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L'acido propionico (PPA) viene utilizzato per studiare il ruolo della disfunzione mitocondriale nei disturbi dello sviluppo neurologico, come il disturbo dello spettro autistico. È noto che il PPA altera la biogenesi, il metabolismo e il turnover mitocondriale. Tuttavia, gli effetti del PPA sulla dinamica, la fissione e la fusione mitocondriale rimangono problematici a causa della complessa natura temporale di questi meccanismi. In questo studio, utilizziamo tecniche di imaging quantitativo complementari per indagare come il PPA influisce sull'ultrastruttura, la morfologia e la dinamica mitocondriale nelle cellule SH-SY5Y, simili ai neuroni. Il PPA (5 mM) ha causato una diminuzione significativa dell'area mitocondriale (p < 0,01), del diametro e della circonferenza di Feret (p < 0,05) e dell'area 2 (p < 0,01). L'analisi del localizzatore di eventi mitocondriali ha mostrato un aumento significativo (p < 0,05) degli eventi di fissione e fusione, mantenendo così l'integrità della rete mitocondriale in condizioni di stress. Inoltre, l'espressione dell'mRNA di cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) e OPA1 (p < 0,05) è risultata significativamente ridotta. 01). Ciò illustra il rimodellamento della morfologia, della biogenesi e della dinamica mitocondriale per mantenere la funzione in condizioni di stress. I nostri dati forniscono nuove informazioni sugli effetti del PPA sulla dinamica mitocondriale e sottolineano l'utilità delle tecniche di imaging per studiare i complessi meccanismi regolatori coinvolti nelle risposte allo stress mitocondriale.
I mitocondri sono parte integrante di una varietà di funzioni cellulari che vanno oltre i loro ruoli tipici nella produzione di energia e nella biosintesi. Il metabolismo mitocondriale è un regolatore chiave della segnalazione del calcio, dell'omeostasi metabolica e redox, della segnalazione infiammatoria, delle modificazioni epigenetiche, della proliferazione cellulare, della differenziazione e della morte cellulare programmata1. In particolare, il metabolismo mitocondriale è fondamentale per lo sviluppo, la sopravvivenza e la funzione neuronale ed è ampiamente implicato in varie manifestazioni di neuropatologia2,3,4.
Nel corso dell'ultimo decennio, lo stato metabolico è emerso come un regolatore centrale della neurogenesi, della differenziazione, della maturazione e della plasticità5,6. Recentemente, la morfologia e la dinamica mitocondriale sono diventate componenti particolarmente importanti della mitosi, un processo dinamico che mantiene un pool di mitocondri sani all'interno delle cellule. La dinamica mitocondriale è regolata da complessi percorsi interdipendenti che vanno dalla biogenesi e bioenergetica mitocondriale alla fissione, fusione, trasporto e rimozione dei mitocondri7,8. L'interruzione di uno qualsiasi di questi meccanismi integrativi compromette il mantenimento di reti mitocondriali sane e ha profonde conseguenze funzionali per lo sviluppo neurologico9,10. Infatti, la disregolazione della dinamica mitocondriale è osservata in molti disturbi psichiatrici, neurodegenerativi e dello sviluppo neurologico, compresi i disturbi dello spettro autistico (ASD)11,12.
L'autismo (ASD) è un disturbo neuroevolutivo eterogeneo con una complessa architettura genetica ed epigenetica. L'ereditarietà dell'ASD è indiscussa, ma l'eziologia molecolare sottostante rimane poco chiara. Dati sempre più numerosi provenienti da modelli preclinici, studi clinici e set di dati molecolari multi-omici forniscono prove crescenti di disfunzione mitocondriale nell'ASD13,14. In precedenza, abbiamo eseguito uno screening della metilazione del DNA a livello genomico in una coorte di pazienti con ASD e identificato geni differenzialmente metilati raggruppati lungo le vie metaboliche mitocondriali15. Successivamente, abbiamo riportato una metilazione differenziale di regolatori centrali della biogenesi e della dinamica mitocondriale, associata a un aumento del numero di copie di mtDNA e a un profilo metabolico urinario alterato nell'ASD16. I nostri dati forniscono prove sempre più evidenti che la dinamica e l'omeostasi mitocondriale svolgono un ruolo centrale nella fisiopatologia dell'ASD. Pertanto, migliorare la comprensione meccanicistica della relazione tra dinamica, morfologia e funzione mitocondriale è un obiettivo chiave della ricerca in corso sulle malattie neurologiche caratterizzate da disfunzione mitocondriale secondaria.
Le tecniche molecolari vengono spesso utilizzate per studiare il ruolo di geni specifici nelle risposte allo stress mitocondriale. Tuttavia, questo approccio può essere limitato dalla natura multiforme e temporale dei meccanismi di controllo mitotico. Inoltre, l'espressione differenziale dei geni mitocondriali è un indicatore indiretto di cambiamenti funzionali, soprattutto perché in genere viene analizzato solo un numero limitato di geni. Pertanto, sono stati proposti metodi più diretti per studiare la funzione mitocondriale e la bioenergetica17. La morfologia mitocondriale è strettamente correlata alla dinamica mitocondriale. La forma, la connettività e la struttura dei mitocondri sono fondamentali per la produzione di energia e per la sopravvivenza dei mitocondri e della cellula5,18. Inoltre, le varie componenti della mitosi si concentrano sui cambiamenti nella morfologia mitocondriale, che possono fungere da utili indicatori di disfunzione mitocondriale e fornire una base per successivi studi meccanicistici.
La morfologia mitocondriale può essere osservata direttamente mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM), consentendo uno studio dettagliato dell'ultrastruttura cellulare. La TEM visualizza direttamente la morfologia, la forma e la struttura delle creste mitocondriali con la risoluzione dei singoli mitocondri, anziché basarsi esclusivamente sulla trascrizione genica, sull'espressione proteica o sui parametri funzionali mitocondriali nelle popolazioni cellulari17,19,20. Inoltre, la TEM facilita lo studio delle interazioni tra i mitocondri e altri organelli, come il reticolo endoplasmatico e gli autofagosomi, che svolgono un ruolo chiave nella funzione e nell'omeostasi mitocondriale21,22. Pertanto, la TEM rappresenta un buon punto di partenza per lo studio della disfunzione mitocondriale prima di concentrarsi su specifici percorsi o geni. Poiché la funzione mitocondriale sta diventando sempre più rilevante per la neuropatologia, è evidente la necessità di poter studiare direttamente e quantitativamente la morfologia e la dinamica mitocondriale in modelli neuronali in vitro.
In questo articolo, esaminiamo le dinamiche mitocondriali in un modello neuronale di disfunzione mitocondriale nel disturbo dello spettro autistico. Abbiamo precedentemente riportato una metilazione differenziale della propionil-CoA carbossilasi beta (PCCB) nell'ASD15, una subunità dell'enzima mitocondriale propionil-CoA carbossilasi PCC. È noto che la disregolazione della PCC causa l'accumulo tossico di derivati ​​del propionile, tra cui l'acido propionico (PPA)23,24,25. È stato dimostrato che il PPA altera il metabolismo neuronale e modifica il comportamento in vivo ed è un modello animale consolidato per lo studio dei meccanismi neuroevolutivi coinvolti nell'ASD26,27,28. Inoltre, è stato riportato che il PPA altera il potenziale di membrana mitocondriale, la biogenesi e la respirazione in vitro ed è stato ampiamente utilizzato per modellare la disfunzione mitocondriale nei neuroni29,30. Tuttavia, l'impatto della disfunzione mitocondriale indotta da PPA sulla morfologia e sulla dinamica mitocondriale rimane ancora poco chiaro.
Questo studio utilizza tecniche di imaging complementari per quantificare gli effetti del PPA sulla morfologia, la dinamica e la funzione mitocondriale nelle cellule SH-SY5Y. In primo luogo, abbiamo sviluppato un metodo TEM per visualizzare i cambiamenti nella morfologia e nell'ultrastruttura mitocondriale17,31,32. Data la natura dinamica dei mitocondri33, abbiamo anche utilizzato l'analisi MEL (Mitochondrial Event Localizer) per quantificare i cambiamenti nell'equilibrio tra eventi di fissione e fusione, numero e volume mitocondriali sotto stress da PPA. Infine, abbiamo esaminato se la morfologia e la dinamica mitocondriale siano associate a cambiamenti nell'espressione dei geni coinvolti nella biogenesi, nella fissione e nella fusione. Nel complesso, i nostri dati illustrano la difficoltà di chiarire la complessità dei meccanismi che regolano la dinamica mitocondriale. Sottolineiamo l'utilità del TEM nello studio della morfologia mitocondriale come endpoint convergente misurabile della mitosi nelle cellule SH-SY5Y. Inoltre, sottolineiamo che i dati TEM forniscono le informazioni più complete se combinati con tecniche di imaging in grado di catturare anche eventi dinamici in risposta allo stress metabolico. Un'ulteriore caratterizzazione dei meccanismi di regolazione molecolare che supportano la mitosi delle cellule neuronali potrebbe fornire importanti spunti di riflessione sulla componente mitocondriale delle malattie del sistema nervoso e neurodegenerative.
Per indurre stress mitocondriale, le cellule SH-SY5Y sono state trattate con PPA utilizzando propionato di sodio (NaP) a concentrazioni di 3 mM e 5 mM. Prima della microscopia elettronica a trasmissione (TEM), i campioni sono stati sottoposti a preparazione criogenica mediante congelamento ad alta pressione e congelamento (Fig. 1a). Abbiamo sviluppato una pipeline automatizzata per l'analisi delle immagini mitocondriali al fine di misurare otto parametri morfologici delle popolazioni mitocondriali su tre repliche biologiche. Abbiamo riscontrato che il trattamento con PPA ha modificato significativamente quattro parametri: area 2, area, perimetro e diametro di Feret (Fig. 1b-e). L'area 2 è diminuita significativamente con entrambi i trattamenti con PPA a 3 mM e 5 mM (rispettivamente p = 0,0183 e p = 0,002) (Fig. 1b), mentre l'area (p = 0,003), il perimetro (p = 0,0106) e il diametro di Feret sono diminuiti significativamente. Si è osservata una riduzione significativa (p = 0,0172) nel gruppo trattato con 5 mM rispetto al gruppo di controllo (Fig. 1c–e). Le riduzioni significative dell'area e della circonferenza hanno mostrato che le cellule trattate con 5 mM di PPA avevano mitocondri più piccoli e più arrotondati, e che questi mitocondri erano meno allungati rispetto a quelli delle cellule di controllo. Ciò è anche coerente con una diminuzione significativa del diametro di Feret, un parametro indipendente che indica una diminuzione della distanza massima tra i bordi delle particelle. Sono state osservate modifiche nell'ultrastruttura delle creste: le creste sono diventate meno pronunciate sotto l'influenza dello stress da PPA (Fig. 1a, pannello B). Tuttavia, non tutte le immagini riflettevano chiaramente l'ultrastruttura delle creste, quindi non è stata effettuata un'analisi quantitativa di queste modifiche. Questi dati TEM possono riflettere tre possibili scenari: (1) il PPA aumenta la fissione o inibisce la fusione, causando la riduzione delle dimensioni dei mitocondri esistenti; (2) la biogenesi potenziata crea mitocondri nuovi e più piccoli o (3) induce entrambi i meccanismi simultaneamente. Sebbene queste condizioni non possano essere distinte tramite TEM, cambiamenti morfologici significativi indicano cambiamenti nell'omeostasi e nella dinamica mitocondriale sotto stress PPA. Abbiamo successivamente esplorato parametri aggiuntivi per caratterizzare ulteriormente queste dinamiche e i potenziali meccanismi che le sottendono.
L'acido propionico (PPA) rimodella la morfologia mitocondriale. (a) Immagini rappresentative di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) che mostrano come le dimensioni dei mitocondri diminuiscano e questi diventino più piccoli e arrotondati con l'aumentare del trattamento con PPA; 0 mM (non trattato), 3 mM e 5 mM, rispettivamente. Le frecce rosse indicano i mitocondri. (b-e) Le cellule SH-SY5Y trattate con PPA per 24 ore sono state preparate per la TEM e i risultati sono stati analizzati utilizzando Fiji/ImageJ. Quattro degli otto parametri hanno mostrato differenze significative tra le cellule di controllo (non trattate, 0 mM PPA) e quelle trattate (3 mM e 5 mM PPA). (b) Regione 2, (c) Area, (d) Perimetro, (e) Diametro di Feret. L'analisi della varianza a una via (controllo vs. trattamento) e il test di confronto multiplo di Dunnett sono stati utilizzati per determinare le differenze significative (p < 0,05). I punti dati rappresentano il valore mitocondriale medio per ogni singola cellula e le barre di errore rappresentano la media ± SEM. I dati mostrati rappresentano n = 3, almeno 24 cellule per replica; sono state analizzate in totale 266 immagini; * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01.
Per caratterizzare ulteriormente la risposta delle dinamiche mitocondriali al PPA, abbiamo colorato i mitocondri con tetrametilrodamina etil estere (TMRE) e utilizzato la microscopia time-lapse e l'analisi MEL per localizzare e quantificare i mitocondri dopo 24 ore a 3 e 5 mM di PPA. Trattamento degli eventi di fissione e fusione. (Fig. 2a). Dopo l'analisi MEL, i mitocondri sono stati ulteriormente analizzati per quantificare il numero di strutture mitocondriali e il loro volume medio. Abbiamo osservato un piccolo ma significativo aumento del numero di eventi di fissione che si verificano a 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] rispetto alla fissione [5,6 ± 0,3 (p < 0,05) )] e fusione [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] e fusione [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] eventi sono stati significativamente aumentati a 5 mM rispetto al controllo (Fig. 3b). Il numero di mitocondri è aumentato significativamente sia a 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] che a 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), mentre il volume medio di ciascuna struttura mitocondriale è rimasto invariato (Fig. 3c). 3d). Nel complesso, ciò suggerisce che il rimodellamento della dinamica mitocondriale funga da risposta compensatoria che mantiene con successo l'integrità della rete mitocondriale. L'aumento del numero di eventi di fissione a 3 mM di PPA suggerisce che l'aumento del numero di mitocondri sia in parte dovuto alla fissione mitocondriale, ma dato che il volume mitocondriale medio rimane sostanzialmente invariato, la biogenesi non può essere esclusa come ulteriore risposta compensatoria. Tuttavia, questi dati sono coerenti con le strutture mitocondriali più piccole e rotonde osservate tramite TEM e dimostrano anche cambiamenti significativi nella dinamica mitocondriale indotti dal PPA.
L'acido propionico (PPA) induce un rimodellamento mitocondriale dinamico per mantenere l'integrità della rete. Le cellule SH-SY5Y sono state coltivate, trattate con 3 e 5 mM di PPA per 24 ore e colorate con TMRE e Hoechst 33342, seguite da analisi MEL. (a) Immagini rappresentative di microscopia time-lapse che mostrano proiezioni a colori e binarizzate di massima intensità al tempo 2 (t2) per ciascuna condizione. Le regioni selezionate indicate in ciascuna immagine binaria sono ingrandite e visualizzate in 3D in tre diversi intervalli di tempo (t1-t3) per illustrare la dinamica nel tempo; gli eventi di fusione sono evidenziati in verde; gli eventi di fissione sono evidenziati in verde. Visualizzati in rosso. (b) Numero medio di eventi dinamici per condizione. (c) Numero medio di strutture mitocondriali per cellula. (d) Volume medio (µm3) di ciascuna struttura mitocondriale per cellula. I dati mostrati sono rappresentativi di n = 15 cellule per gruppo di trattamento. Le barre di errore mostrate rappresentano la media ± SEM, la barra di scala = 10 μm, * p < 0,05.
L'acido propionico (PPA) causa la soppressione trascrizionale dei geni associati alla dinamica mitocondriale. Le cellule SH-SY5Y sono state trattate con 3 e 5 mM di PPA per 24 ore. La quantificazione relativa dei geni è stata eseguita mediante RT-qPCR e normalizzata rispetto a B2M. Geni della biogenesi mitocondriale: (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 e (d) NFE2L2. Geni della fusione e fissione mitocondriale: (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 e (i) DRP1. Le differenze significative (p < 0,05) sono state testate utilizzando l'ANOVA a una via (controllo vs. trattamento) e il test di confronto multiplo di Dunnett: * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01 e **** indica p < 0,0001. Le barre rappresentano l'espressione media ± SEM. I dati mostrati rappresentano n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) e n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) repliche biologiche.
I dati ottenuti dalle analisi TEM e MEL indicano che il PPA altera la morfologia e la dinamica mitocondriale. Tuttavia, queste tecniche di imaging non forniscono informazioni sui meccanismi sottostanti che guidano questi processi. Abbiamo quindi esaminato l'espressione dell'mRNA di nove regolatori chiave della dinamica, della biogenesi e della mitosi mitocondriale in risposta al trattamento con PPA. Abbiamo quantificato l'oncogene del mieloma cellulare (cMYC), il fattore respiratorio nucleare (NRF1), il fattore di trascrizione mitocondriale 1 (TFAM), il fattore di trascrizione simile a NFE2 BZIP (NFE2L2), la proteina simile alla gastrina 2 (STOML2), l'atrofia del nervo ottico 1 (OPA1), la mitofusina 1 (MFN1), la mitofusina 2 (MFN2) e la proteina correlata alla dinamina 1 (DRP1) dopo 24 ore di trattamento con 3 mM e 5 mM di PPA. Abbiamo osservato il trattamento con PPA a 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 e p < 0,0001, rispettivamente) e 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Fig. 3a–c). La diminuzione dell'espressione dell'mRNA era dose-dipendente: l'espressione di cMYC, NRF1 e TFAM è diminuita rispettivamente di 5,7, 2,6 e 1,9 volte a 3 mM e di 11,2, 3 e 2,2 volte a 5 mM. Al contrario, il gene centrale della biogenesi redox NFE2L2 non è stato alterato a nessuna concentrazione di PPA, sebbene sia stato osservato un simile andamento dose-dipendente di diminuzione dell'espressione (Fig. 3d).
Abbiamo anche esaminato l'espressione dei geni classici coinvolti nella regolazione della fissione e della fusione. Si ritiene che STOML2 sia coinvolto nella fusione, nella mitofagia e nella biogenesi, e la sua espressione è risultata significativamente ridotta (p < 0,0001) da 3 mM (variazione di 2,4 volte) e 5 mM (variazione di 2,8 volte) di PPA (Fig. 1). 3d). Allo stesso modo, l'espressione del gene di fusione OPA1 è risultata diminuita a 3 mM (variazione di 1,6 volte) e 5 mM (variazione di 1,9 volte) di PPA (rispettivamente p = 0,006 e p = 0,0024) (Fig. 3f). Tuttavia, non abbiamo riscontrato differenze significative nell'espressione dei geni di fusione MFN1, MFN2 o del gene di fissione DRP1 in condizioni di stress da PPA di 24 ore (Fig. 3g-i). Inoltre, abbiamo scoperto che i livelli di quattro proteine ​​di fusione e fissione (OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1) non sono cambiati nelle stesse condizioni (Fig. 4a-d). È importante notare che questi dati riflettono un singolo punto nel tempo e potrebbero non riflettere cambiamenti nell'espressione proteica o nei livelli di attività durante le prime fasi dello stress PPA. Tuttavia, le significative riduzioni nell'espressione di cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 e OPA1 indicano una significativa disregolazione trascrizionale del metabolismo, della biogenesi e della dinamica mitocondriale. Inoltre, questi dati evidenziano l'utilità delle tecniche di imaging per studiare direttamente i cambiamenti dello stato finale nella funzione mitocondriale.
I livelli proteici dei fattori di fusione e fissione non sono cambiati dopo il trattamento con acido propionico (PPA). Le cellule SH-SY5Y sono state trattate con 3 e 5 mM di PPA per 24 ore. I livelli proteici sono stati quantificati mediante analisi Western blot e i livelli di espressione sono stati normalizzati rispetto alla proteina totale. Sono mostrati l'espressione proteica media e i Western blot rappresentativi della proteina target e della proteina totale. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Le barre rappresentano la media ± SEM e i dati mostrati sono rappresentativi di n = 3 repliche biologiche. I confronti multipli (p < 0,05) sono stati eseguiti utilizzando l'analisi della varianza a una via e il test di Dunnett. Il gel e il blot originali sono mostrati nella Figura S1.
La disfunzione mitocondriale è associata a malattie multisistemiche che spaziano dalle malattie metaboliche, cardiovascolari e muscolari alle malattie neurologiche1,10. Molte malattie neurodegenerative sono associate a disfunzione mitocondriale, evidenziando l'importanza di questi organelli durante tutto l'arco della vita. Tra queste malattie si annoverano il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer e i disturbi dello spettro autistico (ASD)3,4,18. Tuttavia, l'accesso al tessuto cerebrale per studiare queste malattie è difficile, soprattutto a livello meccanicistico, rendendo i sistemi modello cellulari un'alternativa necessaria. In questo studio, utilizziamo un sistema modello cellulare con cellule SH-SY5Y trattate con PPA per riprodurre la disfunzione mitocondriale osservata nelle malattie neuronali, in particolare nei disturbi dello spettro autistico. L'utilizzo di questo modello PPA per studiare le dinamiche mitocondriali nei neuroni potrebbe fornire informazioni sull'eziologia degli ASD.
Abbiamo esplorato la possibilità di utilizzare la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per visualizzare i cambiamenti nella morfologia mitocondriale. È importante notare che la TEM deve essere utilizzata correttamente per massimizzarne l'efficacia. La preparazione di campioni criogenici consente una migliore conservazione delle strutture neuronali, fissando simultaneamente i componenti cellulari e riducendo la formazione di artefatti34. In linea con ciò, abbiamo osservato che le cellule SH-SY5Y, simili ai neuroni, presentavano organelli subcellulari intatti e mitocondri allungati (Fig. 1a). Questo evidenzia l'utilità delle tecniche di preparazione criogenica per lo studio della morfologia mitocondriale nei modelli di cellule neuronali. Sebbene le misurazioni quantitative siano fondamentali per un'analisi oggettiva dei dati TEM, non esiste ancora un consenso su quali parametri specifici debbano essere misurati per confermare i cambiamenti morfologici mitocondriali. Sulla base di un gran numero di studi che hanno esaminato quantitativamente la morfologia mitocondriale17,31,32, abbiamo sviluppato una pipeline automatizzata di analisi delle immagini mitocondriali che misura otto parametri morfologici, vale a dire: area, area2, rapporto d'aspetto, perimetro, circolarità, grado, diametro di Feret e rotondità.
Tra questi, il PPA ha ridotto significativamente l'area 2, l'area, il perimetro e il diametro di Feret (Fig. 1b-e). Ciò ha dimostrato che i mitocondri sono diventati più piccoli e più arrotondati, il che è coerente con studi precedenti che mostrano una diminuzione dell'area mitocondriale dopo 72 ore di stress mitocondriale indotto da PPA30. Queste caratteristiche morfologiche possono indicare la fissione mitocondriale, un processo necessario per sequestrare i componenti danneggiati dalla rete mitocondriale per promuovere la loro degradazione attraverso la mitofagia35,36,37. D'altra parte, la diminuzione della dimensione media dei mitocondri può essere associata a un aumento della biogenesi, che si traduce nella formazione di piccoli mitocondri nascenti. L'aumento della fissione o della biogenesi rappresenta una risposta compensatoria per mantenere la mitosi contro lo stress mitocondriale. Tuttavia, non si possono escludere una ridotta crescita mitocondriale, una fusione compromessa o altre condizioni.
Sebbene le immagini ad alta risoluzione create dalla TEM consentano la determinazione delle caratteristiche morfologiche a livello dei singoli mitocondri, questo metodo produce istantanee bidimensionali in un singolo momento. Per studiare le risposte dinamiche allo stress metabolico, abbiamo colorato i mitocondri con TMRE e utilizzato la microscopia time-lapse con analisi MEL, che consente la visualizzazione 3D ad alta produttività dei cambiamenti nella rete mitocondriale nel tempo33,38. Abbiamo osservato cambiamenti sottili ma significativi nella dinamica mitocondriale sotto stress da PPA (Fig. 2). A 3 mM, il numero di eventi di fissione è aumentato significativamente, mentre gli eventi di fusione sono rimasti gli stessi del controllo. Un aumento del numero di eventi sia di fissione che di fusione è stato osservato a 5 mM di PPA, ma questi cambiamenti erano approssimativamente proporzionali, suggerendo che la cinetica di fissione e fusione raggiunge l'equilibrio a concentrazioni più elevate (Fig. 2b). Il volume mitocondriale medio è rimasto invariato sia a 3 che a 5 mM di PPA, indicando che l'integrità della rete mitocondriale è stata preservata (Fig. 2d). Ciò riflette la capacità delle reti mitocondriali dinamiche di rispondere a un lieve stress metabolico per mantenere efficacemente l'omeostasi senza causare la frammentazione della rete. A 3 mM di PPA, l'aumento della fissione è sufficiente a promuovere la transizione verso un nuovo equilibrio, ma è necessario un rimodellamento cinetico più profondo in risposta allo stress indotto da concentrazioni più elevate di PPA.
Il numero di mitocondri è aumentato a entrambe le concentrazioni di stress PPA, ma il volume mitocondriale medio non è cambiato in modo significativo (Fig. 2c). Ciò potrebbe essere dovuto a un aumento della biogenesi o a un aumento della divisione; tuttavia, in assenza di una diminuzione significativa del volume mitocondriale medio, è più probabile che aumenti la biosintesi. Tuttavia, i dati nella Figura 2 supportano l'esistenza di due meccanismi compensatori: un aumento del numero di eventi di fissione, coerente con la regolazione positiva della fissione mitocondriale, e un aumento del numero di eventi, coerente con la biogenesi mitocondriale. In definitiva, la compensazione dinamica per uno stress lieve può consistere in processi simultanei che coinvolgono fissione, fusione, biogenesi e mitofagia. Sebbene autori precedenti abbiano dimostrato che il PPA potenzia la mitosi30,39 e la mitofagia29, noi forniamo prove di un rimodellamento delle dinamiche di fissione e fusione mitocondriale in risposta al PPA. Questi dati confermano le modificazioni morfologiche osservate tramite TEM e forniscono ulteriori informazioni sui meccanismi associati alla disfunzione mitocondriale indotta da PPA.
Poiché né l'analisi TEM né quella MEL hanno fornito prove dirette dei meccanismi di regolazione genica alla base delle modifiche morfologiche osservate, abbiamo esaminato l'espressione dell'RNA dei geni coinvolti nel metabolismo, nella biogenesi e nella dinamica mitocondriale. Il proto-oncogene cMYC è un fattore di trascrizione coinvolto nella regolazione dei mitocondri, della glicolisi e del metabolismo degli amminoacidi e degli acidi grassi40. Inoltre, è noto che cMYC regola l'espressione di quasi 600 geni mitocondriali coinvolti nella trascrizione, nella traduzione e nell'assemblaggio dei complessi mitocondriali, tra cui NRF1 e TFAM41. NRF1 e TFAM sono due regolatori centrali della mitosi, che agiscono a valle di PGC-1α per attivare la replicazione del mtDNA. Questa via è attivata dalla segnalazione di cAMP e AMPK ed è sensibile al dispendio energetico e allo stress metabolico. Abbiamo anche esaminato NFE2L2, un regolatore redox della biogenesi mitocondriale, per determinare se gli effetti del PPA potessero essere mediati dallo stress ossidativo.
Sebbene l'espressione di NFE2L2 sia rimasta invariata, abbiamo riscontrato una diminuzione dose-dipendente dell'espressione di cMYC, NRF1 e TFAM dopo 24 ore di trattamento con 3 mM e 5 mM di PPA (Fig. 3a-c). La downregulation dell'espressione di cMYC è stata precedentemente segnalata come risposta allo stress mitocondriale42 e, viceversa, la downregulation dell'espressione di cMYC può causare disfunzione mitocondriale rimodellando il metabolismo mitocondriale, la connettività di rete e la polarizzazione della membrana43. È interessante notare che cMYC è anche coinvolto nella regolazione della fissione e della fusione mitocondriale42,43 ed è noto per aumentare la fosforilazione di DRP1 e la localizzazione mitocondriale durante la divisione cellulare44, nonché per mediare il rimodellamento morfologico mitocondriale nelle cellule staminali neuronali45. Infatti, i fibroblasti con deficit di cMYC mostrano una riduzione delle dimensioni mitocondriali, coerente con i cambiamenti indotti dallo stress da PPA43. Questi dati illustrano una relazione interessante, ma ancora non chiara, tra cMYC e le dinamiche mitocondriali, fornendo un interessante bersaglio per futuri studi sul rimodellamento indotto dallo stress PPA.
La riduzione di NRF1 e TFAM è coerente con il ruolo di cMYC come importante attivatore trascrizionale. Questi dati sono anche in linea con studi precedenti su cellule di cancro del colon umano che hanno mostrato come il PPA riducesse l'espressione dell'mRNA di NRF1 a 22 ore, il che era associato a deplezione di ATP e aumento di ROS46. Questi autori hanno anche riportato che l'espressione di TFAM aumentava a 8,5 ore ma tornava ai livelli basali a 22 ore. Al contrario, Kim et al. (2019) hanno mostrato che l'espressione dell'mRNA di TFAM era significativamente diminuita dopo 4 ore di stress da PPA nelle cellule SH-SY5Y; tuttavia, dopo 72 ore, l'espressione della proteina TFAM era significativamente aumentata e il numero di copie di mtDNA era significativamente aumentato. Pertanto, la diminuzione del numero di geni della biogenesi mitocondriale che abbiamo osservato dopo 24 ore non esclude la possibilità che l'aumento del numero di mitocondri sia associato all'attivazione della biogenesi in momenti precedenti. Studi precedenti hanno dimostrato che l'acido propionico (PPA) aumenta significativamente l'espressione dell'mRNA e della proteina PGC-1α nelle cellule SH-SY5Y dopo 4 ore e 30 minuti, mentre l'acido propionico potenzia la biogenesi mitocondriale negli epatociti di vitello tramite PGC-1α dopo 12 ore e 39 minuti. È interessante notare che PGC-1α non è solo un regolatore trascrizionale diretto di NRF1 e TFAM, ma ha anche dimostrato di regolare l'attività di MFN2 e DRP1 attraverso la regolazione della fissione e della fusione mitocondriale47. Nel complesso, ciò evidenzia lo stretto legame tra i meccanismi che regolano le risposte compensatorie mitocondriali indotte dal PPA. Inoltre, i nostri dati riflettono una significativa disregolazione della regolazione trascrizionale della biogenesi e del metabolismo in condizioni di stress indotto dal PPA.
I geni STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1 sono tra i principali regolatori della fissione, fusione e dinamica mitocondriale37,48,49. Esistono molti altri geni coinvolti nella dinamica mitocondriale, tuttavia, STOML2, OPA1 e MFN2 sono stati precedentemente trovati metilati in modo differenziale nelle coorti ASD16 e diversi studi indipendenti hanno riportato cambiamenti in questi fattori di trascrizione in risposta allo stress mitocondriale50,51. 52. L'espressione sia di OPA1 che di STOML2 è stata significativamente ridotta dal trattamento con PPA a 3 mM e 5 mM (Fig. 3e, f). OPA1 è uno dei regolatori classici della fusione mitocondriale attraverso l'interazione diretta con MFN1 e 2 e svolge un ruolo nel rimodellamento delle creste e nella morfologia mitocondriale53. Il ruolo preciso di STOML2 nelle dinamiche mitocondriali rimane poco chiaro, ma le evidenze suggeriscono che svolga un ruolo nella fusione mitocondriale, nella biogenesi e nella mitofagia.
STOML2 è coinvolto nel mantenimento dell'accoppiamento respiratorio mitocondriale e nella formazione dei complessi della catena respiratoria54,55 e ha dimostrato di alterare profondamente le caratteristiche metaboliche delle cellule tumorali56. Studi hanno dimostrato che STOML2 promuove il potenziale di membrana mitocondriale e la biogenesi attraverso l'interazione con BAN e cardiolipina55,57,58. Inoltre, studi indipendenti hanno dimostrato che l'interazione tra STOML2 e PINK1 regola la mitofagia59,60. In particolare, è stato riportato che STOML2 interagisce direttamente con MFN2 e lo stabilizza, e svolge anche un ruolo importante nella stabilizzazione delle isoforme lunghe di OPA1 inibendo la proteasi responsabile della degradazione di OPA153,61,62. La riduzione dell'espressione di STOML2 osservata nelle reazioni PPA può rendere queste proteine ​​di fusione più suscettibili alla degradazione attraverso vie dipendenti dall'ubiquitina e dal proteasoma48. Sebbene il ruolo preciso di STOML2 e OPA1 nella risposta dinamica alla PPA non sia chiaro, la ridotta espressione di questi geni di fusione (Figura 3) può alterare l'equilibrio tra fissione e fusione e portare a una riduzione delle dimensioni mitocondriali (Figura 3). 1).
D'altra parte, l'espressione della proteina OPA1 è rimasta invariata dopo 24 ore, mentre i livelli di mRNA e proteina di MFN1, MFN2 o DRP1 non sono cambiati in modo significativo dopo il trattamento con PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Ciò potrebbe indicare che non vi sono cambiamenti nella regolazione di questi fattori coinvolti nella fusione e fissione mitocondriale. Tuttavia, è importante notare che ciascuno di questi quattro geni è anche regolato da modificazioni post-trascrizionali (PTM) che controllano l'attività proteica. OPA1 ha otto varianti di splicing alternative che vengono scisse proteoliticamente nei mitocondri per produrre due isoforme distinte⁶³. L'equilibrio tra le isoforme lunghe e corte determina in definitiva il ruolo di OPA1 nella fusione mitocondriale e nel mantenimento della rete mitocondriale⁶⁴. L'attività di DRP1 è regolata dalla fosforilazione della proteina chinasi II calcio/calmodulina-dipendente (CaMKII), mentre la degradazione di DRP1 è regolata dall'ubiquitinazione e dalla SUMOilazione65. Infine, sia DRP1 che MFN1/2 sono GTPasi, quindi l'attività può essere influenzata dalla velocità di produzione di GTP nei mitocondri66. Pertanto, sebbene l'espressione di queste proteine ​​rimanga costante, ciò potrebbe non riflettere un'attività o una localizzazione proteica invariate67,68. Infatti, i repertori proteici di PTM esistenti spesso fungono da prima linea di difesa responsabile della mediazione delle risposte allo stress acuto. In presenza di stress metabolico moderato nel nostro modello, è probabile che la PTM promuova una maggiore attività delle proteine ​​di fusione e fissione per ripristinare sufficientemente l'integrità mitocondriale senza richiedere un'ulteriore attivazione di questi geni a livello di mRNA o proteina.
Nel loro insieme, i dati sopra riportati evidenziano la complessa regolazione, dipendente dal tempo, della morfologia mitocondriale e le difficoltà nell'elucidare questi meccanismi. Per studiare l'espressione genica, è innanzitutto necessario identificare geni bersaglio specifici nel pathway. Tuttavia, i nostri dati mostrano che i geni nello stesso pathway non rispondono allo stesso modo allo stesso stress. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che geni diversi nello stesso pathway possono presentare profili di risposta temporale differenti30,46. Inoltre, esistono complessi meccanismi post-trascrizionali che interrompono la relazione tra trascrizione e funzione genica. Gli studi proteomici possono fornire informazioni sull'impatto delle modificazioni post-trascrizionali e sulla funzione proteica, ma presentano anche delle sfide, tra cui metodi a bassa produttività, elevati rapporti segnale/rumore e scarsa risoluzione.
In questo contesto, lo studio della morfologia mitocondriale mediante TEM e MEL ha un grande potenziale per affrontare questioni fondamentali sulla relazione tra dinamica e funzione mitocondriale e su come questa influenzi le malattie. Ancora più importante, la TEM fornisce un metodo diretto per misurare la morfologia mitocondriale come endpoint convergente della disfunzione e della dinamica mitocondriale51. Anche la MEL fornisce un metodo diretto per visualizzare gli eventi di fissione e fusione in un ambiente cellulare tridimensionale, consentendo la quantificazione del rimodellamento mitocondriale dinamico anche in assenza di cambiamenti nell'espressione genica33. Qui evidenziamo l'utilità delle tecniche di imaging mitocondriale nelle malattie mitocondriali secondarie. Queste malattie sono tipicamente caratterizzate da uno stress metabolico cronico lieve, caratterizzato da un sottile rimodellamento delle reti mitocondriali piuttosto che da un danno mitocondriale acuto. Tuttavia, la compensazione mitocondriale necessaria per mantenere la mitosi in condizioni di stress cronico ha profonde conseguenze funzionali. Nel contesto delle neuroscienze, una migliore comprensione di questi meccanismi compensatori potrebbe fornire informazioni importanti sulla neuropatologia pleiotropica associata alla disfunzione mitocondriale.
In definitiva, i nostri dati evidenziano l'utilità delle tecniche di imaging per comprendere le conseguenze funzionali delle complesse interazioni tra espressione genica, modificazioni proteiche e attività proteica che controllano le dinamiche mitocondriali neuronali. Abbiamo utilizzato il PPA per modellare la disfunzione mitocondriale in un modello di cellula neuronale al fine di ottenere informazioni sulla componente mitocondriale dell'ASD. Le cellule SH-SY5Y trattate con PPA hanno mostrato cambiamenti nella morfologia mitocondriale: i mitocondri sono diventati piccoli e rotondi e le creste erano scarsamente definite se osservate al TEM. L'analisi MEL mostra che questi cambiamenti si verificano contemporaneamente a un aumento degli eventi di fissione e fusione per mantenere la rete mitocondriale in risposta a un lieve stress metabolico. Inoltre, il PPA altera significativamente la regolazione trascrizionale del metabolismo e dell'omeostasi mitocondriale. Abbiamo identificato cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 e OPA1 come regolatori mitocondriali chiave alterati dallo stress indotto da PPA e che potrebbero svolgere un ruolo nella mediazione dei cambiamenti indotti da PPA nella morfologia e nella funzione mitocondriale. Sono necessari ulteriori studi per caratterizzare meglio i cambiamenti temporali indotti da PPA nell'espressione genica e nell'attività proteica, nella localizzazione e nelle modificazioni post-traduzionali. I nostri dati evidenziano la complessità e l'interdipendenza dei meccanismi regolatori che mediano la risposta allo stress mitocondriale e dimostrano l'utilità della microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e di altre tecniche di imaging per studi meccanicistici più mirati.
La linea cellulare SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) è stata acquistata da Sigma-Aldrich. Le cellule SH-SY5Y sono state coltivate in terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle's Medium/F-12 (DMEM/F-12) e L-glutammina (SC09411, ScienCell) in fiasche da 25 cm2 supplementate con il 20% di siero fetale bovino (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) e l'1% di penicillina-streptomicina (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) a 37 °C, 5% di CO2. Le cellule sono state subcoltivate fino all'80% di confluenza utilizzando tripsina-EDTA allo 0,05% (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugate a 300 g e piastrate a una densità di circa 7 × 10⁵ cellule/ml. Tutti gli esperimenti sono stati condotti su cellule SH-SY5Y indifferenziate tra il passaggio 19 e il 22. Il PPA è stato somministrato sotto forma di NaP. Sciogliere la polvere di NaP (CAS n. 137-40-6, formula chimica C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) in acqua MilliQ tiepida fino a una concentrazione di 1 M e conservare a 4 °C. Il giorno del trattamento, diluire questa soluzione con PPA 1 M fino a raggiungere concentrazioni di 3 mM e 5 mM di PPA in terreno di coltura privo di siero (DMEM/F-12 con L-glutammina). Le concentrazioni di trattamento per tutti gli esperimenti erano: nessun PPA (0 mM, controllo), 3 mM e 5 mM di PPA. Gli esperimenti sono stati condotti in almeno tre repliche biologiche.
Le cellule SH-SY5Y sono state seminate in fiasche da 25 cm5 a una densità di 5,5 × 105 cellule/ml e coltivate per 24 ore. Il trattamento con PPA è stato aggiunto alla fiasca prima delle 24 ore di incubazione. I pellet cellulari sono stati raccolti seguendo i normali protocolli di subcoltura di tessuti di mammifero (descritti in precedenza). Il pellet cellulare è stato risospeso in 100 µl di glutaraldeide al 2,5%, PBS 1× e conservato a 4 °C fino all'elaborazione. Le cellule SH-SY5Y sono state centrifugate brevemente per sedimentare le cellule e rimuovere la soluzione di glutaraldeide al 2,5%, PBS 1×. Il sedimento è stato risospeso in un gel di agarosio al 4% preparato in acqua distillata (il rapporto tra volume di agarosio e volume di sedimento è 1:1). I pezzi di agarosio sono stati posti su griglie su piastre piane e rivestiti con 1-esadecene prima del congelamento ad alta pressione. I campioni sono stati congelati in acetone secco al 100% a -90 °C per 24 ore. La temperatura è stata quindi portata a -80 °C ed è stata aggiunta una soluzione di tetrossido di osmio all'1% e glutaraldeide allo 0,1%. I campioni sono stati conservati a -80 °C per 24 ore. Dopodiché, la temperatura è stata gradualmente aumentata fino a raggiungere la temperatura ambiente nell'arco di diversi giorni: da -80 °C a -50 °C per 24 ore, a -30 °C per 24 ore, a -10 °C per 24 ore e infine a temperatura ambiente.
Dopo la preparazione criogenica, i campioni sono stati impregnati con resina e sono state realizzate sezioni ultrasottili (circa 100 nm) utilizzando un ultramicrotomo Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Le sezioni sono state colorate con acetato di uranile al 2% e citrato di piombo. I campioni sono stati osservati utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (precedentemente FEI), Eindhoven, Paesi Bassi) operante a 200 kV (trasmettitore Lab6) e una telecamera CCD Gatan (Gatan, Regno Unito) dotata di filtro energetico Tridiem.
In ogni replica tecnica, sono state acquisite almeno 24 immagini di singole cellule, per un totale di 266 immagini. Tutte le immagini sono state analizzate utilizzando la macro Region of Interest (ROI) e la macro Mitochondria. La macro mitochondria si basa su metodi pubblicati17,31,32 e consente l'elaborazione batch semiautomatica di immagini TEM in Fiji/ImageJ69. In breve: l'immagine viene invertita e sottoposta a sottrazione dello sfondo con algoritmo rolling ball (raggio di 60 pixel) e a un filtro passa-banda FFT (utilizzando rispettivamente limiti superiore e inferiore di 60 e 8 pixel) e a soppressione delle linee verticali con una tolleranza di orientamento del 5%. L'immagine elaborata viene automaticamente sogliata utilizzando un algoritmo di massima entropia e viene generata una maschera binaria. Sono state estratte le regioni dell'immagine associate alle ROI selezionate manualmente nelle immagini TEM grezze, caratterizzando i mitocondri ed escludendo la membrana plasmatica e altre regioni ad alto contrasto. Per ogni ROI estratta, sono state analizzate le particelle binarie di dimensioni superiori a 600 pixel e sono stati misurati l'area, il perimetro, gli assi maggiore e minore, il diametro di Feret, la rotondità e la circolarità delle particelle utilizzando le funzioni di misurazione integrate di Fiji/ImageJ. Seguendo Merrill, Flippo e Strack (2017), da questi dati sono stati calcolati l'area², il rapporto d'aspetto delle particelle (rapporto tra asse maggiore e minore) e il fattore di forma (FF), dove FF = perimetro²/4π x area. La definizione della formula parametrica è reperibile in Merrill, Flippo e Strack (2017). Le macro menzionate sono disponibili su GitHub (vedere Dichiarazione di disponibilità dei dati). In media, sono state analizzate circa 5.600 particelle per trattamento PPA, per un totale di circa 17.000 particelle (dati non mostrati).
Le cellule SH-SH5Y sono state poste in piastre di coltura a 8 camere (ThermoFisher, #155411) per consentire l'adesione durante la notte e quindi incubate con TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) e Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Le immagini sono state acquisite utilizzando laser a 405 nm e 561 nm in un ambiente di 10 minuti e le immagini grezze sono state acquisite come z-stack contenenti 10 micrografie con un passo az di 0,2 μm tra i fotogrammi dell'immagine in 12 punti temporali successivi. Le immagini sono state raccolte utilizzando una piattaforma di super-risoluzione Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania) utilizzando un obiettivo LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Le immagini sono state analizzate in ImageJ utilizzando una pipeline precedentemente descritta e il plugin ImageJ per misurare gli eventi di fusione e fissione, il numero medio di strutture mitocondriali e il volume mitocondriale medio per cellula33. Le macro MEL sono disponibili su GitHub (vedere la Dichiarazione di disponibilità dei dati).
Le cellule SH-SY5Y sono state coltivate in piastre a sei pozzetti a una densità di 0,3 × 10⁶ cellule/mL per 24 ore prima del trattamento. L'RNA è stato estratto utilizzando il protocollo Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) con lievi modifiche: aggiungere 300 μl di tampone di lisi dell'RNA a ciascun pozzetto prima della rimozione e lisare ciascun campione come passaggio finale con 30 μl di eluizione DNasi/RNasi. Tutti i campioni sono stati controllati per quantità e qualità utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis NanoDrop ND-1000. Le proteine ​​totali dai lisati cellulari sono state ottenute utilizzando 200 μl di tampone di lisi RIPA e la concentrazione proteica è stata quantificata utilizzando il saggio proteico di Bradford70.
La sintesi del cDNA è stata eseguita utilizzando il kit Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) secondo le istruzioni del produttore con alcune modifiche. Il cDNA è stato sintetizzato in reazioni da 20 μl utilizzando da 0,7 a 1 μg di RNA totale. I primer sono stati selezionati da articoli precedentemente pubblicati 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabella S1) e le sonde corrispondenti sono state progettate utilizzando lo strumento PrimerQuest di Integrated DNA Technologies. Tutti i geni di interesse sono stati normalizzati rispetto al gene nucleare B2M. L'espressione genica di STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC e OPA1 è stata misurata mediante RT-qPCR. Il master mix includeva la polimerasi LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 μM di primer forward e reverse, cDNA e acqua di grado PCR per ottenere un volume finale di 10 μL per ciascuna reazione. L'espressione dei geni di divisione e fissione (DRP1, MFN1/2) è stata misurata utilizzando saggi multiplex TaqMan. Il Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore con piccole modifiche. Il master mix per RT-qPCR multiplex include 1X di polimerasi LUNA Taq, 10 μM di primer forward e reverse, 10 μM di sonda, cDNA e acqua di grado PCR, risultando in un volume finale di 20 μL per ciascuna reazione. La RT-qPCR è stata eseguita utilizzando Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - numero di serie: R0618110). Le condizioni di ciclizzazione sono riportate nella Tabella S1. Tutti i campioni di cDNA sono stati amplificati in triplicato e una curva standard è stata generata utilizzando una serie di diluizioni a dieci volte. I valori anomali nei campioni in triplicato con deviazione standard della soglia del ciclo (Ct) >0,5 sono stati rimossi dall'analisi per garantire la riproducibilità dei dati30,72. L'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt79.
Campioni proteici (60 μg) sono stati miscelati con tampone di caricamento Laemmli in rapporto 2:1 e separati mediante elettroforesi su gel proteico incolore al 12% (Bio-Rad #1610184). Le proteine ​​sono state trasferite su una membrana di PVDF (polivinilidene fluoruro) (#170-84156, Bio-Rad) utilizzando il sistema Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). La membrana è stata bloccata e incubata con gli anticorpi primari appropriati (OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1) (diluiti 1:1000) per 48 ore, seguita da incubazione con anticorpi secondari (1:10.000) per 1 ora. Le membrane sono state quindi visualizzate utilizzando il substrato Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) e le immagini sono state registrate con un sistema Bio-Rad ChemiDoc MP. Per l'analisi Western blot è stata utilizzata la versione 6.1 di ImageLab. Il gel e il blot originali sono mostrati nella Figura S1. Le informazioni sugli anticorpi sono fornite nella Tabella S2.
I set di dati sono presentati come media e errore standard della media (SEM) di almeno tre campioni indipendenti. I set di dati sono stati testati per la normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk (salvo diversa indicazione) prima di assumere una distribuzione gaussiana e deviazioni standard uguali e procedere con le analisi. Oltre all'analisi del set di dati utilizzando il test MEL LSD di Fisher (p < 0,05), ANOVA a una via (media del trattamento vs. controllo) e il test di confronto multiplo di Dunnett per determinare la significatività (p < 0,05). I valori p significativi sono mostrati nel grafico come *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Tutte le analisi statistiche e i grafici sono stati eseguiti e generati utilizzando GraphPad Prism 9.4.0.
Le macro Fiji/ImageJ per l'analisi di immagini TEM sono disponibili pubblicamente su GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. La macro Mitochondrial Event Locator (MEL) è disponibile pubblicamente su GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
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