura della regione (%) e i numeri sotto le linee di clustering indicano la lunghezza del ramo.
Inoltre, per confermare la patogenicità, quattro isolati di S. sclerotiorum ottenuti sono stati utilizzati per inoculare la cultivar commerciale di fagiolo suscettibile Giza 3 in condizioni di serra, in accordo con i postulati di Koch (Fig. 1E). Sebbene tutti gli isolati fungini ottenuti fossero patogeni e in grado di infettare il fagiolo verde (cv. Giza 3), causando i tipici sintomi di muffa bianca su tutte le parti aeree (Fig. 1F), in particolare su steli (Fig. 1G) e baccelli (Fig. 1H) a 10 giorni dall'inoculazione (dpi), l'isolato 3 è risultato il più aggressivo in due esperimenti indipendenti. L'isolato 3 ha mostrato la maggiore gravità della malattia (%) sulle piante di fagiolo (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 e 76,7 ± 3,1 rispettivamente a 7, 14 e 21 giorni dall'infezione; Figura 1F).
L'identificazione dell'isolato di S. sclerotiorum più invasivo, il numero 3, è stata ulteriormente confermata sulla base del sequenziamento dello spaziatore trascritto interno (ITS) (Fig. 1I). L'analisi filogenetica tra l'isolato n. 3 e 20 isolati/ceppi di riferimento ha mostrato un'elevata similarità (>99%) tra di essi. È interessante notare che l'isolato di S. sclerotiorum n. 3 (533 bp) presenta un'elevata similarità con l'isolato americano di S. sclerotiorum LPM36 isolato da semi di pisello secchi (numero di accesso GenBank MK896659.1; 540 bp) e con l'isolato cinese di S. sclerotiorum YKY211 (numero di accesso GenBank OR206374.1; 548 bp), che causa il marciume del fusto della violetta (Matthiola incana), tutti raggruppati separatamente nella parte superiore del dendrogramma (Figura 1I). La nuova sequenza è stata depositata nel database NCBI e denominata "Sclerotinia sclerotiorum – isolato YN-25" (numero di accesso GenBank PV202792). Si può notare che l'isolato 3 è il più invasivo; pertanto, questo isolato è stato scelto per lo studio in tutti gli esperimenti successivi.
L'attività antibatterica della diammina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) a diverse concentrazioni (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) contro l'isolato 3 di S. sclerotiorum è stata studiata in vitro. È interessante notare che la L-ornitina ha esercitato un effetto antibatterico e ha gradualmente inibito la crescita radiale delle ife di S. sclerotiorum in modo dose-dipendente (Figura 2A, B). Alla concentrazione più elevata testata (125 mg/L), la L-ornitina ha dimostrato il più alto tasso di inibizione della crescita miceliare (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), che è risultato equivalente al fungicida commerciale Rizolex-T (tasso di inibizione 99,45 ± 0,39%; Figura 2C) alla concentrazione più elevata testata (10 mg/L), indicando un'efficacia simile.
Figura 2. Attività antibatterica in vitro della L-ornitina contro Sclerotinia sclerotiorum. (A) Confronto dell'attività antibatterica di diverse concentrazioni di L-ornitina contro S. sclerotiorum con il fungicida commerciale Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Tasso di inibizione (%) della crescita miceliare di S. sclerotiorum dopo il trattamento con diverse concentrazioni di L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) o Rizolex-T (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L), rispettivamente. I valori rappresentano la media ± DS di cinque repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i trattamenti (p < 0,05). (D, E) Analisi di regressione del modello Probit di L-ornitina e del fungicida commerciale Rizolex-T, rispettivamente. La retta di regressione del modello probit è rappresentata da una linea blu continua, mentre l'intervallo di confidenza (95%) è rappresentato da una linea rossa tratteggiata.
Inoltre, è stata eseguita un'analisi di regressione probit e i relativi grafici sono mostrati nella Tabella 1 e nelle Figure 2D,E. In breve, il valore di pendenza accettabile (y = 2,92x − 4,67) e le statistiche significative associate (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 e p < 0,0001; Figura 2D) della L-ornitina hanno indicato un'attività antifungina potenziata contro S. sclerotiorum rispetto al fungicida commerciale Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 e p < 0,0001) (Tabella 1).
Tabella 1. Valori della concentrazione inibitoria semimassimale (IC50) e IC99 (mg/l) di L-ornitina e del fungicida commerciale “Rizolex-T” contro S. sclerotiorum.
Complessivamente, la L-ornitina (250 mg/L) ha ridotto significativamente lo sviluppo e la gravità della muffa bianca sulle piante di fagiolo comune trattate rispetto alle piante infette da S. sclerotiorum non trattate (controllo; Figura 3A). In breve, sebbene la gravità della malattia delle piante di controllo infette non trattate sia gradualmente aumentata (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 e 92,33 ± 3,06%), la L-ornitina ha ridotto significativamente la gravità della malattia (%) durante tutto l'esperimento (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 e 26,36 ± 3,07) rispettivamente a 7, 14 e 21 giorni post-trattamento (dpt) (Figura 3A). Analogamente, quando le piante di fagiolo infette da S. sclerotiorum sono state trattate con 250 mg/L di L-ornitina, l'area sotto la curva di progressione della malattia (AUDPC) è diminuita da 1274,33 ± 33,13 nel controllo non trattato a 281,03 ± 7,95, che era leggermente inferiore a quella del controllo positivo 50 mg/L di fungicida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Lo stesso andamento è stato osservato nel secondo esperimento.
Figura 3. Effetto dell'applicazione esogena di L-ornitina sullo sviluppo della marciume bianca del fagiolo comune causata da Sclerotinia sclerotiorum in condizioni di serra. (A) Curva di progressione della malattia della muffa bianca del fagiolo comune dopo il trattamento con 250 mg/L di L-ornitina. (B) Area sotto la curva di progressione della malattia (AUDPC) della muffa bianca del fagiolo comune dopo il trattamento con L-ornitina. I valori rappresentano la media ± DS di cinque repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i trattamenti (p < 0,05).
L'applicazione esogena di 250 mg/L di L-ornitina ha gradualmente aumentato l'altezza delle piante (Fig. 4A), il numero di ramificazioni per pianta (Fig. 4B) e il numero di foglie per pianta (Fig. 4C) dopo 42 giorni. Mentre il fungicida commerciale Rizolex-T (50 mg/L) ha avuto l'effetto maggiore su tutti i parametri nutrizionali studiati, l'applicazione esogena di 250 mg/L di L-ornitina ha avuto il secondo effetto maggiore rispetto ai controlli non trattati (Figg. 4A-C). D'altra parte, il trattamento con L-ornitina non ha avuto effetti significativi sul contenuto dei pigmenti fotosintetici clorofilla a (Fig. 4D) e clorofilla b (Fig. 4E), ma ha leggermente aumentato il contenuto totale di carotenoidi (0,56 ± 0,03 mg/g peso fresco) rispetto al controllo negativo (0,44 ± 0,02 mg/g peso fresco) e al controllo positivo (0,46 ± 0,02 mg/g peso fresco; Fig. 4F). Nel complesso, questi risultati indicano che l'L-ornitina non è fitotossica per le leguminose trattate e potrebbe persino stimolarne la crescita.
Figura 4. Effetto dell'applicazione esogena di L-ornitina sulle caratteristiche di crescita e sui pigmenti fotosintetici delle foglie di fagiolo infette da Sclerotinia sclerotiorum in condizioni di serra. (A) Altezza della pianta (cm), (B) Numero di ramificazioni per pianta, (C) Numero di foglie per pianta, (D) Contenuto di clorofilla a (mg g-1 fr wt), (E) Contenuto di clorofilla b (mg g-1 fr wt), (F) Contenuto totale di carotenoidi (mg g-1 fr wt). I valori sono la media ± DS di cinque repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i trattamenti (p < 0,05).
La localizzazione istochimica in situ delle specie reattive dell'ossigeno (ROS; espresse come perossido di idrogeno [H2O2]) e dei radicali liberi (espressi come anioni superossido [O2•−]) ha rivelato che l'applicazione esogena di L-ornitina (250 mg/L) ha ridotto significativamente l'accumulo di H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) e O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) rispetto all'accumulo sia delle piante infette non trattate (173,31 ± 12,06 e 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, rispettivamente) sia delle piante trattate con 50 mg/L del fungicida commerciale Rizolex-T (170,12 ± 9,50 e 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, rispettivamente) a 72 h. Alti livelli di H2O2 e O2•− si sono accumulati in condizioni di hpt (Fig. 5A, B). Analogamente, il test della malondialdeide (MDA) basato su TCA ha mostrato che le piante di fagiolo infette da S. sclerotiorum accumulavano livelli più elevati di MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) nelle loro foglie (Fig. 5C). Tuttavia, l'applicazione esogena di L-ornitina ha ridotto significativamente la perossidazione lipidica, come evidenziato dalla diminuzione del contenuto di MDA nelle piante trattate (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Figura 5. Effetto dell'applicazione esogena di L-ornitina sui principali marcatori di stress ossidativo e sui meccanismi di difesa antiossidante non enzimatici nelle foglie di fagiolo infette da S. sclerotiorum a 72 ore dall'infezione in condizioni di serra. (A) Perossido di idrogeno (H2O2; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (B) anione superossido (O2•−; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (C) malondialdeide (MDA; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (D) fenoli solubili totali (mg GAE g−1 FW) a 72 hpt, (E) flavonoidi solubili totali (mg RE g−1 FW) a 72 hpt, (F) aminoacidi liberi totali (mg g−1 FW) a 72 hpt e (G) contenuto di prolina (mg g−1 FW) a 72 hpt. I valori rappresentano la media ± deviazione standard (media ± DS) di 5 repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i trattamenti (p < 0,05).