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Le nanoparticelle di insulina (NP) con un elevato contenuto di carico hanno trovato diverse applicazioni in diverse forme di dosaggio. Questo lavoro mira a valutare l'effetto dei processi di liofilizzazione e liofilizzazione a spruzzo sulla struttura delle nanoparticelle di chitosano caricate con insulina, con o senza mannitolo come crioprotettore. Abbiamo anche valutato la qualità di queste nanoparticelle ridisciogliendole. Prima della disidratazione, la dimensione delle particelle delle nanoparticelle reticolate di chitosano/tripolifosfato di sodio/insulina è stata ottimizzata a 318 nm, il PDI era 0,18, l'efficienza di incapsulamento era 99,4% e il carico era 25,01%. Dopo la ricostituzione, tutte le nanoparticelle, ad eccezione di quelle prodotte con un metodo di liofilizzazione senza l'uso di mannitolo, hanno mantenuto la loro struttura particellare sferica. Rispetto alle nanoparticelle contenenti mannitolo disidratate mediante liofilizzazione a spruzzo, le nanoparticelle liofilizzate a spruzzo senza mannitolo hanno anche mostrato la media più piccola dimensione delle particelle (376 nm) e il più alto contenuto di carico (25,02%) con un tasso di incapsulamento simile (98,7%) e PDI (0,20) mediante tecniche di essiccazione o liofilizzazione. Le nanoparticelle essiccate mediante essiccazione a spruzzo senza mannitolo hanno anche determinato il rilascio più rapido di insulina e la più alta efficienza di assorbimento cellulare. Questo lavoro dimostra che l'essiccazione a spruzzo può disidratare le nanoparticelle di insulina senza la necessità di crioprotettori rispetto ai metodi di liofilizzazione convenzionali, creando una maggiore capacità di carico, minori requisiti di additivi e costi operativi significativamente vantaggiosi.
Dalla sua scoperta nel 19221,2,3, l'insulina e i suoi preparati farmaceutici hanno salvato la vita di pazienti affetti da diabete di tipo 1 (T1DM) e diabete di tipo 2 (T1DM). Tuttavia, a causa delle sue proprietà di proteina ad alto peso molecolare, l'insulina si aggrega facilmente, viene degradata dagli enzimi proteolitici ed eliminata per effetto di primo passaggio. Le persone a cui viene diagnosticato il diabete di tipo 1 necessitano di iniezioni di insulina per tutta la vita. Anche molti pazienti inizialmente diagnosticati con diabete di tipo 2 necessitano di iniezioni di insulina a lungo termine. Le iniezioni giornaliere di insulina rappresentano una grave fonte di dolore e disagio quotidiano per queste persone, con effetti negativi sulla salute mentale. Di conseguenza, altre forme di somministrazione di insulina che causano meno disagio, come la somministrazione orale di insulina, sono oggetto di studi approfonditi5, in quanto hanno il potenziale di migliorare la qualità della vita di circa 5 miliardi di persone con diabete in tutto il mondo.
La tecnologia delle nanoparticelle ha rappresentato un significativo passo avanti nei tentativi di somministrazione orale dell'insulina4,6,7. Questa tecnologia incapsula e protegge efficacemente l'insulina dalla degradazione, consentendo un rilascio mirato in siti specifici dell'organismo. Tuttavia, l'utilizzo di formulazioni a base di nanoparticelle presenta diverse limitazioni, principalmente dovute a problemi di stabilità delle sospensioni di particelle. Durante la conservazione può verificarsi un'aggregazione che riduce la biodisponibilità delle nanoparticelle caricate con insulina8. Inoltre, è necessario considerare anche la stabilità chimica della matrice polimerica delle nanoparticelle e dell'insulina per garantire la stabilità delle nanoparticelle di insulina (NP). Attualmente, la liofilizzazione rappresenta lo standard di riferimento per la creazione di NP stabili, prevenendo al contempo alterazioni indesiderate durante la conservazione9.
Tuttavia, la liofilizzazione richiede l'aggiunta di crioprotettori per impedire che la struttura sferica delle nanoparticelle venga alterata dallo stress meccanico dei cristalli di ghiaccio. Ciò riduce significativamente il carico di nanoparticelle di insulina dopo la liofilizzazione, poiché il crioprotettore occupa la maggior parte del peso. Pertanto, le nanoparticelle di insulina prodotte risultano spesso inadatte alla produzione di formulazioni in polvere secca, come compresse e film orali, a causa della necessità di grandi quantità di nanoparticelle secche per raggiungere la finestra terapeutica dell'insulina.
L'essiccazione a spruzzo è un processo industriale ben noto ed economico per la produzione di polveri secche da fasi liquide nell'industria farmaceutica10,11. Il controllo sul processo di formazione delle particelle consente un corretto incapsulamento di diversi composti bioattivi12,13. Inoltre, è diventata una tecnica efficace per la preparazione di proteine ​​incapsulate per somministrazione orale. Durante l'essiccazione a spruzzo, l'acqua evapora molto rapidamente, il che aiuta a mantenere bassa la temperatura del nucleo della particella11,14, consentendone l'applicazione per incapsulare componenti termosensibili. Prima dell'essiccazione a spruzzo, il materiale di rivestimento deve essere accuratamente omogeneizzato con la soluzione contenente gli ingredienti da incapsulare11,14. A differenza della liofilizzazione, l'omogeneizzazione prima dell'incapsulamento nell'essiccazione a spruzzo migliora l'efficienza di incapsulamento durante la disidratazione. Poiché il processo di incapsulamento mediante essiccazione a spruzzo non richiede crioprotettori, l'essiccazione a spruzzo può essere utilizzata per produrre nanoparticelle essiccate con un elevato contenuto di carico.
Questo studio descrive la produzione di nanoparticelle caricate con insulina mediante reticolazione di chitosano e tripolifosfato di sodio utilizzando un metodo di gelificazione ionica. La gelificazione ionica è un metodo di preparazione che consente la produzione di nanoparticelle attraverso interazioni elettrostatiche tra due o più specie ioniche in determinate condizioni. Sono state utilizzate sia la liofilizzazione che la nebulizzazione per disidratare le nanoparticelle reticolate ottimizzate di chitosano/tripolifosfato di sodio/insulina. Dopo la disidratazione, la loro morfologia è stata analizzata mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). La loro capacità di ricombinazione è stata valutata misurando la distribuzione dimensionale, la carica superficiale, l'indice di polidispersità (PDI), l'efficienza di incapsulamento e il contenuto di carico. La qualità delle nanoparticelle risciolte prodotte con diversi metodi di disidratazione è stata valutata anche confrontando la loro protezione dall'insulina, il comportamento di rilascio e l'efficacia di assorbimento cellulare.
Il pH della soluzione mista e il rapporto tra chitosano e insulina sono due fattori chiave che influenzano la dimensione delle particelle e l'efficienza di incapsulamento (EE) delle NP finali, poiché influenzano direttamente il processo di gelificazione ionotropica. È stato dimostrato che il pH della soluzione mista è altamente correlato con la dimensione delle particelle e l'efficienza di incapsulamento (Fig. 1a). Come mostrato in Fig. 1a, all'aumentare del pH da 4,0 a 6,0, la dimensione media delle particelle (nm) è diminuita e l'EE è aumentata significativamente, mentre quando il pH è aumentato a 6,5, la dimensione media delle particelle ha iniziato ad aumentare e l'EE è rimasta invariata. All'aumentare del rapporto tra chitosano e insulina, aumenta anche la dimensione media delle particelle. Inoltre, non è stata osservata alcuna variazione nell'EE quando le nanoparticelle sono state preparate con un rapporto di massa chitosano/insulina superiore a 2,5:1 (p/p) (Fig. 1b). Pertanto, le condizioni di preparazione ottimali in questo studio (pH 6,0, rapporto di massa chitosano/insulina di 2,5:1) sono state utilizzato per preparare nanoparticelle caricate con insulina per ulteriori studi. In queste condizioni di preparazione, la dimensione media delle particelle di nanoparticelle di insulina è stata ottimizzata a 318 nm (Fig. 1c), il PDI era 0,18, l'efficienza di incorporazione era 99,4%, il potenziale zeta era 9,8 mV e il carico di insulina era 25,01% (m/m). In base ai risultati della microscopia elettronica a trasmissione (TEM), le nanoparticelle ottimizzate erano approssimativamente sferiche e discrete con dimensioni relativamente uniformi (Fig. 1d).
Ottimizzazione dei parametri delle nanoparticelle di insulina: (a) effetto del pH sul diametro medio e sull'efficienza di incapsulamento (EE) delle nanoparticelle di insulina (preparate con un rapporto di massa di chitosano e insulina di 5:1); (b) influenza del rapporto di massa di chitosano e insulina sul diametro medio e sull'efficienza di incapsulamento (EE) delle NP di insulina (preparate a pH 6); (c) distribuzione delle dimensioni delle particelle delle nanoparticelle di insulina ottimizzate; (d) micrografia TEM delle NP di insulina ottimizzate.
È noto che il chitosano è un polielettrolita debole con un pKa di 6,5. È caricato positivamente in ambiente acido perché il suo principale gruppo amminico è protonato dagli ioni idrogeno15. Pertanto, viene spesso utilizzato come vettore per incapsulare macromolecole caricate negativamente. In questo studio, il chitosano è stato utilizzato per incapsulare l'insulina con un punto isoelettrico di 5,3. Poiché il chitosano viene utilizzato come materiale di rivestimento, con l'aumento della sua proporzione, lo spessore dello strato esterno delle nanoparticelle aumenta di conseguenza, determinando una maggiore dimensione media delle particelle. Inoltre, livelli più elevati di chitosano possono incapsulare più insulina. Nel nostro caso, l'efficienza di incapsulamento (EE) è risultata massima quando il rapporto tra chitosano e insulina ha raggiunto 2,5:1, e non si sono osservate variazioni significative dell'EE con l'ulteriore aumento del rapporto.
Oltre al rapporto tra chitosano e insulina, anche il pH ha svolto un ruolo cruciale nella preparazione delle NP. Gan et al. 17 hanno studiato l'effetto del pH sulla dimensione delle particelle di nanoparticelle di chitosano. Hanno riscontrato una diminuzione continua della dimensione delle particelle fino a quando il pH ha raggiunto 6,0, e un aumento significativo della dimensione delle particelle è stato osservato a pH > 6,0, il che è coerente con le nostre osservazioni. Questo fenomeno è dovuto al fatto che con l'aumento del pH, la molecola di insulina acquisisce una carica superficiale negativa, favorendo così le interazioni elettrostatiche con il complesso chitosano/tripolifosfato di sodio (TPP), con conseguente riduzione della dimensione delle particelle e aumento dell'EE. Tuttavia, quando il pH è stato regolato a 6,5, i gruppi amminici sul chitosano sono stati deprotonati, con conseguente ripiegamento del chitosano. Pertanto, un pH elevato comporta una minore esposizione degli ioni amminici al TPP e all'insulina, con conseguente minore reticolazione, maggiore dimensione media finale delle particelle e minore EE.
L'analisi delle proprietà morfologiche delle nanoparticelle liofilizzate e liofilizzate può guidare la selezione delle migliori tecniche di disidratazione e formazione della polvere. Il metodo preferito dovrebbe garantire la stabilità del farmaco, una forma uniforme delle particelle, un elevato carico di farmaco e una buona solubilità nella soluzione originale. In questo studio, per confrontare meglio le due tecniche, sono state utilizzate nanoparticelle di insulina con o senza l'1% di mannitolo durante la disidratazione. Il mannitolo è utilizzato come agente di carica o crioprotettore in varie formulazioni di polvere secca per la liofilizzazione e la liofilizzazione. Per le nanoparticelle di insulina liofilizzate senza mannitolo, come mostrato nella Figura 2a, è stata osservata una struttura di polvere altamente porosa con superfici ampie, irregolari e ruvide al microscopio elettronico a scansione (SEM). Poche particelle discrete sono state rilevate nella polvere dopo la disidratazione (Fig. 2e). Questi risultati hanno indicato che la maggior parte delle nanoparticelle si è decomposta durante la liofilizzazione senza alcun crioprotettore. Per le nanoparticelle di insulina liofilizzate e liofilizzate contenenti l'1% di mannitolo, sferiche Sono state osservate nanoparticelle con superfici lisce (Fig. 2b,d,f,h). Le nanoparticelle di insulina essiccate a spruzzo senza mannitolo sono rimaste sferiche ma rugose in superficie (Fig. 2c). Le superfici sferiche e rugose sono ulteriormente discusse nei test di rilascio e assorbimento cellulare riportati di seguito. In base all'aspetto visibile delle NP essiccate, sia le NP essiccate a spruzzo senza mannitolo che le NP liofilizzate e essiccate a spruzzo con mannitolo hanno prodotto polveri fini di NP (Fig. 2f,g,h). Maggiore è l'area superficiale tra le superfici delle particelle, maggiore è la solubilità e quindi maggiore è la velocità di rilascio.
Morfologia di diverse nanoparticelle di insulina disidratate: (a) Immagine SEM di nanoparticelle di insulina liofilizzate senza mannitolo; (b) Immagine SEM di nanoparticelle di insulina liofilizzate con mannitolo; (c) Immagine SEM di nanoparticelle di insulina liofilizzate senza mannitolo; (d) Immagine SEM di nanoparticelle di insulina liofilizzate con mannitolo; (e) Immagine di polvere di nanoparticelle di insulina liofilizzate senza mannitolo; (f) Immagine di nanoparticelle di insulina liofilizzate con mannitolo; (g) Immagine di polvere di nanoparticelle di insulina liofilizzate senza mannitolo; (h) Immagine di polvere di nanoparticelle di insulina liofilizzate con mannitolo.
Durante la liofilizzazione, il mannitolo agisce come crioprotettore, mantenendo le nanoparticelle (NP) in forma amorfa e prevenendo danni da cristalli di ghiaccio19. Al contrario, durante l'essiccazione a spruzzo non è previsto alcun passaggio di congelamento. Pertanto, il mannitolo non è necessario in questo metodo. Infatti, le nanoparticelle essiccate a spruzzo senza mannitolo hanno prodotto nanoparticelle più fini, come precedentemente descritto. Tuttavia, il mannitolo può comunque agire come riempitivo nel processo di essiccazione a spruzzo per conferire alle nanoparticelle una struttura più sferica20 (Fig. 2d), che contribuisce a ottenere un comportamento di rilascio uniforme di tali nanoparticelle incapsulate. Inoltre, è evidente che alcune particelle di grandi dimensioni possono essere rilevate sia nelle nanoparticelle di insulina liofilizzate che in quelle essiccate a spruzzo contenenti mannitolo (Fig. 2b,d), il che potrebbe essere dovuto all'accumulo di mannitolo nel nucleo della particella insieme all'insulina incapsulata. Strato di chitosano. Vale la pena notare che in questo studio, per garantire che la struttura sferica rimanga intatta dopo la disidratazione, il rapporto tra mannitolo e chitosano è mantenuto a 5:1, in modo che una grande quantità di riempitivo possa anche aumentare la dimensione delle particelle delle NP essiccate.
La spettroscopia a infrarossi a trasformata di Fourier con riflessione totale attenuata (FTIR-ATR) ha caratterizzato la miscela fisica di insulina libera, chitosano, chitosano, TPP e insulina. Tutte le NP disidratate sono state caratterizzate utilizzando la spettroscopia FTIR-ATR. In particolare, sono state osservate intensità di banda di 1641, 1543 e 1412 cm-1 nelle NP incapsulate liofilizzate con mannitolo e nelle NP essiccate a spruzzo con e senza mannitolo (Fig. 3). Come precedentemente riportato, questi aumenti di forza sono stati associati al cross-linking tra chitosano, TPP e insulina. L'indagine sull'interazione tra chitosano e insulina ha mostrato che negli spettri FTIR delle nanoparticelle di chitosano caricate con insulina, la banda del chitosano si sovrapponeva a quella dell'insulina, aumentando l'intensità del carbonile (1641 cm-1) e della cintura amminica (1543 cm-1). I gruppi tripolifosfato del TPP sono legati ai gruppi ammonio in chitosano, che forma una banda a 1412 cm-1.
Spettri FTIR-ATR di insulina libera, chitosano, miscele fisiche di chitosano/TPP/insulina e nanoparticelle disidratate con diversi metodi.
Inoltre, questi risultati sono coerenti con quelli mostrati in SEM, che hanno mostrato che le NP incapsulate sono rimaste intatte sia quando spruzzate che liofilizzate con mannitolo, ma in assenza di mannitolo, solo la liofilizzazione ha prodotto particelle incapsulate. Al contrario, i risultati spettrali FTIR-ATR delle NP liofilizzate senza mannitolo erano molto simili alla miscela fisica di chitosano, TPP e insulina. Questo risultato indica che i legami incrociati tra chitosano, TPP e insulina non sono più presenti nelle NP liofilizzate senza mannitolo. La struttura delle NP è stata distrutta durante la liofilizzazione senza crioprotettore, come si può vedere nei risultati SEM (Fig. 2a). Sulla base della morfologia e dei risultati FTIR delle NP di insulina disidratate, solo le NP liofilizzate, spruzzate e prive di mannitolo sono state utilizzate per gli esperimenti di ricostituzione e le NP prive di mannitolo a causa della Decomposizione delle nanoparticelle prive di mannitolo durante la disidratazione. Discutere.
La disidratazione viene utilizzata per la conservazione a lungo termine e la rielaborazione in altre formulazioni. La capacità delle nanoparticelle secche di ricostituirsi dopo la conservazione è fondamentale per il loro utilizzo in diverse formulazioni come compresse e film. Abbiamo notato che la dimensione media delle particelle delle nanoparticelle di insulina liofilizzate in assenza di mannitolo è aumentata solo leggermente dopo la ricostituzione. D'altra parte, la dimensione delle particelle delle nanoparticelle di insulina liofilizzate e liofilizzate con mannitolo è aumentata significativamente (Tabella 1). PDI ed EE non sono cambiati significativamente (p > 0,05) dopo la ricombinazione di tutte le nanoparticelle in questo studio (Tabella 1). Questo risultato indica che la maggior parte delle particelle è rimasta intatta dopo la ridissoluzione. Tuttavia, l'aggiunta di mannitolo ha comportato una notevole riduzione del carico di insulina delle nanoparticelle di mannitolo liofilizzate e liofilizzate (Tabella 1). Al contrario, il contenuto di insulina delle nanoparticelle liofilizzate senza mannitolo è rimasto lo stesso di prima (Tabella 1).
È noto che il carico di nanoparticelle è fondamentale quando vengono utilizzate per la somministrazione di farmaci. Per le NP con basso carico, sono necessarie quantità molto elevate di materiale per raggiungere la soglia terapeutica. Tuttavia, l'elevata viscosità di tali alte concentrazioni di NP comporta inconvenienti e difficoltà rispettivamente nella somministrazione orale e nelle formulazioni iniettabili 22. Inoltre, le NP di insulina possono essere utilizzate anche per produrre compresse e biofilm viscosi23, 24, il che richiede l'uso di grandi quantità di NP a bassi livelli di carico, con conseguente formazione di compresse di grandi dimensioni e biofilm spessi non adatti alle applicazioni orali. Pertanto, le NP disidratate con un elevato carico di insulina sono altamente desiderabili. I nostri risultati suggeriscono che l'elevato carico di insulina delle NP liofilizzate senza mannitolo può offrire molti vantaggi interessanti per questi metodi di somministrazione alternativi.
Tutte le nanoparticelle disidratate sono state conservate in frigorifero per tre mesi. I risultati SEM hanno mostrato che la morfologia di tutte le nanoparticelle disidratate non è cambiata in modo significativo durante i tre mesi di conservazione (Fig. 4). Dopo la ricostituzione in acqua, tutte le nanoparticelle hanno mostrato una leggera diminuzione dell'EE e hanno rilasciato una piccola quantità (~5%) di insulina durante il periodo di conservazione di tre mesi (Tabella 2). Tuttavia, la dimensione media delle particelle di tutte le nanoparticelle è aumentata. La dimensione delle particelle delle nanoparticelle liofilizzate senza mannitolo è aumentata a 525 nm, mentre quella delle nanoparticelle liofilizzate e liofilizzate con mannitolo è aumentata rispettivamente a 872 e 921 nm (Tabella 2).
Morfologia di diverse nanoparticelle di insulina disidratate conservate per tre mesi: (a) Immagine SEM di nanoparticelle di insulina liofilizzate con mannitolo; (b) Immagine SEM di nanoparticelle di insulina liofilizzate senza mannitolo; (c) Immagini SEM di nanoparticelle di insulina liofilizzate senza mannitolo.
Inoltre, sono stati osservati precipitati nelle nanoparticelle di insulina ricostituite, essiccate a spruzzo con mannitolo e liofilizzate (Fig. S2). Ciò potrebbe essere causato da particelle di grandi dimensioni che non si disperdono correttamente nell'acqua. Tutti i risultati sopra riportati dimostrano che la tecnica di essiccazione a spruzzo può proteggere le nanoparticelle di insulina dalla disidratazione e che è possibile ottenere elevati carichi di nanoparticelle di insulina senza l'utilizzo di riempitivi o crioprotettori.
La ritenzione di insulina è stata testata in un mezzo a pH = 2,5 con pepsina, tripsina e α-chimotripsina per dimostrare la capacità protettiva delle NP contro la digestione enzimatica dopo la disidratazione. La ritenzione di insulina delle NP disidratate è stata confrontata con quella delle NP appena preparate e l'insulina libera è stata utilizzata come controllo negativo. In questo studio, l'insulina libera ha mostrato una rapida eliminazione dell'insulina entro 4 ore in tutti e tre i trattamenti enzimatici (Fig. 5a-c). Al contrario, il test di eliminazione dell'insulina delle NP liofilizzate con mannitolo e delle NP essiccate a spruzzo con o senza mannitolo ha mostrato una protezione significativamente maggiore di queste NP contro la digestione enzimatica, che era simile a quella delle NP di insulina appena preparate (figura 1).5a-c). Con l'aiuto delle nanoparticelle in pepsina, tripsina e α-chimotripsina, più del 50%, 60% e 75% dell'insulina potrebbe essere protetto entro 4 ore, rispettivamente. (Fig. 5a–c). Questa capacità insulino-protettiva può aumentare la probabilità di un maggiore assorbimento di insulina nel flusso sanguigno25. Questi risultati suggeriscono che l'essiccazione a spruzzo con o senza mannitolo e la liofilizzazione con mannitolo possono preservare la capacità insulino-protettiva delle NP dopo la disidratazione.
Comportamento di protezione e rilascio delle nanoparticelle di insulina disidratate: (a) protezione dell'insulina in soluzione di pepsina; (b) protezione dell'insulina in soluzione di tripsina; (c) protezione dell'insulina da parte di una soluzione di α-chimotripsina; (d) Comportamento di rilascio delle nanoparticelle disidratate in soluzione a pH = 2,5; (e) comportamento di rilascio delle nanoparticelle disidratate in soluzione a pH = 6,6; (f) comportamento di rilascio delle nanoparticelle disidratate in soluzione a pH = 7,0.
Nanoparticelle di insulina essiccate, preparate e ricostituite di recente, sono state incubate in vari tamponi (pH = 2,5, 6,6, 7,0) a 37 °C, simulando l'ambiente di pH dello stomaco, del duodeno e della parte superiore dell'intestino tenue, per esaminare l'effetto dell'insulina sulla resistenza all'insulina. Comportamento di rilascio in diversi ambienti. Frammento del tratto gastrointestinale. A pH = 2,5, le nanoparticelle caricate con insulina e le nanoparticelle di insulina secca risciolte hanno mostrato un rilascio iniziale rapido entro la prima ora, seguito da un rilascio lento nelle successive 5 ore (Fig. 5d). Questo rapido rilascio iniziale è molto probabilmente il risultato del rapido desorbimento superficiale delle molecole proteiche che non sono completamente immobilizzate nella struttura interna della particella. A pH = 6,5, le nanoparticelle caricate con insulina e le nanoparticelle di insulina secca ricostituite hanno mostrato un rilascio graduale e lento nell'arco di 6 ore, poiché il pH della soluzione di prova era simile a quello della soluzione preparata con le nanoparticelle (Fig. 5e). A pH = 7, le nanoparticelle erano instabili e si sono decomposte quasi completamente entro le prime due ore (Fig. 5f). Questo perché la deprotonazione del chitosano si verifica a pH più elevato, il che si traduce in una rete polimerica meno compatta e in un rilascio dell'insulina caricata.
Inoltre, le nanoparticelle di insulina essiccate a spruzzo senza mannitolo hanno mostrato un profilo di rilascio più rapido rispetto alle altre nanoparticelle disidratate (Fig. 5d–f). Come precedentemente descritto, le nanoparticelle di insulina ricostituite essiccate senza mannitolo hanno mostrato la dimensione delle particelle più piccola. Le particelle piccole forniscono una superficie maggiore, quindi la maggior parte del farmaco rilevante sarà sulla superficie della particella o vicino ad essa, con conseguente rapido rilascio del farmaco26.
La citotossicità delle NP è stata studiata mediante il test MTT. Come mostrato nella Figura S4, tutte le NP disidratate non hanno mostrato effetti significativi sulla vitalità cellulare a concentrazioni comprese tra 50 e 500 μg/ml, suggerendo che tutte le NP disidratate possono essere utilizzate in sicurezza per raggiungere la finestra terapeutica.
Il fegato è l'organo principale attraverso il quale l'insulina esercita le sue funzioni fisiologiche. Le cellule HepG2 sono una linea cellulare di epatoma umano comunemente utilizzata come modello di assorbimento epatocitario in vitro. In questo studio, le cellule HepG2 sono state utilizzate per valutare l'assorbimento cellulare di NP disidratate mediante liofilizzazione e asciugatura a spruzzo. L'assorbimento cellulare è stato valutato mediante scansione laser confocale utilizzando la citometria a flusso e la visione dopo diverse ore di incubazione con insulina FITC libera a una concentrazione di 25 μg/mL, NP caricate con insulina FITC appena preparate e NP caricate con insulina FITC disidratate a concentrazioni di insulina uguali. Sono state eseguite osservazioni di microscopia quantitativa (CLSM). Le NP liofilizzate senza mannitolo sono state distrutte durante la disidratazione e non sono state valutate in questo test. Le intensità di fluorescenza intracellulare di NP caricate con insulina appena preparate, NP liofilizzate con mannitolo e NP asciutte a spruzzo con e senza mannitolo (Fig. 6a) erano rispettivamente 4,3, 2,6, 2,4 e 4,1 volte superiori a quelli liberi. Gruppo FITC-insulina, rispettivamente (Fig. 6b). Questi risultati suggeriscono che l'insulina incapsulata è più potente nell'assorbimento cellulare rispetto all'insulina libera, principalmente a causa delle dimensioni più piccole delle nanoparticelle caricate con insulina prodotte nello studio.
Assorbimento delle cellule HepG2 dopo 4 ore di incubazione con NP appena preparate e NP disidratate: (a) Distribuzione dell'assorbimento di FITC-insulina da parte delle cellule HepG2. (b) Media geometrica delle intensità di fluorescenza analizzate mediante citometria a flusso (n = 3), *P < 0,05 rispetto all'insulina libera.
Allo stesso modo, le immagini CLSM hanno mostrato che le intensità di fluorescenza FITC delle NP caricate con FITC-insulina appena preparate e delle NP liofilizzate caricate con FITC-insulina (senza mannitolo) erano molto più forti di quelle degli altri campioni (Fig. 6a). Inoltre, con l'aggiunta di mannitolo, la maggiore viscosità della soluzione ha aumentato la resistenza all'assorbimento cellulare, con conseguente diminuzione della proliferazione dell'insulina. Questi risultati suggeriscono che le NP liofilizzate senza mannitolo hanno mostrato la più alta efficienza di assorbimento cellulare perché la loro dimensione delle particelle era inferiore a quella delle NP liofilizzate dopo la ridissoluzione.
Il chitosano (peso molecolare medio 100 kDa, deacetilato al 75-85%) è stato acquistato da Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Il tripolifosfato di sodio (TPP) è stato acquistato da VWR (Radnor, Pennsylvania, USA). L'insulina umana ricombinante utilizzata in questo studio proveniva da Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). L'insulina umana marcata con isotiocianato di fluoresceina (FITC) e il 4′,6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). La linea cellulare HepG2 è stata ottenuta da ATCC (Manassas, Virginia, USA). Tutti gli altri reagenti erano di grado analitico o cromatografico.
Preparare una soluzione di CS da 1 mg/ml sciogliendola in acqua bidistillata (acqua DD) contenente acido acetico allo 0,1%. Preparare soluzioni da 1 mg/ml di TPP e insulina sciogliendole rispettivamente in acqua DD e acido acetico allo 0,1%. La pre-emulsione è stata preparata con un omogeneizzatore ad alta velocità Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Il processo di preparazione è il seguente: in primo luogo, 2 ml di soluzione di TPP vengono aggiunti a 4 ml di soluzione di insulina e la miscela viene agitata per 30 minuti e completamente miscelata. Quindi, la soluzione miscelata è stata aggiunta goccia a goccia alla soluzione di CS attraverso una siringa sotto agitazione ad alta velocità (10.000 giri/min). Le miscele sono state mantenute sotto agitazione ad alta velocità (15.000 giri/min) in un bagno di ghiaccio per 30 minuti e sono state regolate a un certo pH per ottenere NP di insulina reticolata. Per omogeneizzare ulteriormente e ridurre la dimensione delle particelle di insulina Le nanoparticelle sono state sottoposte a sonicazione per ulteriori 30 minuti in un bagno di ghiaccio utilizzando un sonicatore a sonda (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germania).
Le nanoparticelle di insulina (NP) sono state testate per il diametro medio Z, l'indice di polidispersione (PDI) e il potenziale zeta utilizzando misurazioni di diffusione dinamica della luce (DLS) con un Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) diluendole in acqua DD a 25 °C. La morfologia e la distribuzione delle dimensioni sono state caratterizzate da un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Giappone) e le immagini sono state successivamente analizzate utilizzando il software di imaging Hitachi (Hitachi, Tokyo, Giappone). Per valutare l'efficienza di incapsulamento (EE) e la capacità di carico (LC) delle NP di insulina, le NP sono state pipettate in provette di ultrafiltrazione con un cut-off di peso molecolare di 100 kDa e centrifugate a 500 xg per 30 min. L'insulina non incapsulata nel filtrato è stata quantificata utilizzando un sistema HPLC Agilent serie 1100 (Agilent, Santa Clara, California, USA) costituito da una pompa quaternaria, campionatore automatico, riscaldatore di colonna e rivelatore DAD. L'insulina è stata analizzata mediante una colonna C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) e rilevata a 214 nm. La fase mobile era costituita da acetonitrile e acqua, contenente lo 0,1% di TFA, rapporti di gradiente da 10/90 a 100/0, e fatta scorrere per 10 minuti. La fase mobile è stata pompata a una velocità di flusso di 1,0 ml/min. La temperatura della colonna è stata impostata a 20 °C. Calcolare le percentuali di EE e LC utilizzando le equazioni (1) e (2).
Sono stati testati diversi rapporti CS/insulina, compresi tra 2,0 e 4,0, per ottimizzare la produzione di nanoparticelle di insulina. Durante la preparazione sono state aggiunte diverse quantità di soluzione di CS, mantenendo costante la miscela insulina/TPP. Le nanoparticelle di insulina sono state preparate nell'intervallo di pH da 4,0 a 6,5 ​​controllando attentamente il pH della miscela dopo l'aggiunta di tutte le soluzioni (insulina, TPP e CS). L'efficienza di incapsulamento (EE) e la dimensione delle nanoparticelle di insulina sono state valutate a diversi valori di pH e rapporti di massa CS/insulina per ottimizzare la formazione delle nanoparticelle di insulina.
Le nanoparticelle di insulina ottimizzate sono state posizionate sul contenitore di alluminio e coperte con carta assorbente fissata con del nastro adesivo. Successivamente, i contenitori avvitati sono stati inseriti in un liofilizzatore Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) dotato di un essiccatore a vassoio. La temperatura e la pressione del vuoto sono state impostate a -10 °C e 0,350 Torr per le prime 2 ore, e a 0 °C e 0,120 Torr per le restanti 22 ore delle 24 ore totali, al fine di ottenere nanoparticelle di insulina essiccate.
Per la produzione di insulina incapsulata è stato utilizzato il mini essiccatore a spruzzo Buchi B-290 (BÜCHI, Flawil, Svizzera). I parametri di essiccazione selezionati sono stati: temperatura 100 °C, flusso di alimentazione 3 L/min e flusso di gas 4 L/min.
Le nanoparticelle di insulina prima e dopo la disidratazione sono state caratterizzate mediante spettroscopia FTIR-ATR. Le nanoparticelle disidratate, così come l'insulina libera e il chitosano, sono state analizzate utilizzando uno spettrofotometro FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) dotato di un accessorio di campionamento ATR universale (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Le medie del segnale sono state ottenute da 16 scansioni a una risoluzione di 4 cm2 nell'intervallo di frequenza di 4000-600 cm2.
La morfologia delle nanoparticelle di insulina essiccate è stata valutata mediante immagini SEM di nanoparticelle di insulina liofilizzate e liofilizzate, acquisite con un microscopio elettronico a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) Helios NanoLab 650 (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). I ​​parametri principali utilizzati sono stati una tensione di 5 keV e una corrente di 30 mA.
Tutte le nanoparticelle di insulina disidratate sono state ridisciolte in acqua distillata. La dimensione delle particelle, l'indice di polidispersità (PDI), l'efficienza di incapsulamento (EE) e il contenuto di lipidi (LC) sono stati nuovamente analizzati utilizzando lo stesso metodo precedentemente descritto per valutarne la qualità dopo la disidratazione. La stabilità delle nanoparticelle di anidroinsulina è stata inoltre misurata testando le proprietà delle nanoparticelle dopo una conservazione prolungata. In questo studio, tutte le nanoparticelle, dopo la disidratazione, sono state conservate in frigorifero per tre mesi. Dopo tre mesi di conservazione, le nanoparticelle sono state analizzate per la dimensione morfologica delle particelle, il PDI, l'EE e il LC.
Sciogliere 5 mL di NP ricostituite in 45 mL contenenti fluido gastrico simulato (pH 1,2, contenente 1% di pepsina), fluido intestinale (pH 6,8, contenente 1% di tripsina) o soluzione di chimotripsina (100 μg/mL, in tampone fosfato, pH 7,8) per valutare l'efficacia dell'insulina nella protezione delle NP dopo la disidratazione. Sono state incubate a 37 °C con una velocità di agitazione di 100 rpm. Sono stati raccolti 500 μL di soluzione in diversi momenti e la concentrazione di insulina è stata determinata mediante HPLC.
Il comportamento di rilascio in vitro di NP di insulina appena preparate e disidratate è stato testato con il metodo della sacca di dialisi (cut-off del peso molecolare 100 kDa, Spectra Por Inc.). Le NP secche appena preparate e ricostituite sono state dializzate in fluidi a pH 2,5, pH 6,6 e pH 7,0 (soluzione salina tamponata con fosfato 0,1 M, PBS) per simulare l'ambiente di pH dello stomaco, del duodeno e della parte superiore dell'intestino tenue, rispettivamente. Tutti i campioni sono stati incubati a 37 °C con agitazione continua a 200 rpm. Aspirare il fluido al di fuori della sacca di dialisi da 5 mL ai seguenti tempi: 0,5, 1, 2, 3, 4 e 6 ore, e reintegrare immediatamente il volume con dializzato fresco. La contaminazione da insulina nel fluido è stata analizzata mediante HPLC e la velocità di rilascio dell'insulina dalle nanoparticelle è stata calcolata dal rapporto tra l'insulina libera rilasciata e l'insulina totale incapsulata nella nanoparticelle (Equazione 3).
Le cellule della linea cellulare di carcinoma epatocellulare umano HepG2 sono state coltivate in piastre di 60 mm di diametro utilizzando il terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contenente il 10% di siero fetale bovino, 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina29. Le colture sono state mantenute a 37 °C, 95% di umidità relativa e 5% di CO2. Per i test di assorbimento, le cellule HepG2 sono state seminate a una densità di 1 × 10⁵ cellule/ml su un sistema di vetrini a camera a 8 pozzetti Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher, NY, USA). Per i test di citotossicità, sono state seminate in piastre a 96 pozzetti (Corning, NY, USA) a una densità di 5 × 10⁴ cellule/ml.
Il test MTT è stato utilizzato per valutare la citotossicità delle nanoparticelle di insulina (NP) preparate di fresco e disidratate30. Le cellule HepG2 sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 5 × 10⁴ cellule/mL e coltivate per 7 giorni prima del test. Le NP di insulina sono state diluite a varie concentrazioni (da 50 a 500 μg/mL) nel terreno di coltura e quindi somministrate alle cellule. Dopo 24 ore di incubazione, le cellule sono state lavate 3 volte con PBS e incubate con terreno contenente 0,5 mg/ml di MTT per ulteriori 4 ore. La citotossicità è stata valutata misurando la riduzione enzimatica del tetrazolio MTT giallo a formazano viola a 570 nm utilizzando uno spettrofotometro con lettore di piastre Tecan Infinite M200 Pro (Tecan, Männedorf, Svizzera).
L'efficienza di assorbimento cellulare delle NP è stata testata mediante microscopia confocale a scansione laser e analisi citofluorimetrica. Ogni pozzetto del sistema di vetrini a camera Nunc Lab-Tek è stato trattato con FITC-insulina libera, NP caricate con FITC-insulina e 25 μg/mL di NP di FITC-insulina disidratate ricostituite alla stessa concentrazione e incubate per 4 ore. Le cellule sono state lavate 3 volte con PBS e fissate con paraformaldeide al 4%. I nuclei sono stati colorati con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). La localizzazione dell'insulina è stata osservata utilizzando un microscopio confocale a scansione laser/due fotoni Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Giappone). Per l'analisi citofluorimetrica, sono state utilizzate le stesse concentrazioni di 10 μg/mL di FITC-insulina libera, NP caricate con FITC-insulina e FITC-insulina disidratata risciolta. Le nanoparticelle (NP) sono state aggiunte a piastre a 96 pozzetti seminate con cellule HepG2 e incubate per 4 ore. Dopo 4 ore di incubazione, le cellule sono state rimosse e lavate 3 volte con FBS. 5 × 10⁴ cellule per campione sono state analizzate mediante un citometro a flusso BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Stati Uniti).
Tutti i valori sono espressi come media ± deviazione standard. I confronti tra tutti i gruppi sono stati valutati utilizzando l'ANOVA a una via o il test t di IBM SPSS Statistics 26 per Mac (IBM, Endicott, New York, USA) e un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Questo studio dimostra la flessibilità e la capacità dell'essiccazione a spruzzo di disidratare nanoparticelle di chitosano/TPP/insulina reticolate con una migliore ricostituzione rispetto ai metodi di liofilizzazione standard utilizzando agenti di carica o crioprotettori con una maggiore capacità e una maggiore capacità di carico. Le nanoparticelle di insulina ottimizzate hanno prodotto una dimensione media delle particelle di 318 nm e un'efficienza di incapsulamento del 99,4%. I risultati SEM e FTIR dopo la disidratazione hanno mostrato che la struttura sferica è stata mantenuta solo nelle NP essiccate a spruzzo con e senza mannitolo e liofilizzate con mannitolo, ma le NP liofilizzate senza mannitolo si sono decomposte durante la disidratazione. Nel test di capacità di ricostituzione, le nanoparticelle di insulina essiccate a spruzzo senza mannitolo hanno mostrato la dimensione media delle particelle più piccola e il carico più alto dopo la ricostituzione. I comportamenti di rilascio di tutte queste NP disidratate hanno mostrato che sono state rilasciate rapidamente in soluzioni di pH = 2,5 e pH = 7 e molto stabili in soluzione di pH = 6.5. Rispetto ad altre nanoparticelle disidratate ridisciolte, le nanoparticelle essiccate a spruzzo senza mannitolo hanno mostrato il rilascio più rapido. Questo risultato è coerente con quello osservato nel test di assorbimento cellulare, poiché le nanoparticelle essiccate a spruzzo in assenza di mannitolo hanno mantenuto quasi completamente l'efficienza di assorbimento cellulare delle nanoparticelle appena preparate. Questi risultati suggeriscono che le nanoparticelle di insulina secche preparate mediante essiccazione a spruzzo senza mannitolo sono le più adatte per l'ulteriore lavorazione in altre forme di dosaggio anidre, come compresse orali o film bioadesivi.
A causa di questioni relative alla proprietà intellettuale, i set di dati generati e/o analizzati durante il presente studio non sono disponibili pubblicamente, ma possono essere richiesti ai rispettivi autori previa motivazione.
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