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Le nanoparticelle di insulina (NP) con elevato contenuto di carico hanno trovato diverse applicazioni in diverse forme di dosaggio. Questo lavoro mira a valutare l'effetto dei processi di liofilizzazione e di essiccazione a spruzzo sulla struttura delle nanoparticelle di chitosano caricate con insulina, con o senza mannitolo come crioprotettore. Abbiamo anche valutato la qualità di queste nanoparticelle ridisciogliendole. Prima della disidratazione, la dimensione delle particelle delle nanoparticelle reticolate chitosano/tripolifosfato di sodio/insulina è stata ottimizzata a 318 nm, il PDI era 0,18, l'efficienza di incapsulamento era del 99,4% e il carico era del 25,01%. Dopo la ricostituzione, tutte le nanoparticelle, ad eccezione di quelle prodotte con un metodo di liofilizzazione senza l'uso di mannitolo, hanno mantenuto la loro struttura sferica delle particelle. Rispetto alle nanoparticelle contenenti mannitolo disidratate mediante uno dei due spray, anche le nanoparticelle essiccate a spruzzo senza mannitolo hanno mostrato la più piccola dimensione media delle particelle (376 nm) e il più alto contenuto di carico (25,02%) con un tasso di incapsulamento simile (98,7%) e PDI (0,20) mediante tecniche di essiccazione o liofilizzazione. Le nanoparticelle essiccate mediante essiccazione a spruzzo senza mannitolo hanno inoltre determinato il rilascio più rapido di insulina e la massima efficienza di assorbimento cellulare. Questo lavoro dimostra che l'essiccazione a spruzzo può disidratare le nanoparticelle di insulina senza la necessità di crioprotettori rispetto ai metodi di liofilizzazione convenzionali, creando una maggiore capacità di carico, minori requisiti di additivi e costi operativi significativi.
Fin dalla sua scoperta nel 19221,2,3, l'insulina e i suoi preparati farmaceutici hanno salvato la vita di pazienti affetti da diabete di tipo 1 (T1DM) e diabete di tipo 2 (T1DM). Tuttavia, grazie alle sue proprietà di proteina ad alto peso molecolare, l'insulina viene facilmente aggregata, scomposta dagli enzimi proteolitici ed eliminata tramite l'effetto di primo passaggio. Le persone a cui è stato diagnosticato il diabete di tipo 1 necessitano di iniezioni di insulina per il resto della loro vita. Molti pazienti a cui è stato inizialmente diagnosticato il diabete di tipo 2 necessitano anche di iniezioni di insulina a lungo termine. Le iniezioni giornaliere di insulina sono una grave fonte di dolore e disagio quotidiani per questi individui, con effetti negativi sulla salute mentale. Di conseguenza, altre forme di somministrazione di insulina che causano meno disagio, come la somministrazione orale di insulina, sono ampiamente studiate5 poiché hanno il potenziale di ripristinare la qualità della vita di circa 5 miliardi di persone affette da diabete in tutto il mondo.
La tecnologia delle nanoparticelle ha rappresentato un significativo passo avanti nei tentativi di assumere insulina per via orale4,6,7. Una tecnologia che incapsula e protegge efficacemente l'insulina dalla degradazione per un rilascio mirato in siti corporei specifici. Tuttavia, l'uso di formulazioni di nanoparticelle presenta diverse limitazioni, principalmente dovute a problemi di stabilità delle sospensioni di particelle. Durante la conservazione può verificarsi una certa aggregazione, che riduce la biodisponibilità delle nanoparticelle caricate con insulina8. Inoltre, è necessario considerare anche la stabilità chimica della matrice polimerica delle nanoparticelle e dell'insulina per garantire la stabilità delle nanoparticelle di insulina (NP). Attualmente, la tecnologia di liofilizzazione è il gold standard per la creazione di NP stabili, prevenendo al contempo modifiche indesiderate durante la conservazione9.
Tuttavia, la liofilizzazione richiede l'aggiunta di crioprotettori per evitare che la struttura sferica delle nanoparticelle venga influenzata dallo stress meccanico dei cristalli di ghiaccio. Ciò riduce significativamente il carico di nanoparticelle di insulina dopo la liofilizzazione, poiché il crioprotettore occupa la maggior parte del rapporto in peso. Pertanto, le nanoparticelle di insulina prodotte si rivelano spesso inadatte alla produzione di formulazioni in polvere secca, come compresse orali e film orali, a causa della necessità di grandi quantità di nanoparticelle secche per raggiungere la finestra terapeutica dell'insulina.
L'essiccazione a spruzzo è un processo su scala industriale ben noto ed economico per la produzione di polveri secche da fasi liquide nell'industria farmaceutica10,11. Il controllo sul processo di formazione delle particelle consente un corretto incapsulamento di diversi composti bioattivi12, 13. Inoltre, è diventata una tecnica efficace per la preparazione di proteine ​​incapsulate per la somministrazione orale. Durante l'essiccazione a spruzzo, l'acqua evapora molto rapidamente, il che aiuta a mantenere bassa la temperatura del nucleo delle particelle11,14, consentendone l'applicazione per incapsulare componenti sensibili al calore. Prima dell'essiccazione a spruzzo, il materiale di rivestimento deve essere accuratamente omogeneizzato con la soluzione contenente gli ingredienti incapsulati11,14. A differenza della liofilizzazione, l'omogeneizzazione prima dell'incapsulamento nell'essiccazione a spruzzo migliora l'efficienza dell'incapsulamento durante la disidratazione. Poiché il processo di incapsulamento mediante essiccazione a spruzzo non richiede crioprotettori, l'essiccazione a spruzzo può essere utilizzata per produrre NP essiccate con un elevato contenuto di carico.
Questo studio riporta la produzione di nanoparticelle caricate di insulina mediante reticolazione di chitosano e tripolifosfato di sodio utilizzando un metodo di gel ionico. La gelificazione ionica è un metodo di preparazione che consente la produzione di nanoparticelle attraverso interazioni elettrostatiche tra due o più specie ioniche in determinate condizioni. Sono state utilizzate tecniche di liofilizzazione e di essiccazione a spruzzo per disidratare le nanoparticelle reticolate ottimizzate di chitosano/tripolifosfato di sodio/insulina. Dopo la disidratazione, la loro morfologia è stata analizzata tramite SEM. La loro capacità di ricombinazione è stata valutata misurando la distribuzione dimensionale, la carica superficiale, il PDI, l'efficienza di incapsulamento e il contenuto di carico. La qualità delle nanoparticelle risolubilizzate prodotte con diversi metodi di disidratazione è stata valutata anche confrontando la loro protezione insulinica, il comportamento di rilascio e l'efficacia di assorbimento cellulare.
Il pH della soluzione mista e il rapporto tra chitosano e insulina sono due fattori chiave che influenzano la dimensione delle particelle e l'efficienza di incapsulamento (EE) delle nanoparticelle finali, poiché influenzano direttamente il processo di gelificazione ionotropica. È stato dimostrato che il pH della soluzione mista è altamente correlato con la dimensione delle particelle e l'efficienza di incapsulamento (Fig. 1a). Come mostrato in Fig. 1a, all'aumentare del pH da 4,0 a 6,0, la dimensione media delle particelle (nm) è diminuita e l'EE è aumentata significativamente, mentre quando il pH è aumentato a 6,5, la dimensione media delle particelle ha iniziato ad aumentare e l'EE è rimasta invariata. All'aumentare del rapporto tra chitosano e insulina, aumenta anche la dimensione media delle particelle. Inoltre, non è stata osservata alcuna variazione nell'EE quando le nanoparticelle sono state preparate con un rapporto di massa tra chitosano/insulina superiore a 2,5:1 (p/p) (Fig. 1b). Pertanto, le condizioni di preparazione ottimali in questo studio (pH 6,0, rapporto di massa tra chitosano/insulina di 2,5:1) sono stati utilizzati per preparare nanoparticelle caricate di insulina per ulteriori studi. In queste condizioni di preparazione, la dimensione media delle particelle di nanoparticelle di insulina è stata ottimizzata a 318 nm (Fig. 1c), il PDI era 0,18, l'efficienza di inclusione era del 99,4%, il potenziale zeta era 9,8 mv e il carico di insulina era del 25,01% (m/m). Sulla base dei risultati della microscopia elettronica a trasmissione (TEM), le nanoparticelle ottimizzate erano approssimativamente sferiche e discrete con dimensioni relativamente uniformi (Fig. 1d).
Ottimizzazione dei parametri delle nanoparticelle di insulina: (a) l'effetto del pH sul diametro medio e sull'efficienza di incapsulamento (EE) delle nanoparticelle di insulina (preparate con un rapporto di massa di chitosano e insulina di 5:1); (b) chitosano e influenza del rapporto di massa dell'insulina sul diametro medio e sull'efficienza di incapsulamento (EE) delle nanoparticelle di insulina (preparate a pH 6); (c) distribuzione delle dimensioni delle particelle delle nanoparticelle di insulina ottimizzate; (d) micrografia TEM delle nanoparticelle di insulina ottimizzate.
È noto che il chitosano è un polielettrolita debole con un pKa di 6,5. È caricato positivamente in mezzi acidi perché il suo gruppo amminico principale è protonato da ioni idrogeno15. Pertanto, viene spesso utilizzato come vettore per incapsulare macromolecole caricate negativamente. In questo studio, il chitosano è stato utilizzato per incapsulare l'insulina con un punto isoelettrico di 5,3. Poiché il chitosano viene utilizzato come materiale di rivestimento, con l'aumento della sua proporzione, lo spessore dello strato esterno delle nanoparticelle aumenta di conseguenza, con conseguente maggiore dimensione media delle particelle. Inoltre, livelli più elevati di chitosano possono incapsulare più insulina. Nel nostro caso, l'EE era più alto quando il rapporto tra chitosano e insulina raggiungeva 2,5:1 e non si è verificato alcun cambiamento significativo nell'EE quando il rapporto continuava ad aumentare.
Oltre al rapporto tra chitosano e insulina, anche il pH ha svolto un ruolo cruciale nella preparazione delle nanoparticelle. Gan et al. 17 hanno studiato l'effetto del pH sulla dimensione delle particelle delle nanoparticelle di chitosano. Hanno riscontrato una continua diminuzione della dimensione delle particelle fino a raggiungere il pH 6,0, e un aumento significativo della dimensione delle particelle è stato osservato a pH > 6,0, il che è coerente con le nostre osservazioni. Questo fenomeno è dovuto al fatto che con l'aumento del pH, la molecola di insulina acquisisce una carica superficiale negativa, favorendo così le interazioni elettrostatiche con il complesso chitosano/tripolifosfato di sodio (TPP), con conseguente riduzione delle dimensioni delle particelle e aumento dell'EE. Tuttavia, quando il pH è stato regolato a 6,5, i gruppi amminici sul chitosano sono stati deprotonati, con conseguente ripiegamento del chitosano. Pertanto, un pH elevato determina una minore esposizione degli ioni amminici a TPP e insulina, con conseguente minore reticolazione, maggiore dimensione media finale delle particelle e minore EE.
L'analisi delle proprietà morfologiche delle nanoparticelle liofilizzate e atomizzate può guidare la selezione di tecniche migliori di disidratazione e formazione di polvere. Il metodo preferito dovrebbe fornire stabilità del farmaco, forma uniforme delle particelle, elevato carico di farmaco e buona solubilità nella soluzione originale. In questo studio, per confrontare meglio le due tecniche, sono state utilizzate nanoparticelle di insulina con o senza mannitolo all'1% durante la disidratazione. Il mannitolo viene utilizzato come agente di carica o crioprotettore in varie formulazioni di polvere secca per la liofilizzazione e l'essiccazione a spruzzo. Per le nanoparticelle di insulina liofilizzate senza mannitolo, come mostrato nella Figura 2a, è stata osservata una struttura di polvere altamente porosa con superfici grandi, irregolari e ruvide al microscopio elettronico a scansione (SEM). Poche particelle discrete sono state rilevate nella polvere dopo la disidratazione (Fig. 2e). Questi risultati hanno indicato che la maggior parte delle nanoparticelle si è decomposta durante la liofilizzazione senza alcun crioprotettore. Per le nanoparticelle di insulina liofilizzate e atomizzate contenenti mannitolo all'1%, sono state osservate nanoparticelle sferiche con superfici lisce (Fig. 2b,d,f,h). Le nanoparticelle di insulina essiccate a spruzzo senza mannitolo sono rimaste sferiche ma rugose sulla superficie (Fig. 2c). Le superfici sferiche e rugose sono ulteriormente discusse nei test sul comportamento di rilascio e sull'assorbimento cellulare di seguito. In base all'aspetto visibile delle nanoparticelle essiccate, sia le nanoparticelle essiccate a spruzzo senza mannitolo che le nanoparticelle liofilizzate e essiccate a spruzzo con mannitolo hanno prodotto polveri di nanoparticelle fini (Fig. 2f,g,h). Maggiore è l'area superficiale tra le superfici delle particelle, maggiore è la solubilità e quindi maggiore è la velocità di rilascio.
Morfologia di diverse NP di insulina disidratata: (a) immagine SEM di NP di insulina liofilizzata senza mannitolo; (b) immagine SEM di NP di insulina liofilizzata con mannitolo; (c) immagine SEM di NP di insulina essiccata a spruzzo senza mannitolo; (d) immagine SEM di NP di insulina essiccata a spruzzo con mannitolo; (e) immagine di NP di insulina liofilizzata in polvere senza mannitolo; (f) immagine di NP di insulina liofilizzata con mannitolo; (g) immagine di NP di insulina essiccata a spruzzo in polvere senza mannitolo; (h) immagine di NP di insulina essiccata a spruzzo in polvere con mannitolo.
Durante la liofilizzazione, il mannitolo agisce come crioprotettore, mantenendo le nanoparticelle in forma amorfa e prevenendo i danni causati dai cristalli di ghiaccio19. Al contrario, non vi è alcuna fase di congelamento durante l'essiccazione a spruzzo. Pertanto, il mannitolo non è richiesto in questo metodo. Infatti, le nanoparticelle essiccate a spruzzo senza mannitolo hanno prodotto nanoparticelle più fini come precedentemente descritto. Tuttavia, il mannitolo può ancora agire come riempitivo nel processo di essiccazione a spruzzo per conferire alle nanoparticelle una struttura più sferica20 (Fig. 2d), che aiuta a ottenere un comportamento di rilascio uniforme di tali nanoparticelle incapsulate. Inoltre, è chiaro che alcune particelle di grandi dimensioni possono essere rilevate sia nelle nanoparticelle di insulina liofilizzate che in quelle essiccate a spruzzo contenenti mannitolo (Fig. 2b,d), il che può essere dovuto all'accumulo di mannitolo nel nucleo della particella insieme all'insulina incapsulata. Per lo strato di chitosano. Vale la pena notare che in questo studio, per garantire che la struttura sferica rimanga intatta dopo la disidratazione, il rapporto tra mannitolo e chitosano è mantenuto a 5:1, in modo che una grande quantità di riempitivo possa anche aumentare la dimensione delle particelle delle nanoparticelle essiccate.
La spettroscopia a riflessione totale attenuata nell'infrarosso a trasformata di Fourier (FTIR-ATR) ha caratterizzato la miscela fisica di insulina libera, chitosano, chitosano, TPP e insulina. Tutte le nanoparticelle disidratate sono state caratterizzate utilizzando la spettroscopia FTIR-ATR. In particolare, sono state osservate intensità di banda di 1641, 1543 e 1412 cm-1 nelle nanoparticelle incapsulate liofilizzate con mannitolo e nelle nanoparticelle essiccate a spruzzo con e senza mannitolo (Fig. 3). Come riportato in precedenza, questi aumenti di forza erano associati alla reticolazione tra chitosano, TPP e insulina. L'indagine sull'interazione tra chitosano e insulina ha mostrato che negli spettri FTIR delle nanoparticelle di chitosano caricate con insulina, la banda del chitosano si sovrapponeva a quella dell'insulina, aumentando l'intensità del carbonile (1641 cm-1) e la cintura amminica (1543 cm-1). I gruppi tripolifosfato della TPP sono legati a gruppi ammonio nel chitosano, che formano una banda a 1412 cm-1.
Spettri FTIR-ATR di insulina libera, chitosano, miscele fisiche di chitosano/TPP/insulina e NP disidratate con metodi diversi.
Inoltre, questi risultati sono coerenti con quelli mostrati in SEM, che ha mostrato che le NP incapsulate sono rimaste intatte sia quando spruzzate che liofilizzate con mannitolo, ma in assenza di mannitolo, solo l'essiccazione a spruzzo ha prodotto particelle incapsulate. Al contrario, i risultati spettrali FTIR-ATR delle NP liofilizzate senza mannitolo erano molto simili alla miscela fisica di chitosano, TPP e insulina. Questo risultato indica che i legami crociati tra chitosano, TPP e insulina non sono più presenti nelle NP liofilizzate senza mannitolo. La struttura delle NP è stata distrutta durante la liofilizzazione senza crioprotettore, come si può vedere nei risultati SEM (Fig. 2a). Sulla base della morfologia e dei risultati FTIR delle NP di insulina disidratate, solo le NP liofilizzate, essiccate a spruzzo e prive di mannitolo sono state utilizzate per gli esperimenti di ricostituzione e le NP prive di mannitolo a causa alla decomposizione delle nanoparticelle prive di mannitolo durante la disidratazione. discutere.
La disidratazione viene utilizzata per la conservazione a lungo termine e la rielaborazione in altre formulazioni. La capacità delle nanoparticelle secche di ricostituirsi dopo la conservazione è fondamentale per il loro utilizzo in diverse formulazioni come compresse e film. Abbiamo notato che la dimensione media delle particelle delle nanoparticelle di insulina essiccate a spruzzo in assenza di mannitolo è aumentata solo leggermente dopo la ricostituzione. D'altro canto, la dimensione delle particelle delle nanoparticelle di insulina essiccate a spruzzo e liofilizzate con mannitolo è aumentata significativamente (Tabella 1). PDI ed EE non sono cambiati significativamente (p > 0,05) dopo la ricombinazione di tutte le nanoparticelle in questo studio (Tabella 1). Questo risultato indica che la maggior parte delle particelle è rimasta intatta dopo la ridissoluzione. Tuttavia, l'aggiunta di mannitolo ha comportato una notevole riduzione del carico di insulina delle nanoparticelle di mannitolo liofilizzate e essiccate a spruzzo (Tabella 1). Al contrario, il contenuto di carico di insulina delle nanoparticelle essiccate a spruzzo senza mannitolo è rimasto lo stesso di prima (Tabella 1).
È noto che il caricamento delle nanoparticelle è fondamentale quando vengono utilizzate per scopi di somministrazione di farmaci. Per le nanoparticelle con carichi bassi, sono necessarie quantità molto grandi di materiale per raggiungere la soglia terapeutica. Tuttavia, l'elevata viscosità di tali concentrazioni elevate di NP comporta inconvenienti e difficoltà nella somministrazione orale e nelle formulazioni iniettabili, rispettivamente 22. Inoltre, le nanoparticelle di insulina possono anche essere utilizzate per produrre compresse e biofilm viscosi23, 24, il che richiede l'uso di grandi quantità di NP a bassi livelli di caricamento, con conseguenti compresse di grandi dimensioni e biofilm spessi che non sono adatti per applicazioni orali. Pertanto, le nanoparticelle disidratate con un elevato carico di insulina sono altamente desiderabili. I nostri risultati suggeriscono che l'elevato carico di insulina delle nanoparticelle essiccate a spruzzo senza mannitolo può offrire molti vantaggi interessanti per questi metodi di somministrazione alternativi.
Tutte le nanoparticelle disidratate sono state conservate in frigorifero per tre mesi. I risultati SEM hanno mostrato che la morfologia di tutte le nanoparticelle disidratate non è cambiata significativamente durante la conservazione di tre mesi (Fig. 4). Dopo la ricostituzione in acqua, tutte le nanoparticelle hanno mostrato una leggera diminuzione dell'EE e hanno rilasciato circa una piccola quantità (~5%) di insulina durante il periodo di conservazione di tre mesi (Tabella 2). Tuttavia, la dimensione media delle particelle di tutte le nanoparticelle è aumentata. La dimensione delle particelle delle nanoparticelle essiccate a spruzzo senza mannitolo è aumentata a 525 nm, mentre quella delle nanoparticelle essiccate a spruzzo e liofilizzate con mannitolo è aumentata rispettivamente a 872 e 921 nm (Tabella 2).
Morfologia di diverse nanoparticelle di insulina disidratate conservate per tre mesi: (a) immagine SEM di nanoparticelle di insulina liofilizzate con mannitolo; (b) immagine SEM di nanoparticelle di insulina essiccate a spruzzo senza mannitolo; (c) senza mannitolo Immagini SEM di nanoparticelle di insulina essiccate a spruzzo.
Inoltre, sono stati osservati precipitati nelle nanoparticelle di insulina ricostituite, essiccate a spruzzo con mannitolo e liofilizzate (Fig. S2). Ciò potrebbe essere causato da particelle di grandi dimensioni che non sono adeguatamente sospese nell'acqua. Tutti i risultati sopra riportati dimostrano che la tecnica di essiccazione a spruzzo può proteggere le nanoparticelle di insulina dalla disidratazione e che è possibile ottenere carichi elevati di nanoparticelle di insulina senza riempitivi o crioprotettori.
La ritenzione di insulina è stata testata in un mezzo a pH = 2,5 con pepsina, tripsina e α-chimotripsina per dimostrare la capacità protettiva delle NP contro la digestione enzimatica dopo la disidratazione. La ritenzione di insulina delle NP disidratate è stata confrontata con quella delle NP appena preparate e l'insulina libera è stata utilizzata come controllo negativo. In questo studio, l'insulina libera ha mostrato una rapida eliminazione dell'insulina entro 4 ore in tutti e tre i trattamenti enzimatici (Fig. 5a–c). Al contrario, i test di eliminazione dell'insulina delle NP liofilizzate con mannitolo e delle NP essiccate a spruzzo con o senza mannitolo hanno mostrato una protezione significativamente maggiore di queste NP contro la digestione enzimatica, che era simile a quella delle NP di insulina appena preparate (figura 1). 5a-c). Con l'aiuto di nanoparticelle in pepsina, tripsina e α-chimotripsina, più del 50%, 60% e 75% dell'insulina potrebbe essere protetto entro 4 h, rispettivamente (Fig. 5a–c). Questa capacità insulino-protettiva può aumentare la possibilità di un maggiore assorbimento di insulina nel flusso sanguigno25. Questi risultati suggeriscono che l'essiccazione a spruzzo con o senza mannitolo e la liofilizzazione con mannitolo possono preservare la capacità insulino-protettiva delle NP dopo la disidratazione.
Protezione e comportamento di rilascio delle nanoparticelle di insulina disidratate: (a) protezione dell'insulina in soluzione di pepsina; (b) protezione dell'insulina in soluzione di tripsina; (c) protezione dell'insulina mediante soluzione di α-chimotripsina; (d) comportamento di rilascio delle nanoparticelle disidratate in soluzione a pH = 2,5; (e) comportamento di rilascio delle nanoparticelle disidratate in soluzione a pH = 6,6; (f) comportamento di rilascio delle nanoparticelle disidratate in soluzione a pH = 7,0.
Le nanoparticelle di insulina secche appena preparate e ricostituite sono state incubate in vari tamponi (pH = 2,5, 6,6, 7,0) a 37 °C, simulando l'ambiente di pH dello stomaco, del duodeno e dell'intestino tenue superiore, per esaminare l'effetto dell'insulina sulla resistenza all'insulina. Comportamento del rilascio in diversi ambienti. Frammento del tratto gastrointestinale. A pH = 2,5, le nanoparticelle caricate con insulina e le nanoparticelle di insulina secca risolubilizzata hanno mostrato un rilascio iniziale a raffica entro la prima ora, seguito da un rilascio lento nelle successive 5 ore (Fig. 5d). Questo rapido rilascio iniziale è molto probabilmente il risultato di un rapido desorbimento superficiale delle molecole proteiche che non sono completamente immobilizzate nella struttura interna della particella. A pH = 6,5, le nanoparticelle caricate con insulina e le nanoparticelle di insulina secca ricostituita hanno mostrato un rilascio lento e regolare nell'arco di 6 ore, poiché il pH della soluzione di prova era simile a quello della soluzione preparata con le nanoparticelle (Fig. 5e). A pH = 7, le nanoparticelle erano instabili e quasi completamente decomposte entro le prime due ore (Fig. 5f). Questo perché la deprotonazione del chitosano avviene a pH più elevato, il che si traduce in una rete polimerica meno compatta e nel rilascio di insulina caricata.
Inoltre, le nanoparticelle di insulina essiccate a spruzzo senza mannitolo hanno mostrato un profilo di rilascio più rapido rispetto alle altre nanoparticelle disidratate (Fig. 5d–f). Come descritto in precedenza, le nanoparticelle di insulina ricostituite ed essiccate senza mannitolo hanno mostrato la dimensione delle particelle più piccola. Le particelle piccole forniscono una superficie maggiore, quindi la maggior parte del farmaco rilevante si troverà sulla superficie delle particelle o nelle vicinanze, con conseguente rapido rilascio del farmaco26.
La citotossicità delle nanoparticelle è stata studiata mediante il test MTT. Come mostrato nella Figura S4, è stato riscontrato che tutte le nanoparticelle disidratate non hanno avuto alcun effetto significativo sulla vitalità cellulare a concentrazioni di 50–500 μg/ml, il che suggerisce che tutte le nanoparticelle disidratate possono essere utilizzate in sicurezza per raggiungere la finestra terapeutica.
Il fegato è l'organo principale attraverso il quale l'insulina esercita le sue funzioni fisiologiche. Le cellule HepG2 sono una linea cellulare di epatoma umano comunemente utilizzata come modello di assorbimento degli epatociti in vitro. Qui, le cellule HepG2 sono state utilizzate per valutare l'assorbimento cellulare di NP disidratate utilizzando metodi di liofilizzazione e spray-drying. Assorbimento cellulare mediante scansione laser confocale utilizzando citometria a flusso e visione dopo diverse ore di incubazione con insulina FITC libera a una concentrazione di 25 μg/mL, NP caricate con insulina FITC preparate di fresco e NP caricate con insulina FITC disidratate a concentrazioni di insulina uguali. Sono state eseguite osservazioni di microscopia quantitativa (CLSM). Le NP liofilizzate senza mannitolo sono state distrutte durante la disidratazione e non sono state valutate in questo test. Le intensità di fluorescenza intracellulare di NP caricate con insulina preparate di fresco, NP liofilizzate con mannitolo e NP essiccate a spruzzo con e senza mannitolo (Fig. 6a) erano rispettivamente 4,3, 2,6, 2,4 e 4,1 volte più alti di quelli liberi. Gruppo insulina-FITC (Fig. 6b). Questi risultati suggeriscono che l'insulina incapsulata è più potente nell'assorbimento cellulare rispetto all'insulina libera, principalmente a causa delle dimensioni più piccole delle nanoparticelle caricate di insulina prodotte nello studio.
Assorbimento delle cellule HepG2 dopo 4 ore di incubazione con nanoparticelle appena preparate e nanoparticelle disidratate: (a) Distribuzione dell'assorbimento di FITC-insulina da parte delle cellule HepG2. (b) Media geometrica delle intensità di fluorescenza analizzate mediante citometria a flusso (n = 3), *P < 0,05 rispetto all'insulina libera.
Allo stesso modo, le immagini CLSM hanno mostrato che le intensità di fluorescenza FITC delle NP caricate con insulina FITC appena preparate e delle NP essiccate a spruzzo caricate con insulina FITC (senza mannitolo) erano molto più forti di quelle degli altri campioni (Fig. 6a). Inoltre, con l'aggiunta di mannitolo, la maggiore viscosità della soluzione ha aumentato la resistenza all'assorbimento cellulare, con conseguente riduzione della proliferazione dell'insulina. Questi risultati suggeriscono che le NP essiccate a spruzzo senza mannitolo hanno mostrato la massima efficienza di assorbimento cellulare perché la dimensione delle loro particelle era inferiore a quella delle NP liofilizzate dopo la ridissoluzione.
Il chitosano (peso molecolare medio 100 kDa, deacetilato al 75-85%) è stato acquistato da Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Il tripolifosfato di sodio (TPP) è stato acquistato da VWR (Radnor, Pennsylvania, USA). L'insulina umana ricombinante utilizzata in questo studio proveniva da Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). L'insulina umana marcata con isotiocianato di fluoresceina (FITC) e il dicloridrato di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). La linea cellulare HepG2 è stata ottenuta da ATCC (Manassas, Virginia, USA). Tutti gli altri reagenti erano di grado analitico o cromatografico.
Preparare una soluzione di CS da 1 mg/ml sciogliendola in acqua bidistillata (acqua DD) contenente acido acetico allo 0,1%. Preparare soluzioni da 1 mg/ml di TPP e insulina sciogliendole rispettivamente in acqua DD e acido acetico allo 0,1%. La pre-emulsione è stata preparata con un omogeneizzatore ad alta velocità Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Il processo di preparazione è il seguente: in primo luogo, 2 ml di soluzione di TPP vengono aggiunti a 4 ml di soluzione di insulina e la miscela viene agitata per 30 minuti e completamente miscelata. Quindi, la soluzione miscelata è stata aggiunta goccia a goccia alla soluzione di CS tramite una siringa sotto agitazione ad alta velocità (10.000 giri/min). Le miscele sono state mantenute sotto agitazione ad alta velocità (15.000 giri/min) in un bagno di ghiaccio per 30 minuti e sono state regolate a un certo pH per ottenere NP di insulina reticolate. Per omogeneizzare ulteriormente e ridurre la dimensione delle particelle di NP di insulina, sono stati sonicati per altri 30 minuti in un bagno di ghiaccio utilizzando un sonicatore a sonda (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germania).
Le NPS di insulina sono state testate per il diametro medio Z, l'indice di polidispersità (PDI) e il potenziale zeta utilizzando misurazioni di diffusione dinamica della luce (DLS) utilizzando un Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) diluendole in acqua DD a 25 °C. La morfologia e la distribuzione delle dimensioni sono state caratterizzate da un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Giappone) e le immagini sono state successivamente analizzate utilizzando il software di imaging Hitachi (Hitachi, Tokyo, Giappone). Per valutare l'efficienza di incapsulamento (EE) e la capacità di carico (LC) delle NP di insulina, le NP sono state pipettate in provette per ultrafiltrazione con un cut-off del peso molecolare di 100 kDa e centrifugate a 500 xg per 30 min. L'insulina non incapsulata nel filtrato è stata quantificata utilizzando un sistema HPLC Agilent serie 1100 (Agilent, Santa Clara, California, USA) costituito da una pompa quaternaria, autocampionatore, riscaldatore della colonna e rivelatore DAD. L'insulina è stata analizzata mediante una colonna C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) e rilevata a 214 nm. La fase mobile era composta da acetonitrile e acqua, contenente lo 0,1% di TFA, rapporti di gradiente da 10/90 a 100/0, e fatta funzionare per 10 minuti. La fase mobile è stata pompata a una portata di 1,0 ml/min. La temperatura della colonna è stata impostata a 20 °C. Calcolare le percentuali di EE e LC utilizzando le equazioni.(1) ed Eq.(2).
Sono stati testati vari rapporti CS/insulina compresi tra 2,0 e 4,0 per ottimizzare le nanoparticelle di insulina. Durante la preparazione sono state aggiunte diverse quantità di soluzione CS, mantenendo costante la miscela insulina/TPP. Le nanoparticelle di insulina sono state preparate in un intervallo di pH compreso tra 4,0 e 6,5, controllando attentamente il pH della miscela dopo l'aggiunta di tutte le soluzioni (insulina, TPP e CS). L'EE e la dimensione delle particelle delle nanoparticelle di insulina sono state valutate a diversi valori di pH e rapporti di massa CS/insulina per ottimizzare la formazione di nanoparticelle di insulina.
Le nanoparticelle di insulina ottimizzate sono state posizionate sul contenitore di alluminio e coperte con un fazzoletto di carta stretto con del nastro adesivo. Successivamente, i contenitori avvitati sono stati posizionati in un liofilizzatore Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) dotato di essiccatore a vassoio. La temperatura e la pressione del vuoto sono state impostate a -10 °C, 0,350 Torr per le prime 2 ore e a 0 °C e 0,120 Torr per le restanti 22 ore delle 24 ore per ottenere nanoparticelle di insulina secche.
Per generare insulina incapsulata è stato utilizzato il Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Svizzera). I parametri di essiccazione selezionati erano: temperatura 100 °C, flusso di alimentazione 3 L/min e flusso di gas 4 L/min.
Le nanoparticelle di insulina prima e dopo la disidratazione sono state caratterizzate mediante spettroscopia FTIR-ATR. Le nanoparticelle disidratate, così come l'insulina libera e il chitosano, sono stati analizzati utilizzando uno spettrofotometro FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) dotato di un accessorio di campionamento ATR universale (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Le medie del segnale sono state ottenute da 16 scansioni a una risoluzione di 4 cm2 nell'intervallo di frequenza di 4000-600 cm2.
La morfologia delle nanoparticelle di insulina secche è stata valutata mediante immagini SEM di nanoparticelle di insulina liofilizzate e atomizzate, acquisite tramite un microscopio elettronico a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) Helios NanoLab 650 (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). I ​​parametri principali utilizzati erano una tensione di 5 keV e una corrente di 30 mA.
Tutte le NP di insulina disidratate sono state ridisciolte in acqua distillata. La dimensione delle particelle, PDI, EE e LC sono state nuovamente testate utilizzando lo stesso metodo menzionato in precedenza per valutarne la qualità dopo la disidratazione. La stabilità delle NP di anidroinsulina è stata misurata anche testando le proprietà delle NP dopo una conservazione prolungata. In questo studio, tutte le NP dopo la disidratazione sono state conservate in frigorifero per tre mesi. Dopo tre mesi di conservazione, le NP sono state testate per la dimensione morfologica delle particelle, PDI, EE e LC.
Sciogliere 5 mL di NP ricostituiti in 45 mL contenenti fluido gastrico simulato (pH 1,2, contenente l'1% di pepsina), fluido intestinale (pH 6,8, contenente l'1% di tripsina) o soluzione di chimotripsina (100 g/mL, in tampone fosfato, pH 7,8) per valutare l'efficacia dell'insulina nel proteggere le NP dopo la disidratazione. Sono state incubate a 37 °C con una velocità di agitazione di 100 rpm. 500 μL della soluzione sono stati raccolti in diversi punti temporali e la concentrazione di insulina è stata determinata mediante HPLC.
Il comportamento di rilascio in vitro di nanoparticelle di insulina preparate di fresco e disidratate è stato testato con il metodo della sacca per dialisi (peso molecolare limite 100 kDa, Spectra Por Inc.). Le nanoparticelle secche preparate di fresco e ricostituite sono state dializzate in fluidi a pH 2,5, pH 6,6 e pH 7,0 (soluzione salina tamponata con fosfato 0,1 M, PBS) per simulare l'ambiente di pH dello stomaco, del duodeno e dell'intestino tenue superiore, rispettivamente. Tutti i campioni sono stati incubati a 37 °C con agitazione continua a 200 rpm. Aspirare il fluido all'esterno della sacca per dialisi da 5 mL nei seguenti tempi: 0,5, 1, 2, 3, 4 e 6 ore e ripristinare immediatamente il volume con dializzato fresco. La contaminazione da insulina nel fluido è stata analizzata mediante HPLC e la velocità di rilascio di insulina dalle nanoparticelle è stata calcolata dal rapporto tra insulina libera rilasciata e insulina totale incapsulata in le nanoparticelle (equazione 3).
Le cellule HepG2 della linea cellulare umana di carcinoma epatocellulare sono state coltivate in piastre da 60 mm di diametro utilizzando Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale, 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina29. Le colture sono state mantenute a 37 °C, 95% di umidità relativa e 5% di CO2. Per i test di assorbimento, le cellule HepG2 sono state seminate a 1 × 105 cellule/ml su un sistema di vetrini da camera Nunc Lab-Tek a 8 pozzetti (Thermo Fisher, NY, USA). Per i test di citotossicità, sono state seminate in piastre da 96 pozzetti (Corning, NY, USA) a una densità di 5 × 104 cellule/ml.
Il test MTT è stato utilizzato per valutare la citotossicità delle NP di insulina appena preparate e disidratate30. Le cellule HepG2 sono state seminate in piastre da 96 pozzetti a una densità di 5 × 104 cellule/mL e coltivate per 7 giorni prima del test. Le NP di insulina sono state diluite a varie concentrazioni (da 50 a 500 μg/mL) nel terreno di coltura e quindi somministrate alle cellule. Dopo 24 ore di incubazione, le cellule sono state lavate 3 volte con PBS e incubate con terreno contenente 0,5 mg/ml di MTT per altre 4 ore. La citotossicità è stata valutata misurando la riduzione enzimatica dell'MTT di tetrazolio giallo a formazano viola a 570 nm utilizzando uno spettrofotometro lettore di piastre Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Svizzera).
L'efficienza di assorbimento cellulare delle nanoparticelle è stata testata mediante microscopia confocale a scansione laser e analisi di citometria a flusso. Ogni pozzetto del sistema di vetrini a camera Nunc Lab-Tek è stato trattato con insulina FITC libera, nanoparticelle caricate con insulina FITC e ricostituito 25 μg/mL di nanoparticelle disidratate con insulina FITC alla stessa concentrazione e incubato per 4 ore. Le cellule sono state lavate 3 volte con PBS e fissate con paraformaldeide al 4%. I nuclei sono stati colorati con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). La localizzazione dell'insulina è stata osservata utilizzando un microscopio confocale a scansione laser/due fotoni Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Giappone). Per l'analisi di citometria a flusso, sono state utilizzate le stesse concentrazioni di 10 μg/mL di insulina FITC libera, nanoparticelle caricate con insulina FITC e nanoparticelle disidratate risolubilizzate. Le nanoparticelle di insulina FITC sono state aggiunte a piastre da 96 pozzetti seminate con cellule HepG2 e incubate per 4 ore. Dopo 4 ore di incubazione, le cellule sono state rimosse e lavate 3 volte con FBS. 5 × 104 cellule per campione sono state analizzate mediante un citofluorimetro BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Stati Uniti).
Tutti i valori sono espressi come media ± deviazione standard. I confronti tra tutti i gruppi sono stati valutati utilizzando ANOVA a un fattore o t-test da IBM SPSS Statistics 26 per Mac (IBM, Endicott, New York, USA) e p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Questo studio dimostra la flessibilità e la capacità dell'essiccazione a spruzzo di disidratare nanoparticelle di chitosano/TPP/insulina reticolate con una migliore ricostituzione rispetto ai metodi di liofilizzazione standard che utilizzano agenti di carica o crioprotettori e una maggiore capacità di carico. Le nanoparticelle di insulina ottimizzate hanno prodotto una dimensione media delle particelle di 318 nm e un'efficienza di incapsulamento del 99,4%. I risultati SEM e FTIR dopo la disidratazione hanno mostrato che la struttura sferica è stata mantenuta solo nelle nanoparticelle essiccate a spruzzo con e senza mannitolo e liofilizzate con mannitolo, ma le nanoparticelle liofilizzate senza mannitolo si sono decomposte durante la disidratazione. Nel test di capacità di ricostituzione, le nanoparticelle di insulina essiccate a spruzzo senza mannitolo hanno mostrato la dimensione media delle particelle più piccola e il carico più elevato dopo la ricostituzione. I comportamenti di rilascio di tutte queste nanoparticelle disidratate hanno mostrato che sono state rilasciate rapidamente in soluzioni di pH = 2,5 e pH = 7 e molto stabili in soluzioni di pH = 6.5.Rispetto ad altre nanoparticelle disidratate ridisciolte, le nanoparticelle essiccate a spruzzo senza mannitolo hanno mostrato il rilascio più rapido. Questo risultato è coerente con quello osservato nel test di assorbimento cellulare, poiché le nanoparticelle essiccate a spruzzo in assenza di mannitolo hanno mantenuto quasi completamente l'efficienza di assorbimento cellulare delle nanoparticelle appena preparate. Questi risultati suggeriscono che le nanoparticelle di insulina secche preparate mediante essiccazione a spruzzo senza mannitolo sono più adatte per l'ulteriore elaborazione in altre forme di dosaggio anidre, come compresse orali o pellicole bioadesive.
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