Indirizzo attuale: Colonia 50931, Germania, Centro di eccellenza di ricerca di Colonia sulla risposta allo stress cellulare nelle malattie legate all'invecchiamento (CECAD).
La neurodegenerazione causata dalle malattie mitocondriali è considerata irreversibile a causa della limitata plasticità metabolica dei neuroni, ma l'effetto della disfunzione mitocondriale sull'autonomia cellulare del metabolismo neuronale nell'organismo è ancora poco compreso. In questo studio, presentiamo il proteoma specifico delle cellule dei neuroni di Purkinje con deficit progressivo di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) causato da un'alterazione della dinamica di fusione mitocondriale. Abbiamo scoperto che la disfunzione mitocondriale innesca un profondo cambiamento nel campo della proteomica, portando infine all'attivazione sequenziale di precisi programmi metabolici prima della morte cellulare. Inaspettatamente, abbiamo determinato un'evidente induzione della piruvato carbossilasi (PCx) e di altre perossidasi coinvolte nel ripristino degli intermedi del ciclo di Krebs. L'inibizione della PCx ha esacerbato lo stress ossidativo e la neurodegenerazione, indicando che l'aterosclerosi ha un effetto protettivo nei neuroni privi di OXPHOS. Il ripristino della fusione mitocondriale nei neuroni in fase di degenerazione terminale inverte completamente queste caratteristiche metaboliche, prevenendo così la morte cellulare. I nostri risultati identificano percorsi finora sconosciuti che conferiscono resistenza alla disfunzione mitocondriale e dimostrano che la neurodegenerazione può essere invertita anche negli stadi avanzati della malattia.
Il ruolo centrale dei mitocondri nel mantenimento del metabolismo energetico neuronale è sottolineato dagli estesi sintomi neurologici associati alle malattie mitocondriali umane. La maggior parte di queste malattie è causata da mutazioni genetiche che regolano l'espressione genica mitocondriale (1, 2) o dalla distruzione di geni correlati alla dinamica mitocondriale, che influenzano indirettamente la stabilità del DNA mitocondriale (mtDNA) (3, 4). Studi su modelli animali hanno dimostrato che, in risposta alla disfunzione mitocondriale nei tessuti circostanti, possono essere attivati ​​percorsi metabolici conservativi (5-7), fornendo così importanti informazioni sulla patogenesi di queste complesse malattie. Al contrario, la nostra comprensione dei cambiamenti metabolici di specifici tipi cellulari causati dal fallimento generale della produzione di adenosina trifosfato (ATP) mitocondriale cerebrale è fondamentale (8), sottolineando la necessità di identificare bersagli terapeutici che possano essere utilizzati per prevenire o contrastare la malattia. Prevenire la neurodegenerazione (9). La mancanza di informazioni è dovuta al fatto che le cellule nervose sono generalmente considerate dotate di una flessibilità metabolica molto limitata rispetto ai tipi cellulari dei tessuti circostanti (10). Dato che queste cellule svolgono un ruolo centrale nel coordinare l'apporto di metaboliti ai neuroni per promuovere la trasmissione sinaptica e rispondere a lesioni e condizioni patologiche, la capacità di adattare il metabolismo cellulare alle difficili condizioni del tessuto cerebrale è quasi limitata alle cellule gliali (11-14). Inoltre, l'eterogeneità cellulare intrinseca del tessuto cerebrale ostacola notevolmente lo studio dei cambiamenti metabolici che si verificano in specifici sottogruppi neuronali. Di conseguenza, si sa poco sulle esatte conseguenze cellulari e metaboliche della disfunzione mitocondriale nei neuroni.
Per comprendere le conseguenze metaboliche della disfunzione mitocondriale, abbiamo isolato i neuroni di Purkinje (PN) in diversi stadi di neurodegenerazione causata dalla distruzione della fusione della membrana mitocondriale esterna (Mfn2). Sebbene le mutazioni di Mfn2 negli esseri umani siano associate a una forma di neuropatia motoria sensoriale ereditaria nota come Charcot-Marie-Tooth tipo 2A (15), la distruzione condizionale di Mfn2 nei topi è un metodo ben riconosciuto di induzione della disfunzione dell'ossidazione/fosforilazione (OXPHOS). I vari sottotipi neuronali (16-19) e il conseguente fenotipo neurodegenerativo sono accompagnati da sintomi neurologici progressivi, come disturbi del movimento (18, 19) o atassia cerebellare (16). Utilizzando una combinazione di proteomica quantitativa label-free (LFQ), metabolomica, imaging e metodi virologici, dimostriamo che la neurodegenerazione progressiva induce fortemente l'espressione della piruvato carbossilasi (PCx) e di altri fattori coinvolti nell'arteriosclerosi dei neuroni piramidali (PN) in vivo. Per verificare la rilevanza di questa scoperta, abbiamo specificamente ridotto l'espressione di PCx nei PN deficienti di Mfn2 e abbiamo scoperto che questa operazione aggravava lo stress ossidativo e accelerava la neurodegenerazione, dimostrando così che l'azoospermia conferisce adattabilità metabolica alla morte cellulare. Una grave espressione di MFN2 può salvare completamente i PN in fase di degenerazione terminale con grave deficit di OXPHOS, massiccio consumo di DNA mitocondriale e rete mitocondriale apparentemente danneggiata, il che sottolinea ulteriormente che questa forma di neurodegenerazione può persino recuperare nello stadio avanzato della malattia prima della morte cellulare.
Per visualizzare i mitocondri nei PN knockout Mfn2, abbiamo utilizzato un ceppo di topi che permette ai mitocondri Cre-dipendenti di colpire la proteina fluorescente gialla (YFP) (mtYFP) (20) espressione Cre e abbiamo controllato la morfologia mitocondriale in vivo. Abbiamo scoperto che la distruzione del gene Mfn2 nei PN porterebbe alla graduale divisione della rete mitocondriale (Figura S1A), e il primo cambiamento è stato riscontrato a 3 settimane di età. Al contrario, la sostanziale degenerazione dello strato cellulare dei PN, come evidenziato dalla perdita dell'immunocolorazione della Calbindina, non è iniziata fino a 12 settimane di età (Figura 1, A e B). La discrepanza temporale tra i primi cambiamenti nella morfologia mitocondriale e l'inizio visibile della morte neuronale ci ha spinto a indagare i cambiamenti metabolici innescati dalla disfunzione mitocondriale prima della morte cellulare. Abbiamo sviluppato una strategia basata sulla citometria a flusso (FACS) per isolare i neuroni PN che esprimono YFP (YFP+) (Figura 1C) e nei topi di controllo (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), di seguito indicati come CTRL (Figura S1B). L'ottimizzazione della strategia di gating basata sull'intensità relativa del segnale YFP ci consente di purificare il corpo YFP+ (YFPhigh) dei neuroni PN dai neuroni non-PN (YFPneg) (Figura S1B) o da presunti frammenti assonali/dendritici fluorescenti (YFPlow; Figura S1D, a sinistra), confermati mediante microscopia confocale (Figura S1D, a destra). Per verificare l'identità della popolazione classificata, abbiamo condotto un'analisi proteomica LFQ e successivamente un'analisi delle componenti principali, riscontrando una netta separazione tra le cellule YFPhigh e YFPneg (Figura S1C). Le cellule YFPhigh hanno mostrato un arricchimento netto di noti marcatori PN (ovvero Calb1, Pcp2, Grid2 e Itpr3) (21, 22), ma nessun arricchimento di proteine ​​comunemente espresse nei neuroni o in altri tipi cellulari (Figura 1D). Un confronto tra campioni di cellule YFPhigh classificate raccolte in esperimenti indipendenti ha mostrato un coefficiente di correlazione > 0,9, dimostrando una buona riproducibilità tra repliche biologiche (Figura S1E). In sintesi, questi dati hanno convalidato il nostro piano per l'isolamento acuto e specifico di PN fattibili. Poiché il sistema driver L7-cre utilizzato induce la ricombinazione a mosaico nella prima settimana dopo la somministrazione (23), abbiamo iniziato a selezionare i topi da CTRL e condizionali (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Raccogliere neuroni. Dopo che la ricombinazione è completata, viene chiamata Mfn2cKO a 4 settimane di età. Come punto finale, abbiamo selezionato 8 settimane di età quando lo strato PN era ancora intatto nonostante gli evidenti frammenti mitocondriali (Figura 1B e Figura S1A). In totale, abbiamo quantificato un totale di 3013 proteine, di cui circa il 22% erano basate sulle annotazioni MitoCarta 2.0 basate sul proteoma mitocondriale come mitocondri (Figura 1E) (Figura 1E) (24). L'analisi dell'espressione genica differenziale eseguita alla settimana 8 ha mostrato che solo il 10,5% di tutte le proteine ​​aveva cambiamenti significativi (Figura 1F e Figura S1F), di cui 195 proteine ​​erano sottoregolate e 120 proteine ​​erano sovraregolate (Figura 1F). Vale la pena notare che l'"analisi del percorso innovativo" di questo set di dati mostra che i geni espressi in modo differenziale appartengono principalmente a un insieme ristretto di percorsi metabolici specifici (Figura 1G). È interessante notare che, sebbene la down-regulation delle vie metaboliche correlate alla fosforilazione ossidativa e alla segnalazione del calcio confermi l'induzione di disfunzione mitocondriale nei neuroni piramidali con deficit di fusione, altre categorie che coinvolgono principalmente il metabolismo degli amminoacidi risultano significativamente up-regulation, in linea con il metabolismo che si verifica nei neuroni piramidali mitocondriali. Il rimodellamento è coerente. disfunzione.
(A) Fotografie confocali rappresentative di sezioni cerebellari di topi CTRL e Mfn2cKO che mostrano la progressiva perdita di PN (calbindina, grigio); i nuclei sono stati controcolorati con DAPI. (B) Quantificazione di (A) (analisi della varianza a una via, ***P<0,001; n = da 4 a 6 cerchi da tre topi). (C) Flusso di lavoro sperimentale. (D) Distribuzione della mappa di calore dei marcatori specifici per le cellule di Purkinje (in alto) e altri tipi cellulari (al centro). (E) Diagramma di Venn che mostra il numero di proteine ​​mitocondriali identificate nel PN classificato. (F) Grafico a vulcano delle proteine ​​espresse in modo differenziale nei neuroni Mfn2cKO a 8 settimane (valore di cut-off di significatività di 1,3). (G) L'analisi del percorso della creatività mostra i cinque percorsi di up-regulation (rosso) e down-regulation (blu) più importanti nel PN Mfn2cKO classificato a 8 settimane. Viene mostrato il livello di espressione medio di ciascuna proteina rilevata. Mappa di calore in scala di grigi: valore P corretto. ns, non importante.
I dati proteomici hanno mostrato che l'espressione proteica dei complessi I, III e IV è diminuita gradualmente. I complessi I, III e IV contenevano tutti subunità essenziali codificate dal mtDNA, mentre il complesso II, che era codificato solo dal nucleo, non è stato sostanzialmente influenzato (Figura 2A e Figura S2A). In linea con i risultati proteomici, l'immunoistochimica delle sezioni di tessuto cerebellare ha mostrato che il livello della subunità MTCO1 (subunità 1 della citocromo C ossidasi mitocondriale) del complesso IV nel PN è diminuito gradualmente (Figura 2B). La subunità Mtatp8 codificata dal mtDNA è risultata significativamente ridotta (Figura S2A), mentre il livello allo stato stazionario della subunità ATP sintasi codificata dal nucleo è rimasto invariato, il che è coerente con il noto complesso F1 del sottoassemblaggio stabile dell'ATP sintasi quando l'espressione del mtDNA è stabile. La formazione è coerente. Interrompere (7). La valutazione del livello di mtDNA nei PN Mfn2cKO selezionati mediante reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR) ha confermato la graduale diminuzione del numero di copie di mtDNA. Rispetto al gruppo di controllo, a 8 settimane di età, solo circa il 20% del livello di mtDNA è stato mantenuto (Figura 2C). In linea con questi risultati, la colorazione mediante microscopia confocale dei PN Mfn2cKO per rilevare il DNA mostra il consumo tempo-dipendente dei nucleotidi mitocondriali (Figura 2D). Abbiamo scoperto che solo alcuni candidati coinvolti nella degradazione delle proteine ​​mitocondriali e nella risposta allo stress erano sovraregolati, tra cui Lonp1, Afg3l2 e Clpx, e i fattori di assemblaggio del complesso OXPHOS. Non sono state rilevate modifiche significative nei livelli delle proteine ​​coinvolte nell'apoptosi (Figura S2B). Allo stesso modo, abbiamo scoperto che i canali mitocondriali e del reticolo endoplasmatico coinvolti nel trasporto del calcio presentano solo lievi modifiche (Figura S2C). Inoltre, la valutazione delle proteine ​​correlate all'autofagia non ha rilevato cambiamenti significativi, il che è coerente con l'induzione visibile di autofagosomi osservata in vivo mediante immunoistochimica e microscopia elettronica (Figura S3). Tuttavia, la disfunzione progressiva della fosforilazione ossidativa nei neuroni di Purkinje (PN) è accompagnata da evidenti cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali. Aggregati mitocondriali possono essere osservati nei corpi cellulari e negli alberi dendritici dei neuroni di Purkinje Mfn2cKO di 5 e 8 settimane, e la struttura della membrana interna ha subito profondi cambiamenti (Figura S4, A e B). In linea con questi cambiamenti ultrastrutturali e una significativa diminuzione del mtDNA, l'analisi di sezioni acute del cervelletto cerebrale con tetrametilrodamina metil estere (TMRM) ha mostrato che il potenziale di membrana mitocondriale nei neuroni di Purkinje Mfn2cKO era significativamente diminuito (Figura S4C).
(A) Analisi dell'andamento temporale del livello di espressione del complesso OXPHOS. Considerare solo le proteine ​​con P<0,05 a 8 settimane (ANOVA a due vie). Linea tratteggiata: nessuna correzione rispetto al CTRL. (B) A sinistra: esempio di una sezione cerebellare marcata con anticorpo anti-MTCO1 (barra di scala, 20 μm). L'area occupata dai corpi cellulari delle cellule di Purkinje è evidenziata in giallo. A destra: quantificazione dei livelli di MTCO1 (analisi della varianza a una via; n = da 7 a 20 cellule analizzate da tre topi). (C) Analisi qPCR del numero di copie di mtDNA nel PN selezionato (analisi della varianza a una via; n = da 3 a 7 topi). (D) A sinistra: esempio di una sezione cerebellare marcata con un anticorpo anti-DNA (barra di scala, 20 μm). L'area occupata dai corpi cellulari delle cellule di Purkinje è evidenziata in giallo. A destra: Quantificazione delle lesioni del mtDNA (analisi della varianza a una via; n = da 5 a 9 cellule da tre topi). (E) Un esempio di sezione cerebellare acuta che mostra cellule di Purkinje mitoYFP + (freccia) in una registrazione patch clamp a cellula intera. (F) Quantificazione della curva IV. (G) Registrazioni rappresentative dell'iniezione di corrente depolarizzante in cellule di Purkinje CTRL e Mfn2cKO. Traccia superiore: il primo impulso che ha innescato il potenziale d'azione (AP). Traccia inferiore: frequenza massima del potenziale d'azione. (H) Quantificazione degli input spontanei postsinaptici (sPSP). La traccia di registrazione rappresentativa e il suo rapporto di zoom sono mostrati in (I). Analisi della varianza a una via analizzata n = da 5 a 20 cellule da tre topi. I dati sono espressi come media±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Tracce rappresentative del potenziale d'azione spontaneo registrato utilizzando la modalità patch clamp perforata. Traccia superiore: frequenza massima del potenziale d'azione. Traccia inferiore: zoom di un singolo AP. (K) Quantificare la frequenza media e massima degli AP secondo (J). Test di Mann-Whitney; sono state analizzate n = 5 cellule da quattro topi. I dati sono espressi come media±SEM; non importante.
Nei neuroni PN Mfn2cKO di 8 settimane è stato rilevato un evidente danno alla fosforilazione ossidativa (OXPHOS), a indicare una grave alterazione della funzione fisiologica dei neuroni. Pertanto, abbiamo analizzato le caratteristiche elettriche passive dei neuroni con deficit di OXPHOS a 4-5 settimane e 7-8 settimane, eseguendo registrazioni patch clamp a cellula intera su fette cerebellari acute (Figura 2E). Inaspettatamente, il potenziale di membrana a riposo medio e la resistenza di ingresso dei neuroni Mfn2cKO erano simili a quelli del controllo, sebbene vi fossero sottili differenze tra le cellule (Tabella 1). Analogamente, a 4-5 settimane di età, non sono state riscontrate modifiche significative nella relazione corrente-tensione (curva I-V) (Figura 2F). Tuttavia, nessun neurone Mfn2cKO di 7-8 settimane è sopravvissuto al regime I-V (fase di iperpolarizzazione), indicando una chiara sensibilità al potenziale di iperpolarizzazione in questa fase avanzata. Al contrario, nei neuroni Mfn2cKO, le correnti depolarizzanti che causano scariche ripetitive di potenziali d'azione (AP) sono ben tollerate, indicando che i loro modelli di scarica complessivi non sono significativamente diversi da quelli dei neuroni di controllo di 8 settimane (Tabella 1 e Figura 2G). Allo stesso modo, la frequenza e l'ampiezza delle correnti postsinaptiche spontanee (sPSC) erano paragonabili a quelle del gruppo di controllo e la frequenza degli eventi è aumentata da 4 settimane a 5 settimane a 7 settimane a 8 settimane con un aumento simile (Figura 2, H e I). Il periodo di maturazione sinaptica nei PN (25). Risultati simili sono stati ottenuti dopo patch di PN perforati. Questa configurazione impedisce la possibile compensazione dei difetti di ATP cellulare, come potrebbe accadere nella registrazione patch clamp a cellula intera. In particolare, il potenziale di membrana a riposo e la frequenza di scarica spontanea dei neuroni Mfn2cKO non sono stati influenzati (Figura 2, J e K). In sintesi, questi risultati indicano che i neuroni piramidali con evidente disfunzione della fosforilazione ossidativa possono gestire bene i pattern di scarica ad alta frequenza, suggerendo l'esistenza di un meccanismo di compensazione che consente loro di mantenere risposte elettrofisiologiche quasi normali.
I dati sono espressi come media ± errore standard (analisi della varianza a una via, test di confronto multiplo di Holm-Sidak; *P<0,05). Il numero dell'unità è indicato tra parentesi.
Abbiamo cercato di indagare se una qualsiasi categoria nel set di dati proteomici (Figura 1G) includa percorsi in grado di contrastare una grave carenza di OXPHOS, spiegando così perché i PN affetti possono mantenere un'elettrofisiologia quasi normale (Figura 2, da E a K). L'analisi proteomica ha mostrato che gli enzimi coinvolti nel catabolismo degli aminoacidi a catena ramificata (BCAA) erano significativamente sovraregolati (Figura 3A e Figura S5A) e il prodotto finale acetil-CoA (CoA) o succinil-CoA può integrare i tricarbossilati nel ciclo dell'acido tranexamico (TCA). Abbiamo scoperto che il contenuto di BCAA transaminasi 1 (BCAT1) e BCAT2 era aumentato. Essi catalizzavano il primo passaggio del catabolismo dei BCAA generando glutammato dall'α-chetoglutarato (26). Tutte le subunità che compongono il complesso della deidrogenasi dei chetoacidi a catena ramificata (BCKD) sono sovraregolate (il complesso catalizza la successiva e irreversibile decarbossilazione dello scheletro carbonioso BCAA risultante) (Figura 3A e Figura S5A). Tuttavia, non sono state riscontrate modifiche evidenti nei BCAA stessi nei PN selezionati, il che potrebbe essere dovuto all'aumento dell'assorbimento cellulare di questi aminoacidi essenziali o all'utilizzo di altre fonti (glucosio o acido lattico) per integrare il ciclo di Krebs (Figura S5B). I PN privi di OXPHOS hanno anche mostrato un aumento delle attività di decomposizione e transaminazione della glutammina a 8 settimane di età, che può essere riflesso dalla sovraregolazione degli enzimi mitocondriali glutaminasi (GLS) e glutammina piruvato transaminasi 2 (GPT2) (Figura 3, A e C). Vale la pena notare che la sovraregolazione di GLS è limitata all'isoforma spliced ​​glutaminasi C (GLS-GAC) (il cambiamento di Mfn2cKO/CTRL è circa 4,5 volte, P = 0,05) e la sua sovraregolazione specifica nei tessuti cancerosi può supportare la bioenergia mitocondriale. (27).
(A) La mappa di calore mostra la variazione di livello proteico per il percorso specificato a 8 settimane. (B) Esempio di una sezione cerebellare marcata con anticorpo anti-PCx (barra di scala, 20 μm). La freccia gialla indica il corpo cellulare delle cellule di Purkinje. (C) Analisi dell'espressione proteica nel tempo identificata come un importante candidato per l'aterosclerosi (test t multiplo, *FDR <5%; n = 3-5 topi). (D) Sopra: uno schema che mostra le diverse modalità di ingresso del carbonio marcato contenuto nel tracciante [1-13C]piruvato (ovvero, tramite PDH o via trans-arteriosa). Sotto: il grafico a violino mostra la percentuale di carbonio marcato singolarmente (M1) convertito in acido aspartico, acido citrico e acido malico dopo la marcatura di sezioni cerebellari acute con [1-13C]piruvato (test t appaiato; ** P <0,01). (E) Analisi completa dell'andamento temporale del percorso indicato. Considerare solo le proteine ​​con P<0,05 a 8 settimane​​. Linea tratteggiata: nessun valore di aggiustamento (analisi della varianza a due vie; * P <0,05; *** P <0,001). I dati sono espressi come media±SEM.
Nella nostra analisi, il catabolismo dei BCAA è diventato uno dei principali percorsi di sovraregolazione. Questo fatto suggerisce fortemente che il volume di ventilazione che entra nel ciclo di Krebs potrebbe essere modificato nei neuroni piramidali (PN) privi di OXPHOS. Ciò potrebbe rappresentare una forma importante di riorganizzazione metabolica neuronale, che potrebbe avere un impatto diretto sulla fisiologia neuronale e sulla sopravvivenza durante il mantenimento di una grave disfunzione di OXPHOS. In linea con questa ipotesi, abbiamo scoperto che il principale enzima anti-aterosclerotico PCx è sovraregolato (Mfn2cKO/CTRL cambia di circa 1,5 volte; Figura 3A), che catalizza la conversione del piruvato in ossalacetato (28), che si ritiene sia presente nel tessuto cerebrale. L'espressione è limitata agli astrociti (29, 30). In linea con i risultati proteomici, la microscopia confocale ha mostrato che l'espressione di PCx era specificamente e significativamente aumentata nei neuroni piramidali con deficit di OXPHOS, mentre la reattività di PCx era principalmente limitata alle cellule gliali di Bergmann adiacenti del controllo (Figura 3B). Per testare funzionalmente l'aumento di PCx osservato, abbiamo trattato fette cerebellari acute con il tracciante [1-13C]piruvato. Quando il piruvato è stato ossidato dalla piruvato deidrogenasi (PDH), la sua marcatura isotopica è scomparsa, ma è stata incorporata negli intermedi del ciclo di Krebs quando il piruvato è stato metabolizzato dalle reazioni vascolari (Figura 3D). A supporto dei nostri dati proteomici, abbiamo osservato un gran numero di marcatori di questo tracciante nell'acido aspartico delle fette Mfn2cKO, mentre l'acido citrico e l'acido malico hanno mostrato una tendenza moderata, sebbene non significativa (Figura 3D).
Nei neuroni dopaminergici dei topi MitoPark con disfunzione mitocondriale causata dalla distruzione specifica del gene del fattore di trascrizione mitocondriale A (Tfam) (Figura S6B), l'espressione di PCx è risultata significativamente sovraregolata (31), indicando che l'insorgenza della malattia è regolata durante la disfunzione della fosforilazione ossidativa neuronale nell'organismo. Vale la pena notare che è stato riscontrato che enzimi unici (32-34) che possono essere espressi nei neuroni che possono essere associati all'arteriosclerosi sono significativamente sovraregolati nei PN privi di fosforilazione ossidativa, come la propionil-CoA carbossilasi (PCC-A), la malonil-CoA converte il propionil-CoA in succinil-CoA e l'enzima malico mitocondriale 3 (ME3), il cui ruolo principale è quello di recuperare il piruvato dal malato (Figura 3, A e C) (33, 35). Inoltre, abbiamo riscontrato un aumento significativo dell'enzima Pdk3, che fosforila e quindi inattiva la PDH (36), mentre non sono state rilevate modifiche nell'enzima Pdp1 che attiva la PDH o nel complesso enzimatico PDH stesso (Figura 3A). Coerentemente, nei PN Mern2cKO, la fosforilazione della subunità α1 (PDHE1α) della componente E1 della piruvato deidrogenasi del complesso PDH in Ser293 (nota per inibire l'attività enzimatica della PDH) è stata aumentata (Figura S6C) (Figura S6C). Il piruvato non ha accesso vascolare.
Infine, abbiamo scoperto che il super percorso della biosintesi di serina e glicina, il relativo ciclo mitocondriale del folato (1C) e la biosintesi della prolina (Figura 1G e Figura S5C) sono tutti significativamente sovraregolati, secondo quanto riportato, durante il processo di attivazione. I tessuti circostanti sono attivati ​​con disfunzione mitocondriale (5-7). L'analisi confocale a supporto di questi dati proteomici ha mostrato che in PN con OXPHOS mancante, le fette cerebellari di topi di 8 settimane sono state sottoposte a serina idrossimetiltransferasi 2 (SHMT2), un enzima chiave del ciclo mitocondriale del folato. Risposta immunitaria significativa (Figura S5D). In 13 fette cerebellari acute incubate con CU-glucosio, esperimenti di tracciamento metabolico hanno ulteriormente confermato la sovraregolazione della biosintesi di serina e prolina, indicando che il flusso di isoforme di carbonio in serina e prolina è aumentato (Figura S5E). Poiché le reazioni promosse da GLS e GPT2 sono responsabili della sintesi del glutammato dalla glutammina e della transaminazione tra glutammato e α-chetoglutarato, la loro sovraregolazione indica che i neuroni con deficit di OXPHOS hanno una maggiore richiesta di glutammato. Ciò potrebbe essere finalizzato a mantenere l'aumentata biosintesi di prolina (Figura S5C). In contrasto con questi cambiamenti, un'analisi proteomica degli astrociti cerebellari di topi Mfn2cKO specifici per PN ha mostrato che queste vie metaboliche (incluse tutte le antiperossidasi) non hanno subito cambiamenti significativi nell'espressione, dimostrando così che questo reindirizzamento metabolico è selettivo per PN degradato (Fig. S6, da D a G).
In sintesi, queste analisi hanno rivelato modelli significativamente diversi di attivazione temporale di specifici percorsi metabolici nei PN. Sebbene una funzione mitocondriale neuronale anomala possa portare ad aterosclerosi precoce e rimodellamento del ciclo 1C (Figura 3E e Figura S5C), e persino a cambiamenti prevedibili nell'espressione dei complessi I e IV, le modifiche nella sintesi de novo della serina sono diventate evidenti solo nelle fasi tardive. Disfunzione della fosforilazione ossidativa (Figura 3E e Figura S5C). Questi risultati definiscono un processo sequenziale in cui la risposta mitocondriale (ciclo 1C) e citoplasmatica (biosintesi della serina) indotta dallo stress agisce sinergicamente con l'aumento dell'aterosclerosi nel ciclo di Krebs per rimodellare il metabolismo neuronale.
I neuroni piramidali (PN) con deficit di OXPHOS di 8 settimane possono mantenere un'attività di eccitazione ad alta frequenza e subire una significativa riconnessione metabolica per compensare la disfunzione mitocondriale. Questa scoperta solleva l'interessante possibilità che, anche in questa fase, queste cellule possano ricevere un intervento terapeutico per ritardare o prevenire la neurodegenerazione. Abbiamo affrontato questa possibilità attraverso due interventi indipendenti. Nel primo metodo, abbiamo progettato un vettore virale adeno-associato (AAV) Cre-dipendente in modo che MFN2 possa essere espresso selettivamente nei PN con deficit di OXPHOS in vivo (Figura S7A). L'AAV codificante MFN2 e il gene reporter fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) sono stati verificati in colture di neuroni primari in vitro, che hanno causato l'espressione di MFN2 in modo Cre-dipendente e hanno ripristinato la morfologia mitocondriale, prevenendo così la neuromutazione nei neuroni Mfn2cKO (Figura S7, B, D ed E). Successivamente, abbiamo condotto esperimenti in vivo per somministrare stereotatticamente Mfn2-AAV di 8 settimane alla corteccia cerebellare di topi Mfn2cKO e di controllo, e abbiamo analizzato topi di 12 settimane (Figura 4A). I ​​topi Mfn2cKO trattati sono morti (Figura 1, A e B) (16). La trasduzione virale in vivo ha portato all'espressione selettiva di PN in alcuni cerchi cerebellari (Figura S7, G e H). L'iniezione di AAV di controllo che esprime solo mCherry (Ctrl-AAV) non ha avuto effetti significativi sul grado di neurodegenerazione negli animali Mfn2cKO. Al contrario, l'analisi di Mfn2cKO trasdotti con Mfn2-AAV ha mostrato un significativo effetto protettivo dello strato di cellule PN (Figura 4, B e C). In particolare, la densità neuronale sembra essere quasi indistinguibile da quella degli animali di controllo (Figura 4, B e C, e Figura S7, H e I). L'espressione di MFN1, ma non di MFN2, è ugualmente efficace nel prevenire la morte neuronale (Figura 4C e Figura S7, C e F), il che indica che l'espressione ectopica di MFN1 può compensare efficacemente la mancanza di MFN2. Ulteriori analisi a livello del singolo PN hanno mostrato che Mfn2-AAV ha ampiamente ripristinato l'ultrastruttura dei mitocondri, normalizzato i livelli di mtDNA e invertito l'elevata espressione del marcatore anti-angiogenetico PCx (Figura 4, da C a E). L'ispezione visiva dei topi Mfn2cKO salvati in stato di riposo ha mostrato un miglioramento della postura e dei sintomi motori (movimenti da S1 a S3). In conclusione, questi esperimenti dimostrano che la reintroduzione ritardata di MFN2 nei PN gravemente carenti di OXPHOS è sufficiente a invertire il consumo di mtDNA e indurre l'aterosclerosi, prevenendo così la degenerazione assonale e la morte neuronale in vivo.
(A) Schema che mostra il programma sperimentale per l'iniezione di AAV codificante MFN2 quando il percorso metabolico indicato è attivato. (B) Fotografie confocali rappresentative di sezioni cerebellari di topi di 12 settimane trasdotte con topi Mfn2cKO a 8 settimane e marcate con anticorpo anti-Calbindina. A destra: ridimensionamento delle fibre assonali. La scala dello zoom dell'assone è 450 e 75 μm. (C) A sinistra: quantificazione della densità delle cellule di Purkinje nel circuito di trasduzione AAV (AAV+) (analisi della varianza a una via; n = 3 topi). A destra: analisi del focus del mtDNA nei PN trasdotti alla settimana 12 (test t non accoppiato; n = 6 cellule da tre topi). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Micrografie elettroniche a trasmissione rappresentative dei PN di sezioni cerebellari di topi Mfn2cKO trasdotte con i vettori virali indicati. La maschera rosa illustra l'area occupata dai dendriti e il quadrato tratteggiato giallo illustra lo zoom fornito a destra; n rappresenta il nucleo. Barra di scala, 1 μm. (E) mostra un esempio di colorazione PCx in PN trasdotto a 12 settimane. Barra di scala, 20 μm. OE, sovraespressione; FC, variazione di espressione.
Infine, abbiamo studiato l'importanza della sopravvivenza cellulare indotta dalla perossidasi nei PN che hanno subito una disfunzione della fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Abbiamo generato mCherry codificante AAV-shRNA (RNA a forcina corta) mirato specificamente all'mRNA di PCx del topo (AAV-shPCx) e abbiamo iniettato il virus o il suo controllo casuale (AAV-scr) nel cervelletto di topi Mfn2cKO. L'iniezione è stata eseguita alla quarta settimana di età (Figura 5A) per ottenere un efficace silenziamento di PCx durante il periodo in cui l'espressione di PCx aumentava (Figura 3C) e lo strato di cellule PN era ancora intatto (Figura 1A). Vale la pena notare che il silenziamento di PCx (Figura S8A) porta a una significativa accelerazione della morte dei PN, che è l'unico anello ristretto di infezione (Figura 5, B e C). Al fine di comprendere il meccanismo degli effetti metabolici indotti dalla sovraregolazione di PCx, abbiamo studiato lo stato redox dei PN dopo il silenziamento di PCx e l'espressione simultanea del biosensore ottico mediato da AAV Grx1-roGFP2 (Figura S8, da B a D) per valutare il cambiamento relativo del potenziale redox del peptide glutatione (38). Successivamente, abbiamo eseguito la microscopia di imaging della durata della fluorescenza a due fotoni (FLIM) in sezioni cerebrali acute di topi Mfn2cKO di 7 settimane o di controllo per rilevare potenziali cambiamenti nello stato redox citoplasmatico dopo aver verificato le condizioni FLIM (Figura S8, da E a G). L'analisi ha mostrato un aumento significativo dello stato di ossidazione di un singolo PN Mfn2cKO privo di espressione di PCx, che è diverso dai neuroni di controllo o dai PN Mfn2cKO che esprimono solo shRNA scrambled (Figura 5, D ed E). Quando l'espressione di PCx è stata ridotta, la percentuale di PN Mfn2cKO che mostravano uno stato altamente ossidato è aumentata di oltre tre volte (Figura 5E), indicando che la sovraregolazione di PCx ha mantenuto la capacità redox dei neuroni degenerati.
(A) Schema che mostra il programma sperimentale per l'iniezione di AAV codificante shPCx quando il percorso metabolico indicato è attivato. (B) Fotografie confocali rappresentative di sezioni cerebellari di topi Mfn2cKO di 8 settimane trasdotte e marcate con anticorpo anti-calcineurina a 4 settimane. Barra di scala, 450 μm. (C) Quantificazione della densità delle cellule di Purkinje nei loop trasdotti con AAV (analisi della varianza a una via; n = da 3 a 4 topi). I dati sono espressi come media ± SEM; ***P < 0,001. (D) Immagine FLIM rappresentativa che mostra la durata media della vita di PN di 7 settimane che esprime il sensore redox del glutatione Grx1-roGFP2 nelle condizioni sperimentali specificate. Rapporto LUT (look-up table): intervallo di tempo di sopravvivenza (in picosecondi). Barra di scala, 25 μm. (E) L'istogramma mostra la distribuzione dei valori di durata di vita di Grx1-roGFP2 ​​da (D) (n=158 a 368 cellule in due topi in ciascuna condizione). Il grafico a torta sopra ogni istogramma: mostra il numero di cellule con valori di durata di vita significativamente più lunghi (rosso, ossidati) o più brevi (blu, ridotti), che superano 1 SD del valore medio di durata di vita in CTRL-AAV-scr. (F) Il modello proposto mostra l'effetto protettivo della sovraregolazione di PCx neuronale.
Nel complesso, i dati che presentiamo qui dimostrano che la ri-espressione di MFN2 può salvare completamente i neuroni PN avanzati con grave deficit di OXPHOS, grave deplezione di mtDNA e morfologia ista-simile estremamente anomala, garantendo così un progresso continuo anche nelle malattie in stadio avanzato. La neurodegenerazione fornisce una prova reversibile dello stadio precedente alla morte cellulare. Questo grado di flessibilità metabolica è ulteriormente enfatizzato dalla capacità dei neuroni di indurre l'aterosclerosi (una riorganizzazione del ciclo di Krebs), che inibisce l'espressione di PCx nei neuroni PN privi di OXPHOS e aumenta la morte cellulare, svolgendo così un ruolo protettivo (Figura 5F).
In questo studio, abbiamo fornito prove che la risposta dei neuroni primari (PN) alla disfunzione della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) consiste nel convergere gradualmente verso l'aterosclerosi del ciclo di Krebs attraverso un percorso di attivazione differenziale attivato da programmi metabolici. Abbiamo confermato l'analisi proteomica con numerosi metodi complementari e abbiamo rivelato che, quando sottoposti a grave disfunzione mitocondriale, i neuroni presentano una forma di elasticità metabolica precedentemente sconosciuta. Con nostra sorpresa, l'intero processo di riorganizzazione non segna necessariamente lo stato metabolico terminale che accompagna la neurodegenerazione in modo graduale e irreversibile, ma i nostri dati suggeriscono che possa costituire un meccanismo di compensazione funzionale del neurone anche nella fase precedente alla morte cellulare. Questa scoperta indica che i neuroni possiedono un considerevole grado di plasticità metabolica nell'organismo. Questo fatto dimostra che la successiva reintroduzione di MFN2 può invertire l'espressione di marcatori metabolici chiave e prevenire la degenerazione dei neuroni primari. Al contrario, inibisce l'aterosclerosi e accelera la neurodegenerazione.
Uno dei risultati più affascinanti della nostra ricerca è che i neuroni periferici privi di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) possono modificare il metabolismo del ciclo di Krebs mediante la sovraregolazione di enzimi che stimolano specificamente l'arteriosclerosi. Il riarrangiamento metabolico è una caratteristica comune delle cellule tumorali, alcune delle quali dipendono dalla glutammina per integrare gli intermedi del ciclo di Krebs al fine di produrre equivalenti riducenti, che guidano la catena respiratoria e mantengono la produzione di precursori della biosintesi di lipidi e nucleotidi (39, 40). Uno studio recente ha dimostrato che nei tessuti periferici che presentano disfunzione della fosforilazione ossidativa, la riconnessione del metabolismo glutammina/glutammato è anche una caratteristica prominente (5, 41), dove la direzione dell'ingresso della glutammina nel ciclo di Krebs dipende dalla gravità del danno alla fosforilazione ossidativa (41). Tuttavia, mancano prove chiare su una possibile somiglianza della plasticità metabolica neuronale nel corpo e sulla sua possibile rilevanza nel contesto della malattia. In un recente studio in vitro, è stato dimostrato che i neuroni corticali primari mobilitano i pool di glutammato per la neurotrasmissione, promuovendo così il metabolismo ossidativo e l'aterosclerosi in condizioni di stress metabolico (42). Vale la pena notare che, sotto l'inibizione farmacologica dell'enzima succinato deidrogenasi del ciclo di Krebs, si ritiene che la carbossilazione del piruvato mantenga la sintesi di ossalacetato nei neuroni granulari cerebellari in coltura (34). Tuttavia, la rilevanza fisiologica di questi meccanismi per il tessuto cerebrale (dove si ritiene che l'aterosclerosi sia principalmente confinata agli astrociti) ha ancora un importante significato fisiologico (43). In questo caso, i nostri dati mostrano che i PN danneggiati dalla fosforilazione ossidativa nell'organismo possono essere convertiti alla degradazione degli aminoacidi a catena ramificata (BCAA) e alla carbossilazione del piruvato, che sono le due principali fonti di integrazione degli intermedi del pool di Krebs. Sebbene sia stato proposto il presunto contributo del catabolismo dei BCAA al metabolismo energetico neuronale, oltre al ruolo del glutammato e del GABA per la neurotrasmissione (44), non vi sono ancora prove di questi meccanismi in vivo. Pertanto, è facile ipotizzare che i PN disfunzionali possano compensare automaticamente il consumo di intermedi del TCA guidato dal processo di assimilazione aumentando l'aterosclerosi. In particolare, potrebbe essere necessaria la sovraregolazione della PCx per mantenere una maggiore richiesta di acido aspartico, come dimostrato nelle cellule proliferanti con disfunzione mitocondriale (45). Tuttavia, la nostra analisi metabolomica non ha rivelato cambiamenti significativi nel livello di stato stazionario dell'acido aspartico nei PN Mfn2cKO (Figura S6A), il che presumibilmente riflette il diverso utilizzo metabolico dell'acido aspartico tra cellule proliferanti e neuroni post-mitotici. Sebbene l'esatto meccanismo di sovraregolazione della PCx nei neuroni disfunzionali in vivo debba ancora essere caratterizzato, abbiamo dimostrato che questa risposta prematura gioca un ruolo importante nel mantenimento dello stato redox dei neuroni, come dimostrato negli esperimenti FLIM su sezioni cerebellari. In particolare, impedire ai PN di sovraregolare la PCx può portare a uno stato più ossidato e accelerare la morte cellulare. L'attivazione della degradazione degli aminoacidi a catena ramificata (BCAA) e la carbossilazione del piruvato non sono modi per caratterizzare i tessuti periferici della disfunzione mitocondriale (7). Pertanto, sembrano essere una caratteristica prioritaria dei neuroni con deficit di OXPHOS, anche se non l'unica caratteristica, che è importante per la neurodegenerazione.
La malattia cerebellare è un tipo eterogeneo di malattia neurodegenerativa che di solito si manifesta come atassia e spesso danneggia i PN (46). Questa popolazione neuronale è particolarmente vulnerabile alla disfunzione mitocondriale perché la loro degenerazione selettiva nei topi è sufficiente a riprodurre molti dei sintomi motori che caratterizzano l'atassia spinocerebellare umana (16, 47, 48). Secondo quanto riportato, un modello di topo transgenico con un gene mutante è associato all'atassia spinocerebellare umana e presenta disfunzione mitocondriale (49, 50), sottolineando l'importanza di studiare le conseguenze della carenza di OXPHOS nella PNPH. Pertanto, è particolarmente adatto isolare e studiare efficacemente questa popolazione neuronale unica. Tuttavia, dato che i PN sono molto sensibili alla pressione e rappresentano una bassa percentuale dell'intera popolazione cellulare cerebellare, per molti studi basati sull'omica, la loro separazione selettiva come cellule intere rimane un aspetto impegnativo. Sebbene sia quasi impossibile ottenere una totale assenza di contaminazione da altri tipi cellulari (specialmente tessuti adulti), abbiamo combinato un efficace passaggio di dissociazione con FACS per ottenere un numero sufficiente di neuroni vitali per l'analisi proteomica successiva e abbiamo una copertura proteica piuttosto elevata (circa 3000 proteine) rispetto al set di dati esistente dell'intero cervelletto (51). Preservando la vitalità delle cellule intere, il metodo che forniamo qui ci consente non solo di verificare i cambiamenti nei percorsi metabolici nei mitocondri, ma anche di verificare i cambiamenti nelle loro controparti citoplasmatiche, il che integra l'uso dell'arricchimento del marcatore della membrana mitocondriale specifico per i tipi cellulari. Il nuovo metodo per il numero di mitocondri nei tessuti complessi (52, 53). Il metodo che descriviamo non è correlato solo allo studio delle cellule di Purkinje, ma può essere facilmente applicato a qualsiasi tipo di cellula per affrontare i cambiamenti metabolici nei cervelli malati, compresi altri modelli di disfunzione mitocondriale.
Infine, abbiamo identificato una finestra terapeutica durante questo processo di riorganizzazione metabolica in grado di invertire completamente i principali segni di stress cellulare e prevenire la degenerazione neuronale. Pertanto, la comprensione delle implicazioni funzionali del rimodellamento qui descritto potrebbe fornire spunti fondamentali per possibili trattamenti volti a mantenere la vitalità neuronale durante la disfunzione mitocondriale. Sono necessarie ulteriori ricerche volte ad analizzare i cambiamenti nel metabolismo energetico in altri tipi di cellule cerebrali per svelare appieno l'applicabilità di questo principio ad altre malattie neurologiche.
I topi MitoPark sono stati descritti in precedenza (31). I topi C57BL/6N con loxP che fiancheggiano i geni Mfn2 sono stati descritti in precedenza (18) e incrociati con topi L7-Cre (23). La progenie doppiamente eterozigote risultante è stata quindi incrociata con topi omozigoti Mfn2loxP/Mfn2loxP per generare knockout genici specifici per le cellule di Purkinje per Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). In un sottoinsieme di incroci, l'allele Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) è stato introdotto tramite ulteriori incroci (20). Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida europee, nazionali e istituzionali e approvate dal LandesamtfürNatur of Umwelt und Verbraucherschutz, Renania Settentrionale-Vestfalia, Germania. Il lavoro sugli animali segue anche le linee guida della Federazione europea delle associazioni di scienze degli animali da laboratorio.
Dopo aver anestetizzato la dislocazione cervicale della donna incinta, l'embrione di topo viene isolato (E13). La corteccia è stata dissezionata in soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) supplementata con 10 mM di Hepes e trasferita su terreno di coltura di Dulbecco modificato (DMEM) contenente papaina (20 U/ml) e cisteina (1 μg/ml). Il tessuto è stato incubato in DMEM e dissociato mediante digestione enzimatica (1 μg/ml) a 37 °C per 20 minuti, quindi macinato meccanicamente in DMEM supplementato con il 10% di siero fetale bovino. Le cellule sono state seminate su vetrini coprioggetto rivestiti con polilisina a una densità di 2 × 10⁶ per piastra di coltura da 6 cm o a una densità di 0,5 × 10⁵ cellule/cm² per l'analisi di imaging. Dopo 4 ore, il terreno è stato sostituito con terreno Neurobasal privo di siero contenente l'1% di supplemento B27 e 0,5 mM di GlutaMax. I neuroni sono stati quindi mantenuti a 37 °C e 5% di CO2 per tutta la durata dell'esperimento e nutriti una volta alla settimana. Per indurre la ricombinazione in vitro, 3 μl (piastra di coltura a 24 pozzetti) o 0,5 μl (piastra a 24 pozzetti) del seguente vettore virale AAV9 sono stati utilizzati per trattare i neuroni il secondo giorno in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, numero di catalogo 105530-AAV9) e AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numero di catalogo 105545-AAV9).
Il DNA complementare (CDN) di Mfn1 e Mfn2 del topo (ottenuto rispettivamente dai plasmidi Addgene n. 23212 e n. 23213) è marcato con la sequenza V5 (GKPIPNPLLGLDST) all'estremità C-terminale ed è fuso con mCherry in fase attraverso la sequenza T2A. Grx1-roGFP2 è un dono di Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Sostituendo la cassetta tdTomato con metodi di clonazione convenzionali, la cassetta è stata subclonata nel vettore pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numero di riferimento Addgene 28306) per generare i vettori pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 e pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Una strategia simile è stata utilizzata per generare il vettore di controllo pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Per generare il costrutto AAV-shPCx, è necessario un vettore plasmidico AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), che contiene la sequenza di DNA che codifica per l'shRNA mirato al PCx del topo (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Sotto il controllo del promotore U6, mCherry viene utilizzato sotto il controllo del promotore CMV. La produzione dei vettori AAV ausiliari è stata effettuata secondo le istruzioni del produttore (Cell Biolabs). In breve, utilizzare un plasmide di trasferimento contenente mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) Transfezione transitoria di cellule 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gene codificante, nonché codificante proteina del capside AAV1 e proteina accessoria Confezionamento del plasmide, utilizzando il metodo del fosfato di calcio. Il supernatante virale grezzo è stato ottenuto mediante cicli di congelamento-scongelamento in un bagno di ghiaccio secco/etanolo e cellule lisate in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Il vettore AAV è stato purificato mediante ultracentrifugazione con gradiente discontinuo di iodixanolo (24 ore a 32.000 rpm e 4°C) e concentrato utilizzando un filtro centrifugo Amicon ultra-15. Il titolo genomico di AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 copie genomiche (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX è stato come precedentemente descritto (54), misurato mediante PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) e AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
I neuroni primari sono stati raschiati in PBS 1x ghiacciato, centrifugati e quindi omogeneizzati in tampone di lisi PBS contenente 0,5% Triton X-100 / 0,5% deossicolato di sodio e inibitore di fosfatasi e proteasi (Roche). La quantificazione delle proteine ​​è stata eseguita utilizzando il saggio dell'acido bicinchoninico (Thermo Fisher Scientific). Le proteine ​​sono state quindi separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS e successivamente trasferite su una membrana di fluoruro di polivinilidene (GE Healthcare). Bloccare i siti non specifici e incubare con l'anticorpo primario (vedere la Tabella S1 per i dettagli) in latte al 5% in TBST (soluzione salina tamponata con Tris e Tween), fasi di lavaggio e anticorpo secondario in TBST. Incubare con l'anticorpo primario per tutta la notte a +4°C. Dopo il lavaggio, applicare l'anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente. Successivamente, incubando lo stesso blot con un anticorpo anti-β-actina, è stato confermato lo stesso caricamento. Rilevamento tramite conversione in chemiluminescenza e potenziamento della chemiluminescenza (GE Healthcare).
I neuroni precedentemente seminati su vetrini coprioggetto sono stati fissati con paraformaldeide al 4% (PFA)/PBS al punto temporale specificato a temperatura ambiente per 10 minuti. I vetrini coprioggetto sono stati prima permeabilizzati con Triton X-100 allo 0,1%/PBS per 5 minuti a temperatura ambiente, e poi in tampone di blocco [albumina di siero bovino (BSA) al 3%/PBS]. Il secondo giorno, i vetrini coprioggetto sono stati lavati con tampone di blocco e incubati con l'appropriato anticorpo secondario coniugato al fluoroforo per 2 ore a temperatura ambiente; infine, i campioni sono stati lavati accuratamente in PBS con 4′,6-diamidino-2 -fenilindolo (DAPI) e quindi fissati sul vetrino da microscopio con Aqua-Poly/Mount.
I topi (maschi e femmine) sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (130 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e somministrati per via sottocutanea con analgesico carprofene (5 mg/kg). Sono stati quindi posizionati in uno strumento stereotassico (Kopf) dotato di un tappetino riscaldante. Il cranio è stato esposto e, utilizzando un trapano dentale, è stata assottigliata la parte della corteccia cerebellare corrispondente all'osso temporale (da lambda: coda 1.8, laterale 1, corrispondente ai lobuli IV e V). Utilizzando un ago da siringa curvo, è stato praticato con cautela un piccolo foro nel cranio per evitare di danneggiare la vascolarizzazione sottostante. Successivamente, il sottile capillare di vetro viene inserito lentamente nel microforo (da -1,3 a -1 sul lato ventrale della dura madre) e 200-300 nl di AAV vengono iniettati nel microiniettore (Narishige) con siringhe manuali (Narishige) più volte a bassa pressione in un intervallo di tempo compreso tra 10 e 20 minuti. Dopo l'infusione, il capillare viene lasciato in sede per altri 10 minuti per consentire al virus di diffondersi completamente. Dopo la rimozione dei capillari, la cute viene suturata con cura per ridurre al minimo l'infiammazione della ferita e consentire all'animale di riprendersi. Gli animali sono stati trattati con analgesici (caspofen) per diversi giorni dopo l'intervento, durante i quali le loro condizioni fisiche sono state attentamente monitorate e quindi sono stati soppressi al momento stabilito. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida europee, nazionali e istituzionali e sono state approvate dal LandesamtfürNatur of Umwelt und Verbraucherschutz, Renania Settentrionale-Vestfalia, Germania.
Gli animali sono stati anestetizzati con ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e il cuore è stato perfuso prima con PBS 0,1 M e poi con PFA al 4% in PBS. Il tessuto è stato dissezionato e fissato in PFA/PBS al 4% per una notte a 4°C. Un coltello vibrante (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) è stato utilizzato per preparare sezioni sagittali (spessore 50 μm) dal cervello fissato in PBS. Salvo diversa indicazione, la colorazione delle sezioni flottanti è stata eseguita come descritto sopra (13) a temperatura ambiente e agitazione. In breve, prima, le fette ottenute sono state permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,5% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente; per alcuni epitopi (Pcx e Shmt2), riscaldando le fette in tampone tris-EDTA a 80°C (pH 9) per 25 minuti invece di questo passaggio. Successivamente, le sezioni sono state incubate con l'anticorpo primario (vedi Tabella S1) in tampone di blocco (3% BSA/PBS) a 4 °C per tutta la notte sotto agitazione. Il giorno seguente, le sezioni sono state lavate con tampone di blocco e incubate con l'appropriato anticorpo secondario coniugato con fluoroforo per 2 ore a temperatura ambiente; infine, le sezioni sono state lavate accuratamente in PBS, controcolorate con DAPI e quindi fissate con AquaPolymount su un vetrino da microscopio.
Per l'imaging del campione è stato utilizzato un microscopio confocale a scansione laser (TCS SP8-X o TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) dotato di un laser a luce bianca e di un laser a diodo ultravioletto 405. Eccitando il fluoroforo e raccogliendo il segnale con un rivelatore ibrido (HyDs), è stato utilizzato il software LAS-X per acquisire immagini impilate conformi al campionamento di Nyquist in modalità sequenziale: per pannelli non quantitativi, si utilizzano segnali altamente dinamici (ad esempio, nelle cellule somatiche e nei dendriti) mtYFP) Utilizzare HyD per rilevare il numero di PN in modalità BrightR). Viene applicato un gating da 0,3 a 6 ns per ridurre il rumore di fondo.
Acquisizione di immagini in tempo reale di cellule selezionate. Dopo la selezione in terreno Neurobasal-A contenente l'1% di supplemento B27 e 0,5 mM di GlutaMax, le cellule sono state immediatamente seminate su vetrini rivestiti di poli-L-lisina (μ-Slide8 Well, Ibidi, numero di catalogo 80826) e mantenute a 37°C e 5% di CO2 per 1 ora per consentire alle cellule di aderire. L'acquisizione delle immagini in tempo reale è stata effettuata con un microscopio confocale a scansione laser Leica SP8 dotato di laser bianco, HyD, obiettivo a immersione in olio 63× [apertura numerica (NA) 1,4] e piastra riscaldante.
Il topo è stato rapidamente anestetizzato con anidride carbonica e decapitato, il cervello è stato rapidamente rimosso dal cranio e tagliato in sezioni sagittali di 200 μm di spessore (per l'esperimento di marcatura con 13C) o 275 μm di spessore (per gli esperimenti a due fotoni) riempite con i seguenti materiali: Il gelato (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) è riempito con le seguenti sostanze: 125 mM di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) ghiacciato, saturo di carbonio (95% O2 e 5% CO2) a basso contenuto di Ca2+ NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucosio, 0,5 mM CaCl2 e 3,5 mM MgCl2 (pressione osmotica da 310 a 330 mmol). Trasferire le fette cerebrali ottenute in una camera di pre-incubazione contenente ACSF ad alto contenuto di Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio, 1,0 mM CaCl2 e 2,0 mM MgCl2) Medium) pH 7,4 e da 310 a 320 mmol).
Durante il processo di imaging, le sezioni sono state spostate in una sala di imaging dedicata e l'esperimento è stato condotto sotto perfusione continua di ACSF a una temperatura costante di 32-33 °C. Per l'imaging delle sezioni è stato utilizzato un microscopio a scansione laser multifotone (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) dotato di un obiettivo Leica 25x (NA 0,95, acqua), laser Ti: Zaffiro (Chameleon Vision II, Coherent) e modulo FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM di Grx1-roGFP2. Le variazioni dello stato redox citoplasmatico dei neuroni piramidali (PN) sono state misurate mediante FLIM a due fotoni in sezioni cerebrali sagittali, dove il biosensore Grx1-roGFP2 era mirato ai PN. Nello strato dei PN, il campo di acquisizione è stato selezionato a circa 50-80 μm al di sotto della superficie della sezione per garantire la presenza di un PN vitale (ovvero, l'assenza di struttura a perline o cambiamenti morfologici neuronali lungo i dendriti) e del doppio sensore roGFP2 positivo e dell'AAV codificante shRNA PCx o la sua sequenza di controllo (ciascuno co-esprimente mCherry). Acquisizione di immagini a singolo stack con zoom digitale 2x [lunghezza d'onda di eccitazione: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Rilevamento: HyD interno, gruppo di filtri isotiocianato di fluoresceina (FITC)] e media delle immagini entro 2-3 minuti vengono utilizzati per garantire che vengano raccolti abbastanza fotoni (1000 fotoni in totale) per l'adattamento della curva. La sensibilità della sonda Grx1-roGFP2 e la verifica delle condizioni FLIM sono state eseguite monitorando il valore della durata di vita di roGFP2 quando si aggiunge H2O2 esogeno 10 mM all'ACSF di perfusione (per massimizzare l'ossidazione, con conseguente aumento della durata di vita), e quindi si aggiunge ditiotreitolo 2 mM (minimizza il grado di riduzione, con conseguente diminuzione della durata di vita) (Figura S8, da D a G). Utilizzare il software FLIMfit 5.1.1 per analizzare i risultati acquisiti, adattare la curva di decadimento esponenziale singola dell'intera immagine all'IRF (funzione di risposta dello strumento) misurata e χ2 è approssimativamente 1. Per calcolare la durata di vita di un singolo PN, la maschera attorno al corpo del nervo è stata disegnata manualmente e la durata di vita media in ciascuna maschera è stata utilizzata per la quantificazione.
Analisi del potenziale mitocondriale. Dopo che la sezione acuta è stata incubata con 100 nM di TMRM aggiunto direttamente all'ACSF perfuso per 30 minuti, le variazioni del potenziale mitocondriale dei PN sono state misurate con un microscopio a due fotoni. L'imaging del TMRM è stato eseguito eccitando la sonda a 920 nm e utilizzando un HyD interno (isotiocianato di tetrametilrodamina: 585/40 nm) per raccogliere i segnali; utilizzando la stessa lunghezza d'onda di eccitazione ma un diverso HyD interno (FITC: 525/50) per visualizzare mtYFP. Utilizzare il plug-in Image Calculator di ImageJ per valutare il potenziale mitocondriale a livello di singola cellula. In breve, l'equazione del plug-in: segnale = min (mtYFP, TMRM) viene utilizzata per identificare la regione mitocondriale che mostra il segnale TMRM nelle cellule Purkinje Somali nell'immagine confocale a singolo stack del canale corrispondente. Successivamente, l'area dei pixel nella maschera risultante viene quantificata e quindi normalizzata rispetto alla corrispondente immagine single-stack di soglia del canale mtYFP per ottenere la frazione mitocondriale che mostra il potenziale mitocondriale.
L'immagine è stata deconvoluta con il software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Per le immagini scansionate delle piastrelle, il montaggio di una singola piastrella è stato realizzato utilizzando l'algoritmo di stitching automatico fornito dal software LAS-X. Dopo la calibrazione dell'immagine, sono stati utilizzati ImageJ e Adobe Photoshop per elaborare ulteriormente l'immagine e regolare uniformemente luminosità e contrasto. Adobe Illustrator è stato utilizzato per la preparazione grafica.
Analisi dei focolai di mtDNA. Il numero di lesioni del mtDNA è stato quantificato su sezioni cerebellari marcate con anticorpi anti-DNA mediante microscopia confocale. Per ogni cellula è stata creata un'area target, corrispondente al corpo cellulare e al nucleo, e la rispettiva area è stata calcolata utilizzando il plug-in Multi Measure (software ImageJ). L'area del nucleo è stata sottratta dall'area del corpo cellulare per ottenere l'area citoplasmatica. Infine, il plug-in Analyze Particles (software ImageJ) è stato utilizzato per quantificare automaticamente i punti di DNA citoplasmatico indicativi di mtDNA sull'immagine di soglia, e i risultati ottenuti sono stati normalizzati rispetto alla media dei nucleosidi per cellula (PN) dei topi di controllo (CTRL). I risultati sono espressi come numero medio di nucleosidi per cellula.
Analisi dell'espressione proteica. Utilizzare il plug-in Image Calculator di ImageJ per valutare l'espressione proteica nelle cellule PN a livello di singola cellula. In breve, nell'immagine confocale a singolo strato del canale corrispondente, tramite l'equazione: segnale = min (mtYFP, anticorpo), viene identificata la regione mitocondriale che mostra immunoreattività a un determinato anticorpo nelle cellule Purkina. Successivamente, viene quantificata l'area in pixel nella maschera risultante e quindi normalizzata sull'immagine a singolo stack di soglia corrispondente del canale mtYFP per ottenere la frazione mitocondriale della proteina visualizzata.
Analisi della densità delle cellule di Purkinje. Il plug-in Cell Counter di ImageJ è stato utilizzato per valutare la densità delle cellule di Purkinje dividendo il numero di cellule di Purkinje contate per la lunghezza dell'anello cerebellare occupato dalle cellule contate.
Preparazione e raccolta dei campioni. I cervelli del gruppo di controllo e dei topi Mfn2cKO sono stati fissati in PFA al 2%/glutaraldeide al 2,5% in tampone fosfato (PB) 0,1 M, quindi sono state preparate sezioni coronali utilizzando ciliati (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (spessore da 50 a 60 μm). Successivamente, sono stati fissati in tampone PB con tetrossido di sodio all'1% e ferrocianuro di potassio all'1,5% a temperatura ambiente per 1 ora. Le sezioni sono state lavate tre volte con acqua distillata e quindi colorate con etanolo al 70% contenente acetato di uranile all'1% per 20 minuti. Le sezioni sono state quindi disidratate in alcol a concentrazione crescente e incluse in resina epossidica Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, numero di catalogo 14040) tra vetrini rivestiti di silicio, e infine polimerizzate a 60°C in forno per 48 ore. È stata selezionata l'area della corteccia cerebellare e sono state tagliate sezioni ultrasottili di 50 nm con Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) e raccolte su una griglia di rame con fenditure di 2×1 mm rivestita con pellicola di polistirene. Le sezioni sono state colorate con una soluzione di acetato di uranile al 4% in H2O per 10 minuti, lavate più volte con H2O, quindi con citrato di piombo di Reynolds in H2O per 10 minuti e infine lavate più volte con H2O. Le microfotografie sono state acquisite con un microscopio elettronico a trasmissione Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) utilizzando una telecamera digitale TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Germania).
Per i topi infettati con AAV, il cervello è stato separato e sezionato in una sezione sagittale di 1 mm di spessore, e il cervelletto è stato esaminato al microscopio a fluorescenza per identificare l'anello infettato da AAV (ovvero, che esprime mCherry). Sono stati utilizzati solo gli esperimenti in cui l'iniezione di AAV ha determinato un'efficienza di trasduzione molto elevata dello strato di cellule di Purkinje (ovvero quasi l'intero strato) in almeno due anelli cerebellari consecutivi. L'anello trasdotto con AAV è stato microdissezionato per la post-fissazione notturna (4% PFA e 2,5% glutaraldeide in tampone cocoato 0,1 M) e ulteriormente processato. Per l'inclusione in EPON, il tessuto fissato è stato lavato con tampone cocoato di sodio 0,1 M (Applichem) e incubato con OsO4 al 2% (os, Science Services; Caco) in tampone cocoato di sodio 0,1 M (Applichem) per 4 ore, quindi lavato per 2 ore. Ripetere 3 volte con tampone cocamide 0,1 M. Successivamente, è stata utilizzata una serie crescente di soluzioni di etanolo per incubare ciascuna soluzione a 4°C per 15 minuti al fine di disidratare il tessuto. Il tessuto è stato trasferito in ossido di propilene e incubato per una notte in EPON (Sigma-Aldrich) a 4°C. Il tessuto è stato quindi posto in EPON fresco a temperatura ambiente per 2 ore e successivamente incluso a 62°C per 72 ore. Utilizzando un ultramicrotomo (Leica Microsystems, UC6) e una lama di diamante (Diatome, Biel, Svizzera), sono state tagliate sezioni ultrasottili di 70 nm, colorate con acetato di uranile all'1,5% per 15 minuti a 37°C e con una soluzione di citrato di piombo per 4 minuti. Le micrografie elettroniche sono state acquisite utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione JEM-2100 Plus (JEOL) dotato di telecamera OneView 4K a 16 bit (Gatan) e software DigitalMicrograph (Gatan). Per l'analisi, sono state acquisite micrografie elettroniche con zoom digitale 5000× o 10.000×.
Analisi morfologica dei mitocondri. Per tutte le analisi, i contorni dei singoli mitocondri sono stati delineati manualmente nelle immagini digitali utilizzando il software ImageJ. Sono stati analizzati diversi parametri morfologici. La densità mitocondriale è espressa in percentuale, ottenuta dividendo l'area mitocondriale totale di ciascuna cellula per l'area del citoplasma (area del citoplasma = area della cellula - area del nucleo cellulare) × 100. La rotondità dei mitocondri è calcolata con la formula [4π∙(area/perimetro²)]. La morfologia ista dei mitocondri è stata analizzata e suddivisa in due categorie ("tubulare" e "a bolla") in base alla loro forma principale.
Analisi del numero e della densità di autofagosomi/lisosomi. Utilizzare il software ImageJ per delineare manualmente i contorni di ciascun autofagosoma/lisosoma nell'immagine digitale. L'area degli autofagosomi/lisosomi è espressa in percentuale, calcolata dividendo l'area totale delle strutture autofagosomiali/lisosomiali di ciascuna cellula per l'area del citoplasma (area del citoplasma = area della cellula - area del nucleo) × 100. La densità degli autofagosomi/lisosomi è calcolata dividendo il numero totale per il numero di strutture autofagosomiali/lisosomiali per cellula (in termini di area citoplasmatica) (area del citoplasma = area della cellula - area del nucleo).
Etichettatura per sezionamento acuto e preparazione del campione. Per gli esperimenti che richiedono l'etichettatura del glucosio, trasferire le fette cerebrali acute in una camera di pre-incubazione contenente carbonio saturo (95% O2 e 5% CO2), ACSF ad alto Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio, 1,0 mM CaCl2 e 2,0 mM MgCl2, aggiustato a pH 7,4 e da 310 a 320 mOsm), in cui il glucosio è una sostituzione con 13C 6-glucosio (Eurisotop, numero di catalogo CLM-1396). Per gli esperimenti che richiedono la marcatura con piruvato, trasferire le fette cerebrali acute in una soluzione ACSF ad alto contenuto di Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio, 1,0 mM CaCl2 e aggiungere 2,0 mM MgCl2, regolare a pH 7,4 e 310-320 mOsm) e aggiungere 1 mM di 1-[1-13C]piruvato (Eurisotop, numero di catalogo CLM-1082). Incubare le sezioni per 90 minuti a 37 °C. Al termine dell'esperimento, le sezioni sono state lavate rapidamente con una soluzione acquosa (pH 7,4) contenente 75 mM di carbonato di ammonio, quindi omogeneizzate in una miscela 40:40:20 (v:v:v) di acetonitrile (ACN), metanolo e acqua. Dopo un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio, i campioni sono stati centrifugati a 21.000 g per 10 minuti a 4°C e il surnatante limpido è stato essiccato in un concentratore SpeedVac. Il pellet di metaboliti essiccato risultante è stato conservato a -80°C fino all'analisi.
Analisi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa di 13 amminoacidi marcati con C. Per l'analisi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), il pellet di metaboliti è stato risospeso in 75 μl di acqua di grado LC-MS (Honeywell). Dopo centrifugazione a 21.000 g per 5 minuti a 4 °C, 20 μl del surnatante chiarificato sono stati utilizzati per l'analisi del flusso di amminoacidi, mentre il resto dell'estratto è stato immediatamente utilizzato per l'analisi degli anioni (vedi sotto). L'analisi degli amminoacidi è stata eseguita utilizzando il protocollo di derivatizzazione con cloruro di benzoile precedentemente descritto (55, 56). Nella prima fase, 10 μl di carbonato di sodio 100 mM (Sigma-Aldrich) sono stati aggiunti a 20 μl di estratto di metaboliti, e quindi 10 μl di cloruro di benzoile al 2% (Sigma-Aldrich) sono stati aggiunti all'ACN di grado LC. Il campione è stato agitato brevemente con un vortex e quindi centrifugato a 21.000 g per 5 minuti a 20 °C. Il surnatante chiarificato è stato trasferito in una fiala per autocampionatore da 2 ml con inserto conico in vetro (volume di 200 μl). I campioni sono stati analizzati utilizzando il sistema LC ad altissime prestazioni Acquity iClass (Waters) collegato allo spettrometro di massa di precisione ad alta risoluzione Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Per l'analisi, 2 μl del campione derivatizzato sono stati iniettati in una colonna T3 in silice ad alta resistenza da 100 × 1,0 mm (Waters) contenente particelle da 1,8 μm. La velocità di flusso è di 100 μl/min e il sistema tampone è costituito dal tampone A (formiato di ammonio 10 mM e acido formico allo 0,15% in acqua) e dal tampone B (ACN). Il gradiente è il seguente: 0% B a 0 minuti; 0% B. Da 0 a 15% B da 0 a 0,1 minuti; da 15 a 17% B da 0,1 a 0,5 minuti; B da 17 a 55% da 0,5 a 14 minuti; B da 55 a 70% da 14 a 14,5 minuti; da 14,5 a 70 a 100% B a 18 minuti; 100% B da 18 a 19 minuti; da 100 a 0% B da 19 a 19,1 minuti; 0% B da 19,1 a 28 minuti (55, 56). Lo spettrometro di massa QE-HF opera in modalità di ionizzazione positiva con un intervallo di massa m/z (rapporto massa/carica) da 50 a 750. La risoluzione applicata è di 60.000, il target di ioni di controllo del guadagno (AGC) ottenuto è 3×10⁶ e il tempo massimo di ionizzazione è di 100 millisecondi. La sorgente di ionizzazione elettrospray riscaldata (ESI) opera a una tensione di spruzzo di 3,5 kV, una temperatura capillare di 250 °C, un flusso d'aria di guaina di 60 AU (unità arbitrarie) e un flusso d'aria ausiliario di 20 AU. 250 °C. La lente S è impostata a 60 AU.
Analisi mediante cromatografia anionica-MS di acidi organici marcati con 13C. Il precipitato metabolico rimanente (55 μl) è stato analizzato utilizzando un sistema di cromatografia ionica Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) collegato a uno spettrometro di massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). In breve, 5 μl di estratto metabolico sono stati iniettati in una colonna Dionex IonPac AS11-HC dotata di HPLC (2 mm × 250 mm, dimensione delle particelle 4 μm, Thermo Fisher Scientific) in modalità push-in partial loop con un rapporto di riempimento di 1. )on. Colonna di guardia Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). La temperatura della colonna è mantenuta a 30 °C e l'autocampionatore è impostato a 6 °C. Utilizzare una cartuccia di idrossido di potassio fornita con acqua deionizzata per generare un gradiente di idrossido di potassio attraverso il generatore di eluente. Separazione dei metaboliti a una velocità di flusso di 380 μl/min, applicando il seguente gradiente: da 0 a 3 minuti, 10 mM KOH; da 3 a 12 minuti, da 10 a 50 mM KOH; da 12 a 19 minuti, da 50 a 100 mM KOH; da 19 a 21 minuti, 100 mM KOH; da 21 a 21,5 minuti, da 100 a 10 mM KOH. La colonna è stata riequilibrata con 10 mM KOH per 8,5 minuti.
I metaboliti eluiti vengono combinati con un flusso supplementare di isopropanolo di 150 μl/min dopo la colonna e quindi diretti a uno spettrometro di massa ad alta risoluzione operante in modalità di ionizzazione negativa. Lo spettrometro di massa monitora l'intervallo di massa da m/z 50 a 750 con una risoluzione di 60.000. L'AGC è impostato a 1×10⁶ e il tempo massimo di ionizzazione è mantenuto a 100 ms. La sorgente ESI riscaldata è stata utilizzata con una tensione di nebulizzazione di 3,5 kV. Le altre impostazioni della sorgente ionica sono le seguenti: temperatura del capillare 275 °C; flusso del gas di rivestimento 60 AU; flusso del gas ausiliario 20 AU a 300 °C e impostazione della lente S a 60 AU.
Analisi dei dati dei metaboliti marcati con 13C. Utilizzare il software TraceFinder (versione 4.2, Thermo Fisher Scientific) per l'analisi dei dati del rapporto isotopico. L'identità di ciascun composto è stata verificata mediante un composto di riferimento affidabile e analizzata indipendentemente. Per eseguire l'analisi di arricchimento isotopico, l'area del cromatogramma ionico estratto (XIC) di ciascun isotopo 13C (Mn) è stata estratta da [M + H] +, dove n è il numero di atomi di carbonio del composto target, utilizzato per analizzare gli amminoacidi o [MH] + viene utilizzato per analizzare gli anioni. L'accuratezza di massa dell'XIC è inferiore a cinque parti per milione e l'accuratezza del RT è di 0,05 minuti. L'analisi di arricchimento viene eseguita calcolando il rapporto di ciascun isotopo rilevato rispetto alla somma di tutti gli isotopi del composto corrispondente. Questi rapporti sono forniti come valori percentuali per ciascun isotopo e i risultati sono espressi come arricchimento percentuale molare (MPE), come descritto in precedenza (42).
Il pellet di neuroni congelati è stato omogeneizzato in metanolo all'80% (v/v) ghiacciato, agitato con vortex e incubato a -20°C per 30 minuti. Agitare nuovamente il campione con vortex e mescolare a +4°C per 30 minuti. Il campione è stato centrifugato a 21.000 g per 5 minuti a 4°C, quindi il supernatante risultante è stato raccolto e essiccato utilizzando un concentratore SpeedVac a 25°C per l'analisi successiva. Come descritto sopra, l'analisi LC-MS è stata eseguita sugli amminoacidi delle cellule selezionate. Utilizzando TraceFinder (versione 4.2, Thermo Fisher Scientific), l'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando la massa monoisotopica di ciascun composto. La normalizzazione quantilica dei dati dei metaboliti è stata eseguita utilizzando il pacchetto software preprocessCore (57).
Preparazione delle fette. Il topo è stato rapidamente anestetizzato con anidride carbonica e decapitato, il cervello è stato rapidamente rimosso dal cranio e il coltello vibrante riempito di ghiaccio (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) è stato utilizzato per tagliarlo in sezioni sagittali da 300 a 375 μm Gassificazione a freddo del carbonio (95% O2 e 5% CO2) ACSF a basso Ca2 + (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio, 1,0 mM CaCl2 e 6,0 mM MgCl2 Regolare a pH 7,4 e da 310 a 330 mOsm). Trasferire le fette di cervello ottenute in una camera contenente una soluzione ACSF ad alto contenuto di Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfato di sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio, 4,0 mM CaCl2 e 3,5 mM MgCl2) a pH 7,4 e con un'osmolarità da 310 a 320 mOsm. Conservare le fette per 20-30 minuti in modo che possano essere ripristinate prima della registrazione.
Registrazione. Per tutte le registrazioni è stato utilizzato un tavolino per microscopio dotato di una camera di registrazione fissa e un obiettivo a immersione in acqua 20x (Scientifica). Le presunte cellule di Purkinje sono state identificate in base a (i) dimensioni del corpo, (ii) posizione anatomica nel cervelletto e (iii) espressione del gene reporter fluorescente mtYFP. La pipetta per patch clamp con una resistenza della punta da 5 a 11 megaohm è stata estratta tramite un capillare di vetro borosilicato (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Germania) e una pipetta orizzontale (Scientifica Instruments, P-1000, Novato, CA). Tutte le registrazioni sono state effettuate con un amplificatore per patch clamp ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Germania), controllato dal software Signal (versione 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Regno Unito). L'esperimento è stato registrato a una frequenza di campionamento di 12,5 kHz. Il segnale viene filtrato con due filtri passa-basso di Bessel con frequenze di taglio rispettivamente di 1,3 e 10 kHz. La capacità della membrana e della pipetta viene compensata dal circuito di compensazione tramite l'amplificatore. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti sotto il controllo di una telecamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Germania), controllata dal software Hokawo (versione 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germania).
Configurazione e analisi di routine della cellula intera. Immediatamente prima della registrazione, riempire la pipetta con la soluzione interna contenente le seguenti sostanze: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM gluconato di potassio, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM guanosina trifosfato (GTP) (Na) e 10,0 mM creatinina fosfato, il tutto regolato a pH 7,25 e con una pressione osmotica di 290 mOsm (saccarosio). Immediatamente dopo aver applicato una forza di 0 pA per rompere la membrana, è stato misurato il potenziale di membrana a riposo. La resistenza di ingresso è stata misurata applicando correnti iperpolarizzate di -40, -30, -20 e -10 pA. Misurare l'ampiezza della risposta di voltaggio e utilizzare la legge di Ohm per calcolare la resistenza di ingresso. L'attività spontanea è stata registrata in modalità voltage clamp per 5 minuti e l'sPSC è stata identificata e misurata in Igor Pro (versione 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) utilizzando uno script di riconoscimento semiautomatico. La curva I-V e la corrente allo stato stazionario sono state misurate bloccando la batteria a diversi potenziali (a partire da -110 mV) e aumentando la tensione a passi di 5 mV. La produzione di AP è stata testata applicando una corrente depolarizzante. Bloccare la cellula a -70 mV applicando un impulso di corrente depolarizzante. Regolare separatamente la dimensione del passo di ciascuna unità di registrazione (da 10 a 60 pA). Calcolare la frequenza massima di AP contando manualmente i picchi di impulso che causano la frequenza di AP più elevata. La soglia di AP è stata analizzata utilizzando la derivata seconda dell'impulso di depolarizzazione che innesca per primo uno o più AP.
Configurazione e analisi del patch perforato. Eseguire la registrazione del patch perforato utilizzando protocolli standard. Utilizzare una pipetta priva di ATP e GTP che non contenga i seguenti ingredienti: 128 mM di gluconato di potassio, 10 mM di KCl, 10 mM di Hepes, 0,1 mM di EGTA e 2 mM di MgCl2, e regolare il pH a 7,2 (utilizzando KOH). ATP e GTP sono omessi dalla soluzione intracellulare per prevenire una permeabilità incontrollata della membrana cellulare. La pipetta per patch è riempita con una soluzione intracellulare contenente amfotericina (circa 200-250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) per ottenere una registrazione del patch perforato. L'amfotericina è stata disciolta in dimetilsolfossido (concentrazione finale: 0,1-0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). La concentrazione di DMSO utilizzata non ha avuto effetti significativi sui neuroni studiati. Durante il processo di punching, la resistenza del canale (Ra) è stata monitorata continuamente e l'esperimento è stato avviato dopo che l'ampiezza di Ra e AP si è stabilizzata (20-40 minuti). L'attività spontanea è stata misurata in modalità voltage clamp e/o current clamp per 2-5 minuti. L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando Igor Pro (versione 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versione 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) e GraphPad Prism (versione 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, Stati Uniti). Per identificare i potenziali d'azione spontanei, è stato utilizzato il plug-in NeuroMatic v3.0c di IgorPro. I potenziali d'azione vengono identificati automaticamente utilizzando una determinata soglia, che viene regolata individualmente per ogni registrazione. Utilizzando l'intervallo tra gli spike, viene determinata la frequenza degli spike con la frequenza di spike istantanea massima e la frequenza di spike media.
Isolamento dei PN. Adattando il protocollo precedentemente pubblicato, i PN sono stati purificati dal cervelletto del topo in una fase specifica (58). In breve, il cervelletto è stato dissezionato e tritato in un mezzo di dissociazione ghiacciato [senza HBSS Ca2+ e Mg2+, integrato con 20 mM di glucosio, penicillina (50 U/ml) e streptomicina (0,05 mg/ml)], e quindi digerito il mezzo in papaina [HBSS, integrato con 1-cisteina·HCl (1 mg/ml), papaina (16 U/ml) e deossiribonucleasi I (DNasi I; 0,1 mg/ml)] Trattare per 30 minuti a 30°C. Innanzitutto lavare i tessuti in mezzo HBSS contenente muco d'uovo (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) e DNasi (0,1 mg/ml) a temperatura ambiente per prevenire la digestione enzimatica, e poi in mezzo HBSS contenente 20 mM di glucosio. Una delicata macinazione in HBSS, penicillina (50 U/ml), streptomicina (0,05 mg/ml) e DNasi (0,1 mg/ml) rilascia le singole cellule. La sospensione cellulare risultante è stata filtrata attraverso un filtro cellulare da 70 μm, quindi le cellule sono state sedimentate mediante centrifugazione (1110 rpm, 5 minuti, 4 °C) e risospese in mezzo di smistamento [HBSS, integrato con 20 mM di glucosio, 20% di siero fetale bovino, penicillina (50 U/ml) e streptomicina (0,05 mg/ml)]; Valutare la vitalità cellulare con ioduro di propidio e regolare la densità cellulare a 1×10⁶ - 2×10⁶ cellule/ml. Prima della citometria a flusso, la sospensione è stata filtrata attraverso un filtro cellulare da 50 μm.
Citometro a flusso. La separazione cellulare è stata eseguita a 4 °C utilizzando un citometro FACSAria III (BD Biosciences) e il software FACSDiva (BD Biosciences, versione 8.0.1). La sospensione cellulare è stata separata utilizzando un ugello da 100 μm a una pressione di 20 psi a una velocità di circa 2800 eventi/sec. Poiché i criteri di gating tradizionali (dimensioni cellulari, discriminazione bimodale e caratteristiche di scattering) non possono garantire il corretto isolamento dei neuroni PN da altri tipi cellulari, la strategia di gating è impostata sulla base del confronto diretto dell'intensità YFP e dell'autofluorescenza nei topi mitoYFP+ ​​e nei topi di controllo mitoYFP−. La YFP viene eccitata irradiando il campione con una linea laser a 488 nm e il segnale viene rilevato utilizzando un filtro passa-banda a 530/30 nm. Nei topi mitoYFP+, la forza relativa del gene reporter Rosa26-mitoYFP viene utilizzata anche per distinguere i frammenti di corpo neuronale e assone. Il 7-AAD viene eccitato con un laser giallo a 561 nm e rilevato con un filtro passa-banda a 675/20 nm per escludere le cellule morte. Per separare contemporaneamente gli astrociti, la sospensione cellulare è stata colorata con ACSA-2-APC, quindi il campione è stato irradiato con una linea laser a 640 nm e un filtro passa-banda a 660/20 nm è stato utilizzato per rilevare il segnale.
Le cellule raccolte sono state centrifugate (1110 rpm, 5 minuti, 4 °C) e conservate a -80 °C fino all'utilizzo. I topi Mfn2cKO e i loro cuccioli sono stati classificati lo stesso giorno per minimizzare la variabilità procedurale. La presentazione e l'analisi dei dati FACS sono state eseguite utilizzando il software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Come menzionato sopra (59), la PCR in tempo reale viene utilizzata per isolare il DNA dai neuroni selezionati per la successiva quantificazione del mtDNA. La linearità e la sensibilità di soglia sono state inizialmente testate eseguendo la qPCR su diversi numeri di cellule. In breve, raccogliere 300 PN in un tampone di lisi costituito da 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 e proteinasi K (200 ng/ml) e incubare a 55°C per 120 minuti. Le cellule sono state ulteriormente incubate a 95°C per 10 minuti per garantire la completa inattivazione della proteinasi K. Utilizzando una sonda TaqMan (Thermo Fisher) specifica per mt-Nd1, il mtDNA è stato misurato mediante PCR semi-quantitativa nel sistema 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). geni mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numero di catalogo Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numero di catalogo AIVI3E8) e 18S (Thermo Fisher Scientific, numero di catalogo Hs99999901_s1).
Preparazione del campione di proteoma. Riscaldando la soluzione a 95°C per 10 minuti e sonicando, nel tampone di lisi [6 M cloruro di guanidina, 10 mM tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato, 10 mM cloroacetamide e 100 mM tris-Lisare i pellet di neuroni congelati in HCl]. Su Bioruptor (Diagenode) per 10 minuti (30 secondi di impulso / 30 secondi di pausa). Il campione è stato diluito 1:10 in 20 mM tris-HCl (pH 8.0), miscelato con 300 ng di tripsina gold (Promega) e incubato per una notte a 37°C per ottenere una digestione completa. Il secondo giorno, il campione è stato centrifugato a 20.000 g per 20 minuti. Il supernatante è stato diluito con acido formico allo 0,1% e la soluzione è stata desalinizzata con StageTips autoprodotti. Il campione è stato essiccato in uno strumento SpeedVac (concentratore Eppendorf plus 5305) a 45 °C, e successivamente il peptide è stato sospeso in acido formico allo 0,1%. Tutti i campioni sono stati preparati simultaneamente dalla stessa persona. Per analizzare i campioni di astrociti, 4 μg di peptidi desalinizzati sono stati marcati con un tag di massa tandem (TMT10plex, numero di catalogo 90110, Thermo Fisher Scientific) con un rapporto peptide/reagente TMT di 1:20. Per la marcatura TMT, 0,8 mg di reagente TMT sono stati risospesi in 70 μl di ACN anidro e il peptide essiccato è stato ricostituito in 9 μl di TEAB 0,1 M (bicarbonato di trietilammonio), a cui sono stati aggiunti 7 μl di reagente TMT in ACN. La concentrazione era del 43,75%. Dopo 60 minuti di incubazione, la reazione è stata bloccata con 2 μl di idrossilammina al 5%. I peptidi marcati sono stati raccolti, essiccati, risospesi in 200 μl di acido formico (FA) allo 0,1%, divisi in due e quindi desalinizzati utilizzando StageTips autoprodotti. Utilizzando un cromatografo liquido ad altissime prestazioni UltiMate 3000, una delle due metà è stata frazionata su una colonna cromatografica Acquity da 1 mm x 150 mm riempita con particelle C18 da 130 Å e 1,7 μm (Waters, codice catalogo SKU: 186006935, Thermo Fisher Scientific). Separare i peptidi a una velocità di flusso di 30 μl/min, separare dall'1% al 50% di tampone B per 85 minuti con un gradiente graduale di 96 minuti, dal 50% al 95% di tampone B per 3 minuti, quindi 8 minuti per il 95% di tampone B; il tampone A è 5% ACN e 10 mM di bicarbonato di ammonio (ABC), e il tampone B è 80% ACN e 10 mM ABC. Raccogliere le frazioni ogni 3 minuti e combinarle in due gruppi (1 + 17, 2 + 18, ecc.) e asciugarle in una centrifuga sottovuoto.
Analisi LC-MS/MS. Per la spettrometria di massa, i peptidi (numero r119.aq) sono stati separati su una colonna analitica PicoFrit da 25 cm, con diametro interno di 75 μm (nuova lente obiettivo, codice articolo PF7508250) dotata di mezzo ReproSil-Pur 120 C18-AQ da 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), utilizzando EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germania). La colonna è stata mantenuta a 50 °C. I tamponi A e B sono rispettivamente acido formico allo 0,1% in acqua e acido formico allo 0,1% in ACN all'80%. I peptidi sono stati separati con un gradiente a gradini di 200 nl/min dal 6% al 31% di tampone B per 65 minuti e dal 31% al 50% di tampone B per 5 minuti. I peptidi eluiti sono stati analizzati su uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). La misurazione m/z del precursore peptidico è stata eseguita con una risoluzione di 120.000 nell'intervallo da 350 a 1500 m/z. Utilizzando un'energia di collisione normalizzata del 27%, il precursore più forte con uno stato di carica da 2 a 6 è stato selezionato per la scissione mediante dissociazione ad alta energia nella trappola C (HCD). Il tempo di ciclo è stato impostato a 1 s. Il valore m/z del frammento peptidico è stato misurato nella trappola ionica utilizzando il target AGC più piccolo di 5×10⁴ e un tempo di iniezione massimo di 86 ms. Dopo la frammentazione, il precursore è stato inserito nella lista di esclusione dinamica per 45 s. I peptidi marcati con TMT sono stati separati su una colonna Acclaim PepMap da 50 cm e 75 μm (Thermo Fisher Scientific, numero di catalogo 164942) e gli spettri di migrazione sono stati analizzati su uno spettrometro di massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) dotato di apparecchiatura FAIMS (High-Field Asymmetric Waveform Ions) (Thermo Fisher Scientific) operante a due tensioni di compensazione di -50 e -70 V. Per la misurazione del segnale ionico di report TMT è stato utilizzato MS3, selezionato in base al precursore di sincronizzazione. La separazione dei peptidi è stata effettuata su EASY-nLC 1200, utilizzando un'eluizione a gradiente lineare del 90%, con una concentrazione di tampone dal 6% al 31%; il tampone A era FA allo 0,1% e il tampone B era FA allo 0,1% e ACN all'80%. La colonna analitica è stata utilizzata a 50 °C. Utilizzare FreeStyle (versione 1.6, Thermo Fisher Scientific) per suddividere il file originale in base alla tensione di compensazione FAIMS.
Identificazione e quantificazione delle proteine. Utilizzando il motore di ricerca integrato Andromeda, i dati originali sono stati analizzati con MaxQuant versione 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Oltre alle sequenze della ricombinasi Cre e YFP ottenute da Aequorea victoria, sono stati ricercati gli spettri dei frammenti peptidici per la sequenza canonica e la sequenza dell'isoforma del proteoma di riferimento del topo (Proteome ID UP000000589, scaricato da UniProt nel maggio 2017). L'ossidazione della metionina e l'acetilazione N-terminale delle proteine ​​sono state impostate come modifiche variabili; la metilazione carbamoilica della cisteina è stata impostata come modifica fissa. I parametri di digestione sono impostati su "specificità" e "tripsina/P". Il numero minimo di peptidi e peptidi razor utilizzati per l'identificazione delle proteine ​​è 1; il numero minimo di peptidi unici è 0. Nelle condizioni di corrispondenza della mappa peptidica, il tasso di identificazione delle proteine ​​era 0,01. L'opzione "Secondo peptide" è abilitata. Utilizzare l'opzione "corrispondenza tra run" per trasferire le identificazioni riuscite tra diversi file originali. Utilizzare il conteggio del rapporto minimo LFQ 1 per la quantificazione label-free (LFQ) (60). L'intensità LFQ viene filtrata per almeno due valori validi in almeno un gruppo genotipico in ogni punto temporale ed è estrapolata da una distribuzione normale con una larghezza di 0,3 e spostamento verso il basso di 1,8. Utilizzare la piattaforma di calcolo Perseus (https://maxquant.net/perseus/) e R (https://r-project.org/) per analizzare i risultati LFQ. Per l'analisi dell'espressione differenziale è stato utilizzato un test t moderato a due vie del pacchetto software limma (61). L'analisi esplorativa dei dati è stata eseguita utilizzando ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally e pheatmap. I dati proteomici basati su TMT sono stati analizzati utilizzando MaxQuant versione 1.6.10.43. Cerca i dati proteomici grezzi nel database di proteomica umana di UniProt, scaricato a settembre 2018. L'analisi include il fattore di correzione della purezza isotopica fornito dal produttore. Utilizza limma in R per l'analisi dell'espressione differenziale. I dati originali, i risultati della ricerca nel database e il flusso di lavoro e i risultati dell'analisi dei dati sono tutti archiviati nell'alleanza ProteomeXchange tramite il repository partner PRIDE con l'identificativo del set di dati PXD019690.
Le annotazioni funzionali arricchiscono l'analisi. Lo strumento Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) è stato utilizzato per determinare la ricchezza dei termini di annotazione funzionale del set di dati a 8 settimane (Figura 1). In breve, l'elenco quantitativo delle proteine ​​ottenuto dall'analisi dei dati LC-MS/MS (spettrometria di massa tandem) viene utilizzato con i seguenti criteri di filtro: Mus musculus è selezionato come specie e background, e la categoria mostra il valore P corretto da Benjamini per l'arricchimento 0,05 o inferiore è considerato significativo. Per questo grafico, vengono mostrate le prime cinque categorie in eccesso in ciascun cluster in base al valore P corretto. Utilizzando il test t multiplo, utilizzando il programma di boost lineare a due stadi di Benjamini, Krieger e Yekutieli (Q = 5%), viene eseguita l'analisi dell'espressione proteica nel tempo sui candidati importanti identificati in ciascuna categoria e ogni riga viene analizzata separatamente. Non è necessario adottare una SD coerente.
Per confrontare i risultati di questo studio con i database pubblicati e generare un diagramma di Venn nella Figura 1, abbiamo combinato l'elenco quantitativo delle proteine ​​con le annotazioni di MitoCarta 2.0 (24). Utilizzare lo strumento online Disegna diagramma di Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) per generare il diagramma.
Per informazioni dettagliate sulle procedure statistiche utilizzate per l'analisi proteomica, si prega di fare riferimento alla sezione corrispondente di Materiali e Metodi. Per tutti gli altri esperimenti, informazioni dettagliate sono disponibili nella relativa legenda. Salvo diversa indicazione, tutti i dati sono espressi come media ± errore standard (SEM) e tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software GraphPad Prism 8.1.2.
Per consultare il materiale supplementare relativo a questo articolo, si prega di visitare il sito http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
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Di E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'analisi proteomica dei neuroni disfunzionali ha rivelato che vengono attivati ​​programmi metabolici per contrastare la neurodegenerazione.
Di E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'analisi proteomica dei neuroni disfunzionali ha rivelato che vengono attivati ​​programmi metabolici per contrastare la neurodegenerazione.
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