L'articolo fa parte del tema di ricerca "Tecnologie avanzate di biorisanamento e processi di riciclo di composti organici sintetici (SOC)". Visualizza tutti i 14 articoli
Gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) a basso peso molecolare, come il naftalene e i naftaleni sostituiti (metilnaftalene, acido naftoico, 1-naftil-N-metilcarbammato, ecc.), sono ampiamente utilizzati in vari settori industriali e sono genotossici, mutageni e/o cancerogeni per gli organismi. Questi composti organici sintetici (SOC) o xenobiotici sono considerati inquinanti prioritari e rappresentano una grave minaccia per l'ambiente globale e la salute pubblica. L'intensità delle attività umane (ad esempio, gassificazione del carbone, raffinazione del petrolio, emissioni dei veicoli e applicazioni agricole) determina la concentrazione, il destino e il trasporto di questi composti ubiquitari e persistenti. Oltre ai metodi di trattamento/rimozione fisici e chimici, tecnologie verdi ed ecocompatibili come il biorisanamento, che utilizzano microrganismi in grado di degradare completamente i POC o convertirli in sottoprodotti non tossici, sono emerse come un'alternativa sicura, economica e promettente. Diverse specie batteriche appartenenti ai phyla Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia e Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus e Paenibacillus) e Actinobacteria (Rhodococcus e Arthrobacter) presenti nel microbiota del suolo hanno dimostrato la capacità di degradare vari composti organici. Studi metabolici, genomica e analisi metagenomica ci aiutano a comprendere la complessità e la diversità cataboliche presenti in queste semplici forme di vita, che possono essere ulteriormente applicate per una biodegradazione efficiente. L'esistenza a lungo termine degli IPA ha portato all'emergere di nuovi fenotipi di degradazione attraverso il trasferimento genico orizzontale utilizzando elementi genetici come plasmidi, trasposoni, batteriofagi, isole genomiche ed elementi coniugativi integrativi. La biologia dei sistemi e l'ingegneria genetica di isolati specifici o comunità modello (consorzi) possono consentire un biorisanamento completo, rapido ed efficiente di questi IPA attraverso effetti sinergici. In questa revisione, ci concentriamo sui diversi percorsi metabolici e sulla diversità, sulla composizione e diversità genetica, nonché sulle risposte/adattamenti cellulari dei batteri che degradano il naftalene e i batteri sostituiti. Ciò fornirà informazioni ecologiche per l'applicazione in campo e l'ottimizzazione dei ceppi per un biorisanamento efficiente.
Il rapido sviluppo delle industrie (petrolchimica, agricoltura, farmaceutica, coloranti tessili, cosmetici, ecc.) ha contribuito alla prosperità economica globale e al miglioramento degli standard di vita. Questo sviluppo esponenziale ha portato alla produzione di un gran numero di composti organici sintetici (SOC), utilizzati per la fabbricazione di vari prodotti. Questi composti estranei o SOC includono idrocarburi policiclici aromatici (IPA), pesticidi, erbicidi, plastificanti, coloranti, prodotti farmaceutici, organofosfati, ritardanti di fiamma, solventi organici volatili, ecc. Vengono emessi nell'atmosfera, negli ecosistemi acquatici e terrestri, dove hanno impatti multidimensionali, causando effetti dannosi su varie bioforme attraverso l'alterazione delle proprietà fisico-chimiche e della struttura della comunità (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Molti inquinanti aromatici hanno impatti forti e distruttivi su molti ecosistemi intatti/punti caldi di biodiversità (ad esempio barriere coralline, calotte glaciali artiche/antartiche, laghi di alta montagna, sedimenti di acque profonde, ecc.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Recenti studi geomicrobiologici hanno dimostrato che la deposizione di materia organica sintetica (ad esempio inquinanti aromatici) e dei loro derivati ​​sulle superfici di strutture artificiali (ambiente costruito) (ad esempio siti del patrimonio culturale e monumenti in granito, pietra, legno e metallo) ne accelera il degrado (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Le attività umane possono intensificare e peggiorare il degrado biologico di monumenti ed edifici attraverso l'inquinamento atmosferico e i cambiamenti climatici (Liu et al. 2020). Questi contaminanti organici reagiscono con il vapore acqueo presente nell'atmosfera e si depositano sulla struttura, causando il degrado fisico e chimico del materiale. La biodegradazione è ampiamente riconosciuta come alterazione indesiderata dell'aspetto e delle proprietà dei materiali causata da organismi viventi che ne compromettono la conservazione (Pochon e Jaton, 1967). Un'ulteriore azione microbica (metabolismo) di questi composti può ridurre l'integrità strutturale, l'efficacia della conservazione e il valore culturale (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). D'altro canto, in alcuni casi, l'adattamento e la risposta microbica a queste strutture si sono rivelati benefici, poiché formano biofilm e altre croste protettive che riducono il tasso di decadimento/decomposizione (Martino, 2016). Pertanto, lo sviluppo di strategie di conservazione efficaci e sostenibili a lungo termine per monumenti in pietra, metallo e legno richiede una conoscenza approfondita dei processi chiave coinvolti in questo processo. Rispetto ai processi naturali (processi geologici, incendi boschivi, eruzioni vulcaniche, reazioni vegetali e batteriche), le attività umane determinano il rilascio di grandi volumi di idrocarburi policiclici aromatici (IPA) e altro carbonio organico (OC) negli ecosistemi. Molti IPA utilizzati in agricoltura (insetticidi e pesticidi come DDT, atrazina, carbaril, pentaclorofenolo, ecc.), nell'industria (petrolio greggio, fanghi/rifiuti petroliferi, plastiche derivate dal petrolio, PCB, plastificanti, detergenti, disinfettanti, fumiganti, profumi e conservanti), nei prodotti per la cura della persona (creme solari, disinfettanti, repellenti per insetti e muschi policiclici) e nelle munizioni (esplosivi come il 2,4,6-TNT) sono potenziali xenobiotici che potrebbero avere un impatto sulla salute del pianeta (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna e Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Questo elenco può essere ampliato per includere composti derivati ​​dal petrolio (oli combustibili, lubrificanti, asfalteni), bioplastiche ad alto peso molecolare e liquidi ionici (Amde et al., 2015). La Tabella 1 elenca vari inquinanti aromatici e le loro applicazioni in vari settori industriali. Negli ultimi anni, le emissioni antropiche di composti organici volatili, così come di anidride carbonica e altri gas serra, hanno iniziato ad aumentare (Dvorak et al., 2017). Tuttavia, gli impatti antropici superano significativamente quelli naturali. Inoltre, abbiamo scoperto che diversi composti organici volatili (SOC) persistono in molti contesti ambientali e sono stati identificati come inquinanti emergenti con effetti negativi sui biomi (Figura 1). Agenzie ambientali come l'Agenzia per la protezione ambientale degli Stati Uniti (USEPA) hanno incluso molti di questi inquinanti nella loro lista di priorità a causa delle loro proprietà citotossiche, genotossiche, mutagene e cancerogene. Pertanto, sono necessarie rigide normative sullo smaltimento e strategie efficaci per il trattamento/la rimozione dei rifiuti dagli ecosistemi contaminati. Vari metodi di trattamento fisico e chimico come la pirolisi, il trattamento termico ossidativo, l'aerazione dell'aria, la discarica, l'incenerimento, ecc. sono inefficaci e costosi e generano sottoprodotti corrosivi, tossici e difficili da trattare. Con la crescente consapevolezza ambientale globale, i microrganismi in grado di degradare questi inquinanti e i loro derivati ​​(come alogenati, nitro, alchilici e/o metilici) stanno attirando sempre più attenzione (Fennell et al., 2004; Haritash e Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). L'uso di questi microrganismi candidati indigeni, da soli o in colture miste (colonie), per la rimozione di inquinanti aromatici presenta vantaggi in termini di sicurezza ambientale, costi, efficienza, efficacia e sostenibilità. I ​​ricercatori stanno anche esplorando l'integrazione di processi microbici con metodi redox elettrochimici, in particolare i sistemi bioelettrochimici (BES), come tecnologia promettente per il trattamento/rimozione degli inquinanti (Huang et al., 2011). La tecnologia BES ha attirato sempre più attenzione grazie alla sua elevata efficienza, al basso costo, alla sicurezza ambientale, al funzionamento a temperatura ambiente, ai materiali biocompatibili e alla capacità di recuperare sottoprodotti preziosi (ad esempio, elettricità, carburante e prodotti chimici) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). L'avvento del sequenziamento genomico ad alto rendimento e di strumenti/metodi omici ha fornito una grande quantità di nuove informazioni sulla regolazione genetica, sulla proteomica e sulla flussomica delle reazioni di vari microrganismi degradatori. La combinazione di questi strumenti con la biologia dei sistemi ha ulteriormente migliorato la nostra comprensione della selezione e della messa a punto dei percorsi catabolici target nei microrganismi (ovvero, la progettazione metabolica) per ottenere una biodegradazione efficiente ed efficace. Per progettare strategie di biorisanamento efficaci utilizzando microrganismi candidati idonei, è necessario comprendere il potenziale biochimico, la diversità metabolica, la composizione genetica e l'ecologia (autoecologia/sinecologia) dei microrganismi.
Fig. 1. Fonti e percorsi degli IPA a basso peso molecolare attraverso vari ambienti e vari fattori che influenzano la biota. Le linee tratteggiate rappresentano le interazioni tra gli elementi dell'ecosistema.
In questa revisione, abbiamo cercato di riassumere i dati sulla degradazione di IPA semplici come naftalene e naftaleni sostituiti da parte di vari isolati batterici, analizzando le vie metaboliche e la diversità, gli enzimi coinvolti nella degradazione, la composizione/il contenuto genico e la diversità, le risposte cellulari e vari aspetti del biorisanamento. La comprensione dei livelli biochimici e molecolari aiuterà a identificare ceppi ospiti idonei e la loro ulteriore ingegneria genetica per un biorisanamento efficace di tali inquinanti prioritari. Ciò contribuirà allo sviluppo di strategie per la creazione di consorzi batterici sito-specifici per un biorisanamento efficace.
La presenza di un gran numero di composti aromatici tossici e pericolosi (che soddisfano la regola di Huckel 4n + 2π elettroni, n = 1, 2, 3, …) rappresenta una seria minaccia per vari comparti ambientali come aria, suolo, sedimenti e acque superficiali e sotterranee (Puglisi et al., 2007). Questi composti presentano anelli benzenici singoli (monociclici) o multipli (policiclici) disposti in forma lineare, angolare o a grappolo e mostrano stabilità (stabilità/instabilità) nell'ambiente grazie all'elevata energia di risonanza negativa e all'inerzia (inerzia), che può essere spiegata dalla loro idrofobicità e dallo stato ridotto. Quando l'anello aromatico viene ulteriormente sostituito da gruppi metilici (-CH3), carbossilici (-COOH), idrossilici (-OH) o solfonati (-HSO3), diventa più stabile, ha una maggiore affinità per le macromolecole ed è bioaccumulabile nei sistemi biologici (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Alcuni idrocarburi policiclici aromatici a basso peso molecolare (LMWAH), come il naftalene e i suoi derivati ​​[metilnaftalene, acido naftoico, naftalensolfonato e 1-naftil N-metilcarbammato (carbarile)], sono stati inclusi nell'elenco degli inquinanti organici prioritari dall'Agenzia per la protezione ambientale degli Stati Uniti come genotossici, mutageni e/o cancerogeni (Cerniglia, 1984). Il rilascio di questa classe di NM-IPA nell'ambiente può provocare il bioaccumulo di questi composti a tutti i livelli della catena alimentare, influenzando così la salute degli ecosistemi (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Le fonti e i percorsi degli IPA verso il biota avvengono principalmente attraverso la migrazione e le interazioni tra diverse componenti dell'ecosistema come suolo, acque sotterranee, acque superficiali, colture e atmosfera (Arey e Atkinson, 2003). La Figura 1 mostra le interazioni e la distribuzione di diversi IPA a basso peso molecolare negli ecosistemi e i loro percorsi verso il biota/l'esposizione umana. Gli IPA si depositano sulle superfici a causa dell'inquinamento atmosferico e attraverso la migrazione (deriva) delle emissioni dei veicoli, dei gas di scarico industriali (gassificazione del carbone, combustione e produzione di coke) e la loro deposizione. Attività industriali come la produzione di tessuti sintetici, coloranti e vernici; la conservazione del legno; la lavorazione della gomma; le attività di produzione del cemento; la produzione di pesticidi; e le applicazioni agricole sono le principali fonti di IPA nei sistemi terrestri e acquatici (Bamforth e Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Studi hanno dimostrato che i suoli nelle aree suburbane e urbane, in prossimità di autostrade e nelle grandi città sono più sensibili agli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) a causa delle emissioni di centrali elettriche, riscaldamento residenziale, carichi di traffico aereo e stradale e attività di costruzione (Suman et al., 2016). (2008) hanno dimostrato che gli IPA nei suoli in prossimità delle strade di New Orleans, Louisiana, USA raggiungevano i 7189 μg/kg, mentre negli spazi aperti raggiungevano solo i 2404 μg/kg. Analogamente, livelli di IPA fino a 300 μg/kg sono stati segnalati in aree vicine a siti di gassificazione del carbone in diverse città degli Stati Uniti (Kanaly e Harayama, 2000; Bamforth e Singleton, 2005). È stato segnalato che i suoli di diverse città indiane come Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni e Venkataraman, 2000) e Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) contengono elevate concentrazioni di IPA. I composti aromatici vengono adsorbiti più facilmente sulle particelle del suolo, sulla materia organica e sui minerali argillosi, diventando così importanti serbatoi di carbonio negli ecosistemi (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Le principali fonti di IPA negli ecosistemi acquatici sono le precipitazioni (umide/secche e vapore acqueo), il deflusso urbano, lo scarico delle acque reflue, la ricarica delle falde acquifere, ecc. (Srogi, 2007). Si stima che circa l'80% degli IPA negli ecosistemi marini derivi da precipitazioni, sedimentazioni e scarichi di rifiuti (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Concentrazioni più elevate di IPA nelle acque superficiali o nel percolato proveniente dai siti di smaltimento dei rifiuti solidi finiscono per riversarsi nelle falde acquifere, rappresentando una grave minaccia per la salute pubblica, poiché oltre il 70% della popolazione dell'Asia meridionale e sud-orientale beve acqua di falda (Duttagupta et al., 2019). Un recente studio di Duttagupta et al. (2020) sulle analisi dei fiumi (32) e delle falde acquifere (235) del Bengala Occidentale, in India, ha rilevato che circa il 53% dei residenti urbani e il 44% dei residenti rurali (per un totale di 20 milioni di residenti) potrebbero essere esposti al naftalene (4,9-10,6 μg/L) e ai suoi derivati. I modelli differenziali di utilizzo del suolo e l'aumento dell'estrazione delle acque sotterranee sono considerati i principali fattori che controllano il trasporto verticale (advezione) degli IPA a basso peso molecolare nel sottosuolo. È stato riscontrato che il deflusso agricolo, gli scarichi di acque reflue urbane e industriali e gli scarichi di rifiuti solidi/rifiuti sono influenzati dagli IPA nei bacini fluviali e nei sedimenti sotterranei. Le precipitazioni atmosferiche aggravano ulteriormente l'inquinamento da IPA. Elevate concentrazioni di IPA e dei loro derivati ​​alchilici (51 in totale) sono state segnalate in fiumi/bacini idrografici in tutto il mondo, come i fiumi Fraser, Louan, Denso, Missouri, Anacostia, Ebro e Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Nei sedimenti del bacino del fiume Gange, naftalene e fenantrene sono risultati i più significativi (rilevati nel 70% dei campioni) (Duttagupta et al., 2019). Inoltre, studi hanno dimostrato che la clorazione dell'acqua potabile può portare alla formazione di IPA ossigenati e clorurati più tossici (Manoli e Samara, 1999). Gli IPA si accumulano nei cereali, nella frutta e nella verdura a causa dell'assorbimento da parte delle piante da terreni, falde acquifere e precipitazioni contaminati (Fismes et al., 2002). Molti organismi acquatici come pesci, cozze, vongole e gamberi sono contaminati da IPA attraverso il consumo di cibo e acqua di mare contaminati, nonché attraverso tessuti e pelle (Mackay e Fraser, 2000). Anche metodi di cottura/lavorazione come grigliatura, arrostimento, affumicatura, frittura, essiccazione, cottura al forno e cottura a carbone possono portare alla presenza di quantità significative di IPA negli alimenti. Ciò dipende in larga misura dalla scelta del materiale di affumicatura, dal contenuto di idrocarburi fenolici/aromatici, dalla procedura di cottura, dal tipo di riscaldatore, dal contenuto di umidità, dall'apporto di ossigeno e dalla temperatura di combustione (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) sono stati rilevati anche nel latte a concentrazioni variabili (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). L'accumulo di questi IPA negli alimenti dipende anche dalle proprietà fisico-chimiche degli stessi, mentre i loro effetti tossici sono correlati alle funzioni fisiologiche, all'attività metabolica, all'assorbimento, alla distribuzione e alla distribuzione corporea (Mechini et al., 2011).
La tossicità e gli effetti nocivi degli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) sono noti da tempo (Cherniglia, 1984). Gli idrocarburi policiclici aromatici a basso peso molecolare (IPA-LMW) (da due a tre anelli) possono legarsi covalentemente a varie macromolecole come DNA, RNA e proteine ​​e sono cancerogeni (Santarelli et al., 2008). A causa della loro natura idrofobica, sono separati da membrane lipidiche. Nell'uomo, le monoossigenasi del citocromo P450 ossidano gli IPA a epossidi, alcuni dei quali sono altamente reattivi (ad esempio, l'epossido di baediolo) e possono portare alla trasformazione di cellule normali in cellule maligne (Marston et al., 2001). Inoltre, i prodotti di trasformazione degli IPA come chinoni, fenoli, epossidi, dioli, ecc. sono più tossici dei composti originari. Alcuni IPA e i loro intermedi metabolici possono influenzare gli ormoni e vari enzimi coinvolti nel metabolismo, influenzando negativamente la crescita, il sistema nervoso centrale, il sistema riproduttivo e quello immunitario (Swetha e Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). È stato riportato che l'esposizione a breve termine a IPA a basso peso molecolare causa compromissione della funzionalità polmonare e trombosi negli asmatici e aumenta il rischio di tumori della pelle, dei polmoni, della vescica e del tratto gastrointestinale (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Studi sugli animali hanno inoltre dimostrato che l'esposizione agli IPA può avere effetti negativi sulla funzione riproduttiva e sullo sviluppo e può causare cataratta, danni renali ed epatici e ittero. È stato dimostrato che vari prodotti di biotrasformazione degli IPA, come dioli, epossidi, chinoni e radicali liberi (cationi), formano addotti al DNA. È stato dimostrato che gli addotti stabili alterano il meccanismo di replicazione del DNA, mentre gli addotti instabili possono depurinare il DNA (principalmente in adenina e talvolta in guanina); entrambi possono generare errori che portano a mutazioni (Schweigert et al. 2001). Inoltre, i chinoni (benzo-/pan-) possono generare specie reattive dell'ossigeno (ROS), causando danni fatali al DNA e ad altre macromolecole, compromettendo così la funzionalità/vitalità dei tessuti (Ewa e Danuta 2017). È stato segnalato che l'esposizione cronica a basse concentrazioni di pirene, bifenile e naftalene causa cancro negli animali da esperimento (Diggs et al. 2012). A causa della loro tossicità letale, la bonifica/rimozione di questi IPA dai siti interessati/contaminati è una priorità.
Per rimuovere gli IPA da siti/ambienti contaminati sono stati utilizzati diversi metodi fisici e chimici. Processi come l'incenerimento, la declorazione, l'ossidazione UV, la fissazione e l'estrazione con solvente presentano numerosi svantaggi, tra cui la formazione di sottoprodotti tossici, la complessità del processo, problemi di sicurezza e normativi, scarsa efficienza e costi elevati. Tuttavia, la biodegradazione microbica (detta biorisanamento) è un approccio alternativo promettente che prevede l'uso di microrganismi sotto forma di colture pure o colonie. Rispetto ai metodi fisici e chimici, questo processo è ecologico, non invasivo, conveniente e sostenibile. La biorisanamento può essere effettuata nel sito interessato (in situ) o in un sito appositamente preparato (ex situ) ed è quindi considerata un metodo di bonifica più sostenibile rispetto ai metodi fisici e chimici tradizionali (Juhasz e Naidu, 2000; Andreoni e Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
La comprensione dei passaggi metabolici microbici coinvolti nella degradazione degli inquinanti aromatici ha enormi implicazioni scientifiche ed economiche per la sostenibilità ecologica e ambientale. Si stima che 2,1×1018 grammi di carbonio (C) siano immagazzinati nei sedimenti e nei composti organici (ovvero petrolio, gas naturale e carbone, ovvero combustibili fossili) in tutto il mondo, contribuendo in modo significativo al ciclo globale del carbonio. Tuttavia, la rapida industrializzazione, l'estrazione di combustibili fossili e le attività umane stanno esaurendo queste riserve di carbonio litosferiche, rilasciando nell'atmosfera circa 5,5×1015 g di carbonio organico (come inquinanti) ogni anno (Gonzalez-Gaya et al., 2019). La maggior parte di questo carbonio organico entra negli ecosistemi terrestri e marini attraverso la sedimentazione, il trasporto e il deflusso. Inoltre, i nuovi inquinanti sintetici derivati ​​dai combustibili fossili, come la plastica, i plastificanti e gli stabilizzanti della plastica (ftalati e i loro isomeri), inquinano gravemente gli ecosistemi marini, del suolo e acquatici e il loro biota, aggravando così i rischi climatici globali. Vari tipi di microplastiche, nanoplastiche, frammenti di plastica e i loro monomeri tossici derivati ​​dal polietilene tereftalato (PET) si sono accumulati nell'Oceano Pacifico tra il Nord America e il Sud-est asiatico, formando la "Great Pacific Garbage Patch", con conseguenti danni alla vita marina (Newell et al., 2020). Studi scientifici hanno dimostrato che non è possibile rimuovere tali inquinanti/rifiuti con metodi fisici o chimici. In questo contesto, i microrganismi più utili sono quelli in grado di metabolizzare ossidativamente gli inquinanti in anidride carbonica, energia chimica e altri sottoprodotti non tossici che alla fine entrano in altri processi del ciclo dei nutrienti (H, O, N, S, P, Fe, ecc.). Pertanto, comprendere l'ecofisiologia microbica della mineralizzazione degli inquinanti aromatici e il suo controllo ambientale è fondamentale per valutare il ciclo microbico del carbonio, il bilancio netto del carbonio e i futuri rischi climatici. Data l'urgente necessità di rimuovere tali composti dall'ambiente, sono emerse diverse eco-industrie focalizzate sulle tecnologie pulite. In alternativa, la valorizzazione dei rifiuti industriali/sostanze chimiche di scarto accumulate negli ecosistemi (ovvero l'approccio "waste to wealth") è considerata uno dei pilastri dell'economia circolare e degli obiettivi di sviluppo sostenibile (Close et al., 2012). Pertanto, comprendere gli aspetti metabolici, enzimatici e genetici di questi potenziali candidati alla degradazione è di fondamentale importanza per l'efficace rimozione e biorisanamento di tali inquinanti aromatici.
Tra i numerosi inquinanti aromatici, prestiamo particolare attenzione agli IPA a basso peso molecolare come il naftalene e i naftaleni sostituiti. Questi composti sono componenti principali di combustibili derivati ​​dal petrolio, coloranti tessili, prodotti di consumo, pesticidi (naftalina e repellenti per insetti), plastificanti e tannini e sono quindi diffusi in molti ecosistemi (Preuss et al., 2003). Recenti studi evidenziano l'accumulo di concentrazioni di naftalene nei sedimenti delle falde acquifere, nelle acque sotterranee e nei suoli del sottosuolo, nelle zone vadose e nei letti dei fiumi, suggerendo il suo bioaccumulo nell'ambiente (Duttagupta et al., 2019, 2020). La Tabella 2 riassume le proprietà fisico-chimiche, le applicazioni e gli effetti sulla salute del naftalene e dei suoi derivati. Rispetto ad altri IPA ad alto peso molecolare, il naftalene e i suoi derivati ​​sono meno idrofobici, più solubili in acqua e ampiamente distribuiti negli ecosistemi, pertanto vengono spesso utilizzati come substrati modello per studiare il metabolismo, la genetica e la diversità metabolica degli IPA. Un gran numero di microrganismi è in grado di metabolizzare il naftalene e i suoi derivati ​​e sono disponibili informazioni complete sui loro percorsi metabolici, enzimi e caratteristiche regolatorie (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Inoltre, il naftalene e i suoi derivati ​​sono designati come composti prototipo per la valutazione dell'inquinamento ambientale grazie alla loro elevata abbondanza e biodisponibilità. L'Agenzia per la Protezione Ambientale degli Stati Uniti stima che i livelli medi di naftalene siano pari a 5,19 μg per metro cubo nel fumo di sigaretta, principalmente da combustione incompleta, e da 7,8 a 46 μg nel fumo collaterale, mentre l'esposizione a creosoto e naftalene è da 100 a 10.000 volte superiore (Preuss et al. 2003). In particolare, è stato riscontrato che il naftalene presenta tossicità respiratoria e cancerogenicità specifiche per specie, regione e sesso. Sulla base di studi su animali, l'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) ha classificato il naftalene come "possibile cancerogeno per l'uomo" (Gruppo 2B)1. L'esposizione ai naftaleni sostituiti, principalmente per inalazione o somministrazione parenterale (orale), causa lesioni ai tessuti polmonari e aumenta l'incidenza di tumori polmonari nei ratti e nei topi (National Toxicology Program 2). Gli effetti acuti includono nausea, vomito, dolore addominale, diarrea, mal di testa, confusione, sudorazione profusa, febbre, tachicardia, ecc. D'altro canto, l'insetticida carbammato ad ampio spettro carbaryl (1-naftil N-metilcarbammato) è stato segnalato come tossico per invertebrati acquatici, anfibi, api mellifere ed esseri umani e ha dimostrato di inibire l'acetilcolinesterasi causando paralisi (Smulders et al., 2003; Bulen e Distel, 2011). Pertanto, la comprensione dei meccanismi di degradazione microbica, della regolazione genetica e delle reazioni enzimatiche e cellulari è fondamentale per lo sviluppo di strategie di biorisanamento in ambienti contaminati.
Tabella 2. Informazioni dettagliate sulle proprietà fisico-chimiche, gli usi, i metodi di identificazione e le malattie associate al naftalene e ai suoi derivati.
Nelle nicchie inquinate, gli inquinanti aromatici idrofobici e lipofili possono causare una varietà di effetti cellulari sul microbioma ambientale (comunità), come alterazioni della fluidità e della permeabilità della membrana, rigonfiamento del doppio strato lipidico, interruzione del trasferimento di energia (catena di trasporto degli elettroni/forza motrice protonica) e dell'attività delle proteine ​​associate alla membrana (Sikkema et al., 1995). Inoltre, alcuni intermedi solubili come catecoli e chinoni generano specie reattive dell'ossigeno (ROS) e formano addotti con DNA e proteine ​​(Penning et al., 1999). Pertanto, l'abbondanza di tali composti negli ecosistemi esercita una pressione selettiva sulle comunità microbiche affinché diventino efficienti degradatori a vari livelli fisiologici, tra cui assorbimento/trasporto, trasformazione intracellulare, assimilazione/utilizzo e compartimentalizzazione.
Una ricerca del Ribosomal Database Project-II (RDP-II) ha rivelato che un totale di 926 specie batteriche sono state isolate da terreni o colture di arricchimento contaminate con naftalene o suoi derivati. Il gruppo Proteobacteria presentava il numero più elevato di rappresentanti (n = 755), seguito da Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) e batteri non classificati (8) (Figura 2). I rappresentanti di γ-Proteobacteria (Pseudomonadales e Xanthomonadales) dominavano tutti i gruppi Gram-negativi con elevato contenuto di G+C (54%), mentre Clostridiales e Bacillales (30%) erano gruppi Gram-positivi con basso contenuto di G+C. È stato segnalato che Pseudomonas (il numero più elevato, 338 specie) è in grado di degradare il naftalene e i suoi derivati ​​metilici in vari ecosistemi inquinati (catrame di carbone, petrolio, petrolio greggio, fanghi, fuoriuscite di petrolio, acque reflue, rifiuti organici e discariche) e in ecosistemi intatti (suolo, fiumi, sedimenti e falde acquifere) (Figura 2). Inoltre, studi di arricchimento e analisi metagenomica di alcune di queste regioni hanno rivelato che specie di Legionella e Clostridium non coltivate potrebbero avere capacità degradative, indicando la necessità di coltivare questi batteri per studiare nuovi percorsi e diversità metabolica.
Fig. 2. Diversità tassonomica e distribuzione ecologica dei rappresentanti batterici in ambienti contaminati da naftalene e derivati ​​del naftalene.
Tra i vari microrganismi che degradano gli idrocarburi aromatici, la maggior parte è in grado di degradare il naftalene come unica fonte di carbonio ed energia. La sequenza di eventi coinvolti nel metabolismo del naftalene è stata descritta per Pseudomonas sp. (ceppi: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 e CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 e altri ceppi (ND6 e AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis e Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Il metabolismo è avviato da una diossigenasi multicomponente [naftalene diossigenasi (NDO), una diossigenasi idrossilante ad anello] che catalizza l'ossidazione di uno degli anelli aromatici del naftalene utilizzando l'ossigeno molecolare come altro substrato, convertendo il naftalene in cis-naftalendiolo (Figura 3). Il cis-diidrodiolo viene convertito in 1,2-diidrossinaftalene da una deidrogenasi. Una diossigenasi che scinde l'anello, la 1,2-diidrossinaftalene diossigenasi (12DHNDO), converte l'1,2-diidrossinaftalene in acido 2-idrossicromen-2-carbossilico. L'isomerizzazione enzimatica cis-trans produce trans-o-idrossibenzilidenepiruvato, che viene scisso dall'idratasi aldolasi in aldeide salicilica e piruvato. L'acido organico piruvato è stato il primo composto C3 derivato dallo scheletro carbonioso del naftalene e diretto verso la via del carbonio centrale. Inoltre, la salicilaldeide deidrogenasi NAD+-dipendente converte la salicilaldeide in acido salicilico. Il metabolismo in questa fase è chiamato "via superiore" della degradazione del naftalene. Questa via è molto comune nella maggior parte batteri che degradano il naftalene. Tuttavia, esistono alcune eccezioni; ad esempio, nel batterio termofilo Bacillus hamburgii 2, la degradazione del naftalene è avviata dalla naftalene 2,3-diossigenasi per formare 2,3-diidrossinaftalene (Annweiler et al., 2000).
Figura 3. Vie di degradazione di naftalene, metilnaftalene, acido naftoico e carbarile. I numeri cerchiati rappresentano gli enzimi responsabili della conversione sequenziale del naftalene e dei suoi derivati ​​nei prodotti successivi. 1 — naftalene diossigenasi (NDO); 2, cis-diidrodiol deidrogenasi; 3, 1,2-diidrossinaftalene diossigenasi; 4, acido 2-idrossicromen-2-carbossilico isomerasi; 5, trans-O-idrossibenzilidenepiruvato idratasi aldolasi; 6, salicilaldeide deidrogenasi; 7, salicilato 1-idrossilasi; 8, catecol 2,3-diossigenasi (C23DO); 9, 2-idrossimuconato semialdeide deidrogenasi; 10, 2-ossopent-4-enoato idratasi; 11, 4-idrossi-2-ossopentanoato aldolasi; 12, acetaldeide deidrogenasi; 13, catecol-1,2-diossigenasi (C12DO); 14, muconato cicloisomerasi; 15, muconolattone delta-isomerasi; 16, β-chetoadipatonollattone idrolasi; 17, β-chetoadipato succinil-CoA transferasi; 18, β-chetoadipato-CoA tiolasi; 19, succinil-CoA: acetil-CoA succiniltransferasi; 20, salicilato 5-idrossilasi; 21 – gentisato 1,2-diossigenasi (GDO); 22, maleilpiruvato isomerasi; 23, fumarilpiruvato idrolasi; 24, metilnaftalene idrossilasi (NDO); 25, idrossimetilnaftalene deidrogenasi; 26, naftaldeide deidrogenasi; 27, ossidasi dell'acido 3-formilsalicilico; 28, idrossiisoftalato decarbossilasi; 29, carbaril idrolasi (CH); 30, 1-naftol-2-idrossilasi.
A seconda dell'organismo e del suo corredo genetico, l'acido salicilico risultante viene ulteriormente metabolizzato attraverso la via del catecolo utilizzando la salicilato 1-idrossilasi (S1H) o attraverso la via del gentisato utilizzando la salicilato 5-idrossilasi (S5H) (Figura 3). Poiché l'acido salicilico è il principale intermedio nel metabolismo del naftalene (via superiore), i passaggi dall'acido salicilico all'intermedio TCA sono spesso indicati come via inferiore e i geni sono organizzati in un singolo operone. È comune osservare che i geni nell'operone della via superiore (nah) e in quello della via inferiore (sal) sono regolati da fattori regolatori comuni; ad esempio, NahR e acido salicilico agiscono come induttori, consentendo a entrambi gli operoni di metabolizzare completamente il naftalene (Phale et al., 2019, 2020).
Inoltre, il catecolo viene scisso ciclicamente a 2-idrossimuconato semialdeide attraverso la via meta dalla catecol 2,3-diossigenasi (C23DO) (Yen et al., 1988) e ulteriormente idrolizzato dalla 2-idrossimuconato semialdeide idrolasi per formare acido 2-idrossipent-2,4-dienoico. Il 2-idrossipent-2,4-dienoato viene quindi convertito in piruvato e acetaldeide da un'idratasi (2-oxopent-4-enoato idratasi) e da un'aldolasi (4-idrossi-2-oxopentanoato aldolasi) e quindi entra nella via del carbonio centrale (Figura 3). In alternativa, il catecolo viene scisso ciclicamente a cis,cis-muconato attraverso la via orto dalla catecol 1,2-ossigenasi (C12DO). La muconato cicloisomerasi, la muconolattone isomerasi e la β-chetoadipato-nollattone idrolasi convertono il cis,cis-muconato in 3-ossoadipato, che entra nel percorso centrale del carbonio tramite succinil-CoA e acetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (Figura 3).
Nella via del gentisato (2,5-diidrossibenzoato), l'anello aromatico viene scisso dalla gentisato 1,2-diossigenasi (GDO) per formare maleilpiruvato. Questo prodotto può essere idrolizzato direttamente a piruvato e malato, oppure può essere isomerizzato a formare fumarilpiruvato, che può poi essere idrolizzato a piruvato e fumarato (Larkin e Day, 1986). La scelta della via alternativa è stata osservata sia nei batteri Gram-negativi che Gram-positivi a livello biochimico e genetico (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). I batteri Gram-negativi (Pseudomonas) preferiscono utilizzare l'acido salicilico, che è un induttore del metabolismo del naftalene, decarbossilandolo a catecolo utilizzando la salicilato 1-idrossilasi (Gibson e Subramanian, 1984). D'altro canto, nei batteri Gram-positivi (Rhodococcus), la salicilato 5-idrossilasi converte l'acido salicilico in acido gentisico, mentre l'acido salicilico non ha alcun effetto induttivo sulla trascrizione dei geni del naftalene (Grund et al., 1992) (Figura 3).
È stato riportato che specie come Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas e Mycobacterium possono degradare monometilnaftalene o dimetilnaftalene (Dean-Raymond e Bartha, 1975; Cane e Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Tra queste, il percorso di degradazione dell'1-metilnaftalene e del 2-metilnaftalene di Pseudomonas sp. CSV86 è stato chiaramente studiato a livello biochimico ed enzimatico (Mahajan et al., 1994). L'1-metilnaftalene viene metabolizzato attraverso due vie. In primo luogo, l'anello aromatico (l'anello non sostituito del metilnaftalene) viene idrossilato per formare cis-1,2-diidrossi-1,2-diidro-8-metilnaftalene, che viene ulteriormente ossidato a salicilato di metile e metilcatecolo, per poi entrare nella via centrale del carbonio dopo la scissione dell'anello (Figura 3). Questa via è chiamata "via della fonte di carbonio". Nella seconda "via di detossificazione", il gruppo metilico può essere idrossilato dall'NDO per formare 1-idrossimetilnaftalene, che viene ulteriormente ossidato ad acido 1-naftoico ed escreto nel terreno di coltura come prodotto finale. Studi hanno dimostrato che il ceppo CSV86 non è in grado di crescere utilizzando acido 1- e 2-naftoico come unica fonte di carbonio ed energia, confermando il suo percorso di detossificazione (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). Nel 2-metilnaftalene, il gruppo metilico subisce un'idrossilazione da parte dell'idrossilasi per formare 2-idrossimetilnaftalene. Inoltre, l'anello non sostituito dell'anello naftalene subisce un'idrossilazione dell'anello per formare un diidrodiolo, che viene ossidato a 4-idrossimetilcatecolo in una serie di reazioni catalizzate da enzimi ed entra nella via del carbonio centrale attraverso la via di scissione dell'anello meta. Allo stesso modo, è stato riportato che S. paucimobilis 2322 utilizza NDO per idrossilare il 2-metilnaftalene, che viene ulteriormente ossidato per formare salicilato di metile e metilcatecolo (Dutta et al., 1998).
Gli acidi naftoici (sostituiti/non sostituiti) sono sottoprodotti di detossificazione/biotrasformazione formati durante la degradazione di metilnaftalene, fenantrene e antracene e rilasciati nel terreno di coltura esausto. È stato riportato che l'isolato del suolo Stenotrophomonas maltophilia CSV89 è in grado di metabolizzare l'acido 1-naftoico come fonte di carbonio (Phale et al., 1995). Il metabolismo inizia con la diidrossilazione dell'anello aromatico per formare 1,2-diidrossi-8-carbossinaftalene. Il diolo risultante viene ossidato a catecolo tramite 2-idrossi-3-carbossibenzilidenepiruvato, acido 3-formilsalicilico, acido 2-idrossiisoftalico e acido salicilico ed entra nella via centrale del carbonio attraverso la via di scissione dell'anello meta (Figura 3).
Il carbaryl è un pesticida naftil carbammato. A partire dalla Rivoluzione Verde in India negli anni '70, l'uso di fertilizzanti e pesticidi chimici ha portato a un aumento delle emissioni di idrocarburi policiclici aromatici (IPA) da fonti agricole diffuse (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Si stima che il 55% (85.722.000 ettari) del totale dei terreni coltivabili in India sia trattato con pesticidi chimici. Negli ultimi cinque anni (2015-2020), il settore agricolo indiano ha utilizzato in media dalle 55.000 alle 60.000 tonnellate di pesticidi all'anno (Dipartimento delle Cooperative e del Benessere degli Agricoltori, Ministero dell'Agricoltura, Governo dell'India, agosto 2020). Nelle pianure settentrionali e centrali del Gange (gli stati con la più alta popolazione e densità di popolazione), l'uso di pesticidi sulle colture è diffuso, con predominanza degli insetticidi. Il carbaryl (1-naftil-N-metilcarbammato) è un insetticida carbammato ad ampio spettro, da moderatamente ad altamente tossico, utilizzato nell'agricoltura indiana in quantità medie di 100-110 tonnellate. È comunemente venduto con il nome commerciale Sevin e viene utilizzato per il controllo di insetti (afidi, formiche rosse, pulci, acari, ragni e molti altri parassiti esterni) che colpiscono diverse colture (mais, soia, cotone, frutta e verdura). Alcuni microrganismi come Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus e Arthrobacter possono essere utilizzati anche per il controllo di altri parassiti. È stato riportato che RC100 può degradare il carbarile (Larkin e Day, 1986; Chapalamadugu e Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha e Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Il percorso di degradazione del carbarile è stato ampiamente studiato a livello biochimico, enzimatico e genetico in isolati di suolo di Pseudomonas sp. ceppi C4, C5 e C6 (Swetha e Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Fig. 3). Il percorso metabolico inizia con l'idrolisi del legame estereo da parte della carbaril idrolasi (CH) per formare 1-naftolo, metilammina e anidride carbonica. L'1-naftolo viene quindi convertito in 1,2-diidrossinaftalene dall'1-naftolo idrossilasi (1-NH), che viene ulteriormente metabolizzato attraverso la via del carbonio centrale tramite salicilato e gentisato. È stato riportato che alcuni batteri che degradano il carbarile lo metabolizzano in acido salicilico tramite la scissione dell'anello orto del catecolo (Larkin e Day, 1986; Chapalamadugu e Chaudhry, 1991). In particolare, i batteri che degradano il naftalene metabolizzano principalmente l'acido salicilico tramite il catecolo, mentre i batteri che degradano il carbarile preferiscono metabolizzare l'acido salicilico attraverso la via del gentisato.
I derivati ​​dell'acido naftalensolfonico/disolfonico e dell'acido naftilamminosolfonico possono essere utilizzati come intermedi nella produzione di coloranti azoici, agenti bagnanti, disperdenti, ecc. Sebbene questi composti abbiano una bassa tossicità per l'uomo, le valutazioni di citotossicità hanno dimostrato che sono letali per pesci, dafnie e alghe (Greim et al., 1994). È stato riportato che rappresentanti del genere Pseudomonas (ceppi A3, C22) iniziano il metabolismo mediante doppia idrossilazione dell'anello aromatico contenente il gruppo acido solfonico per formare un diidrodiolo, che viene ulteriormente convertito in 1,2-diidrossinaftalene mediante scissione spontanea del gruppo solfito (Brilon et al., 1981). L'1,2-diidrossinaftalene risultante viene catabolizzato attraverso la via classica del naftalene, ovvero la via del catecolo o del gentisato (Figura 4). È stato dimostrato che l'acido amminonaftalensolfonico e l'acido idrossinaftalensolfonico possono essere completamente degradati da consorzi batterici misti con vie cataboliche complementari (Nortemann et al., 1986). È stato dimostrato che un membro del consorzio desolfora l'acido amminonaftalensolfonico o l'acido idrossinaftalensolfonico mediante 1,2-diossigenazione, mentre l'aminosalicilato o l'idrossisalicilato vengono rilasciati nel terreno di coltura come metabolita non più attivo e successivamente assorbiti dagli altri membri del consorzio. L'acido naftalenedisolfonico è relativamente polare ma scarsamente biodegradabile e può quindi essere metabolizzato attraverso diverse vie. La prima desolforazione avviene durante la diidrossilazione regioselettiva dell'anello aromatico e del gruppo acido solfonico; La seconda desolforazione avviene durante l'idrossilazione dell'acido 5-solfosalicilico da parte dell'acido salicilico 5-idrossilasi per formare acido gentisico, che entra nella via del carbonio centrale (Brilon et al., 1981) (Figura 4). Gli enzimi responsabili della degradazione del naftalene sono anche responsabili del metabolismo del naftalensolfonato (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figura 4. Vie metaboliche per la degradazione del naftalensolfonato. I numeri all'interno dei cerchi rappresentano gli enzimi responsabili del metabolismo del naftilsolfonato, simili/identici agli enzimi descritti in FIG. 3.
Gli IPA a basso peso molecolare (IPA-LMW) sono riducibili, idrofobici e scarsamente solubili, e quindi non suscettibili alla degradazione naturale. Tuttavia, i microrganismi aerobici sono in grado di ossidarli assorbendo ossigeno molecolare (O₂). Questi enzimi appartengono principalmente alla classe delle ossidoreduttasi e possono eseguire varie reazioni come l'idrossilazione dell'anello aromatico (mono- o diidrossilazione), la deidrogenazione e la scissione dell'anello aromatico. I prodotti ottenuti da queste reazioni si trovano in uno stato di ossidazione più elevato e sono più facilmente metabolizzati attraverso la via del carbonio centrale (Phale et al., 2020). È stato riportato che gli enzimi nella via di degradazione sono inducibili. L'attività di questi enzimi è molto bassa o trascurabile quando le cellule vengono coltivate su fonti di carbonio semplici come glucosio o acidi organici. Nella tabella 3 sono riepilogati i vari enzimi (ossigenasi, idrolasi, deidrogenasi, ossidasi, ecc.) coinvolti nel metabolismo del naftalene e dei suoi derivati.
Tabella 3. Caratteristiche biochimiche degli enzimi responsabili della degradazione del naftalene e dei suoi derivati.
Studi sui radioisotopi (18O2) hanno dimostrato che l'incorporazione di O2 molecolare negli anelli aromatici da parte delle ossigenasi è il passaggio più importante nell'attivazione dell'ulteriore biodegradazione di un composto (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). L'incorporazione di un atomo di ossigeno (O) dall'ossigeno molecolare (O2) nel substrato è avviata da monoossigenasi endogene o esogene (chiamate anche idrossilasi). Un altro atomo di ossigeno viene ridotto ad acqua. Le monoossigenasi esogene riducono la flavina con NADH o NADPH, mentre nelle endomonoossigenasi la flavina viene ridotta dal substrato. La posizione di idrossilazione determina una diversità nella formazione del prodotto. Ad esempio, la salicilato 1-idrossilasi idrossila l'acido salicilico in posizione C1, formando catecolo. D'altro canto, la salicilato 5-idrossilasi multicomponente (contenente le subunità reduttasi, ferredossina e ossigenasi) idrossila l'acido salicilico nella posizione C5, formando acido gentisico (Yamamoto et al., 1965).
Le diossigenasi incorporano due atomi di O2 nel substrato. A seconda dei prodotti formati, si dividono in diossigenasi ad idrossilazione ad anello e diossigenasi a scissione ad anello. Le diossigenasi ad idrossilazione ad anello convertono i substrati aromatici in cis-diidrodioli (ad esempio, naftalene) e sono diffuse tra i batteri. Ad oggi, è stato dimostrato che gli organismi contenenti diossigenasi ad idrossilazione ad anello sono in grado di crescere su varie fonti di carbonio aromatiche e questi enzimi sono classificati come NDO (naftalene), toluene diossigenasi (TDO, toluene) e bifenil diossigenasi (BPDO, bifenile). Sia NDO che BPDO possono catalizzare la doppia ossidazione e l'idrossilazione della catena laterale di vari idrocarburi policiclici aromatici (toluene, nitrotoluene, xilene, etilbenzene, naftalene, bifenile, fluorene, indolo, metilnaftalene, naftalensolfonato, fenantrene, antracene, acetofenone, ecc.) (Boyd e Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO è un sistema multicomponente costituito da un'ossidoreduttasi, una ferredossina e un componente ossigenasi contenente il sito attivo (Gibson e Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). L'unità catalitica di NDO è costituita da una subunità α grande e da una subunità β piccola disposte in una configurazione α3β3. L'NDO appartiene a una vasta famiglia di ossigenasi e la sua subunità α contiene un sito di Rieske [2Fe-2S] e un ferro non eme mononucleare, che determina la specificità di substrato dell'NDO (Parales et al., 1998). Tipicamente, in un ciclo catalitico, due elettroni provenienti dalla riduzione del nucleotide piridinico vengono trasferiti allo ione Fe(II) nel sito attivo tramite una reduttasi, una ferredossina e un sito di Rieske. Gli equivalenti riducenti attivano l'ossigeno molecolare, che è un prerequisito per la diidrossilazione del substrato (Ferraro et al., 2005). Ad oggi, solo pochi NDO sono stati purificati e caratterizzati in dettaglio da ceppi diversi e il controllo genetico dei percorsi coinvolti nella degradazione del naftalene è stato studiato in dettaglio (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Le diossigenasi che scindono l'anello (enzimi che scindono l'anello endo o orto ed enzimi che scindono l'anello esodiolo o meta) agiscono sui composti aromatici idrossilati. Ad esempio, la diossigenasi che scinde l'anello orto è la catecol-1,2-diossigenasi, mentre la diossigenasi che scinde il meta-anello è la catecol-2,3-diossigenasi (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Oltre alle varie ossigenasi, esistono anche diverse deidrogenasi responsabili della deidrogenazione di diidrodioli aromatici, alcoli e aldeidi e che utilizzano NAD+/NADP+ come accettori di elettroni, che sono alcuni degli enzimi importanti coinvolti nel metabolismo (Gibson e Subramanian, 1984; Shaw e Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzimi come le idrolasi (esterasi, amidasi) sono una seconda importante classe di enzimi che utilizzano l'acqua per scindere i legami covalenti e presentano un'ampia specificità di substrato. La carbaril idrolasi e altre idrolasi sono considerate componenti del periplasma (transmembrana) nei batteri Gram-negativi (Kamini et al., 2018). Il carbaril presenta sia un legame ammidico che estere; pertanto, può essere idrolizzato sia dall'esterasi che dall'amidasi per formare 1-naftolo. È stato riportato che il carbaril nel ceppo AC10023 di Rhizobium rhizobium e nel ceppo RC100 di Arthrobacter funziona rispettivamente come esterasi e amidasi. Anche il carbaril nel ceppo RC100 di Arthrobacter funziona come amidasi. È stato dimostrato che RC100 idrolizza quattro insetticidi della classe degli N-metilcarbammati, come carbaril, metomil, acido mefenamico e XMC (Hayaatsu et al., 2001). È stato riportato che CH in Pseudomonas sp. C5pp può agire su carbaril (attività del 100%) e 1-naftil acetato (attività del 36%), ma non su 1-naftilacetammide, indicando che si tratta di un'esterasi (Trivedi et al., 2016).
Studi biochimici, modelli di regolazione enzimatica e analisi genetiche hanno dimostrato che i geni di degradazione del naftalene sono costituiti da due unità regolatrici inducibili o "operoni": nah (la "via a monte", che converte il naftalene in acido salicilico) e sal (la "via a valle", che converte l'acido salicilico nella via del carbonio centrale tramite catecolo). L'acido salicilico e i suoi analoghi possono agire come induttori (Shamsuzzaman e Barnsley, 1974). In presenza di glucosio o acidi organici, l'operone viene represso. La Figura 5 mostra l'organizzazione genetica completa della degradazione del naftalene (in forma di operone). Sono state descritte diverse varianti/forme del gene nah (ndo/pah/dox) che presentano un'elevata omologia di sequenza (90%) tra tutte le specie di Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). I geni della via a monte del naftalene erano generalmente disposti in un ordine consensuale, come mostrato nella Figura 5A. È stato anche segnalato che un altro gene, nahQ, è coinvolto nel metabolismo del naftalene ed è solitamente localizzato tra nahC e nahE, ma la sua funzione effettiva deve ancora essere chiarita. Analogamente, il gene nahY, responsabile della chemiotassi sensibile al naftalene, è stato trovato all'estremità distale dell'operone nah in alcuni membri. In Ralstonia sp., il gene U2 che codifica per la glutatione S-transferasi (gsh) è localizzato tra nahAa e nahAb, ma non ha influenzato le caratteristiche di utilizzo del naftalene (Zylstra et al., 1997).
Figura 5. Organizzazione genetica e diversità osservate durante la degradazione del naftalene tra le specie batteriche; (A) Via del naftalene superiore, metabolismo del naftalene in acido salicilico; (B) Via del naftalene inferiore, acido salicilico tramite catecolo alla via del carbonio centrale; (C) acido salicilico tramite gentisato alla via del carbonio centrale.
La "via inferiore" (operone sal) è tipicamente costituita da nahGTHINLMOKJ e converte il salicilato in piruvato e acetaldeide attraverso la via di scissione del metaanello catecolico. Il gene nahG (che codifica per la salicilato idrossilasi) è stato trovato conservato all'estremità prossimale dell'operone (Fig. 5B). Rispetto ad altri ceppi che degradano il naftalene, in P. putida CSV86 gli operoni nah e sal sono tandem e strettamente correlati (circa 7,5 kb). In alcuni batteri Gram-negativi, come Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 e P. putida AK5, il naftalene viene metabolizzato come metabolita centrale del carbonio attraverso la via del gentisato (sotto forma dell'operone sgp/nag). La cassetta genica è tipicamente rappresentata nella forma nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, dove nagR (che codifica un regolatore di tipo LysR) si trova all'estremità superiore (Figura 5C).
Il carbarile entra nel ciclo centrale del carbonio attraverso il metabolismo di 1-naftolo, 1,2-diidrossinaftalene, acido salicilico e acido gentisico (Figura 3). Sulla base di studi genetici e metabolici, è stato proposto di suddividere questo percorso in "a monte" (conversione del carbarile in acido salicilico), "intermedio" (conversione dell'acido salicilico in acido gentisico) e "a valle" (conversione dell'acido gentisico in intermedi del ciclo centrale del carbonio) (Singh et al., 2013). L'analisi genomica di C5pp (supercontig A, 76,3 kb) ha rivelato che il gene mcbACBDEF è coinvolto nella conversione del carbarile in acido salicilico, seguito da mcbIJKL nella conversione dell'acido salicilico in acido gentisico e da mcbOQP nella conversione dell'acido gentisico in intermedi del carbonio centrale (fumarato e piruvato, Trivedi et al., 2016) (Figura 6).
È stato riportato che gli enzimi coinvolti nella degradazione degli idrocarburi aromatici (inclusi naftalene e acido salicilico) possono essere indotti dai composti corrispondenti e inibiti da fonti di carbonio semplici come glucosio o acidi organici (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Tra le varie vie metaboliche del naftalene e dei suoi derivati, le caratteristiche regolatorie del naftalene e del carbarile sono state in una certa misura studiate. Per il naftalene, i geni sia nella via a monte che in quella a valle sono regolati da NahR, un regolatore positivo trans-agente di tipo LysR. È necessario per l'induzione del gene nah da parte dell'acido salicilico e la sua successiva espressione ad alto livello (Yen e Gunsalus, 1982). Inoltre, studi hanno dimostrato che il fattore integrativo dell'ospite (IHF) e XylR (regolatore trascrizionale dipendente da sigma 54) sono anch'essi critici per l'attivazione trascrizionale dei geni nel metabolismo del naftalene (Ramos et al., 1997). Studi hanno dimostrato che gli enzimi della via di apertura dell'anello meta-catecolico, in particolare la catecol 2,3-diossigenasi, vengono indotti in presenza di naftalene e/o acido salicilico (Basu et al., 2006). Studi hanno dimostrato che gli enzimi della via di apertura dell'anello orto-catecolico, in particolare la catecol 1,2-diossigenasi, vengono indotti in presenza di acido benzoico e cis,cis-muconato (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Nel ceppo C5pp, cinque geni, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR e mcbS, codificano per regolatori appartenenti alla famiglia di regolatori trascrizionali LysR/TetR, responsabili del controllo della degradazione del carbarile. Il gene omologo mcbG è risultato essere strettamente correlato al regolatore di tipo LysR PhnS (58% di identità amminoacidica) coinvolto nel metabolismo del fenantrene in Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Il gene mcbH è stato trovato coinvolto nella via intermedia (conversione dell'acido salicilico in acido gentisico) e appartiene al regolatore trascrizionale di tipo LysR NagR/DntR/NahR in Pseudomonas e Burkholderia. È stato riportato che i membri di questa famiglia riconoscono l'acido salicilico come una molecola effettrice specifica per l'induzione dei geni di degradazione. D'altro canto, tre geni, mcbN, mcbR e mcbS, appartenenti ai regolatori trascrizionali di tipo LysR e TetR, sono stati identificati nel percorso a valle (metaboliti del percorso gentisato-carbonio centrale).
Nei procarioti, i processi di trasferimento genico orizzontale (acquisizione, scambio o trasferimento) tramite plasmidi, trasposoni, profagi, isole genomiche ed elementi coniugativi integrativi (ICE) sono le principali cause di plasticità nei genomi batterici, portando all'acquisizione o alla perdita di funzioni/caratteri specifici. Ciò consente ai batteri di adattarsi rapidamente a diverse condizioni ambientali, offrendo potenziali vantaggi metabolici adattativi all'ospite, come la degradazione di composti aromatici. I cambiamenti metabolici sono spesso ottenuti attraverso la messa a punto degli operoni di degradazione, dei loro meccanismi di regolazione e delle specificità enzimatiche, che facilita la degradazione di una gamma più ampia di composti aromatici (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). È stato scoperto che le cassette geniche per la degradazione del naftalene sono localizzate su una varietà di elementi mobili come plasmidi (coniugativi e non coniugativi), trasposoni, genomi, ICE e combinazioni di diverse specie batteriche (Figura 5). In Pseudomonas G7, gli operoni nah e sal del plasmide NAH7 sono trascritti con lo stesso orientamento e fanno parte di un trasposone difettoso che richiede la trasposasi Tn4653 per la mobilizzazione (Sota et al., 2006). Nel ceppo di Pseudomonas NCIB9816-4, il gene è stato trovato sul plasmide coniugativo pDTG1 come due operoni (distanti circa 15 kb l'uno dall'altro) che sono stati trascritti in direzioni opposte (Dennis e Zylstra, 2004). Nel ceppo AK5 di Pseudomonas putida, il plasmide non coniugativo pAK5 codifica l'enzima responsabile della degradazione del naftalene attraverso la via del gentisato (Izmalkova et al., 2013). Nel ceppo PMD-1 di Pseudomonas, l'operone nah è localizzato sul cromosoma, mentre l'operone sal è localizzato sul plasmide coniugativo pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Tuttavia, in Pseudomonas stutzeri AN10, tutti i geni di degradazione del naftalene (operoni nah e sal) sono localizzati sul cromosoma e sono presumibilmente reclutati attraverso eventi di trasposizione, ricombinazione e riarrangiamento (Bosch et al., 2000). In Pseudomonas sp. CSV86, gli operoni nah e sal sono localizzati nel genoma sotto forma di ICE (ICECSV86). La struttura è protetta da tRNAGly seguita da ripetizioni dirette che indicano siti di ricombinazione/attacco (attR e attL) e da un'integrasi fagica situata a entrambe le estremità di tRNAGly, quindi strutturalmente simile all'elemento ICEclc (ICEclcB13 in Pseudomonas knackmusii per la degradazione del clorocatecolo). È stato riportato che i geni su ICE possono essere trasferiti per coniugazione con una frequenza di trasferimento estremamente bassa (10-8), trasferendo così le proprietà di degradazione al ricevente (Basu e Phale, 2008; Phale et al., 2019).
La maggior parte dei geni responsabili della degradazione del carbarile si trova sui plasmidi. Arthrobacter sp. RC100 contiene tre plasmidi (pRC1, pRC2 e pRC300), di cui due plasmidi coniugativi, pRC1 e pRC2, codificano gli enzimi che convertono il carbarile in gentisato. D'altra parte, gli enzimi coinvolti nella conversione del gentisato nei metaboliti centrali del carbonio sono localizzati sul cromosoma (Hayaatsu et al., 1999). I batteri del genere Rhizobium. Il ceppo AC100, utilizzato per la conversione del carbarile in 1-naftolo, contiene il plasmide pAC200, che trasporta il gene cehA che codifica per CH come parte del trasposone Tnceh circondato da sequenze simili a elementi di inserzione (istA e istB) (Hashimoto et al., 2002). Nel ceppo CF06 di Sphingomonas, si ritiene che il gene di degradazione del carbarile sia presente in cinque plasmidi: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 e pCF05. L'omologia del DNA di questi plasmidi è elevata, indicando l'esistenza di un evento di duplicazione genica (Feng et al., 1997). In un simbionte degradante il carbarile composto da due specie di Pseudomonas, il ceppo 50581 contiene un plasmide coniugativo pCD1 (50 kb) che codifica per il gene mcd carbaril idrolasi, mentre il plasmide coniugativo del ceppo 50552 codifica per un enzima degradante l'1-naftolo (Chapalamadugu e Chaudhry, 1991). Nel ceppo di Achromobacter WM111, il gene mcd furadan idrolasi è localizzato su un plasmide di 100 kb (pPDL11). È stato dimostrato che questo gene è presente su diversi plasmidi (100, 105, 115 o 124 kb) in batteri di diverse regioni geografiche (Parekh et al., 1995). In Pseudomonas sp. C5pp, tutti i geni responsabili della degradazione del carbarile sono localizzati in un genoma che si estende per 76,3 kb di sequenza (Trivedi et al., 2016). L'analisi del genoma (6,15 Mb) ha rivelato la presenza di 42 MGE e 36 GEI, di cui 17 MGE erano localizzati in supercontig A (76,3 kb) con un contenuto medio asimmetrico di G+C (54–60 mol%), suggerendo possibili eventi di trasferimento genico orizzontale (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 mostra una disposizione simile di geni che degradano il carbarile, ma questi geni sono localizzati su un plasmide (Zhu et al., 2019).
Oltre all'efficienza metabolica a livello biochimico e genomico, i microrganismi presentano anche altre proprietà o risposte, come la chemiotassi, le proprietà di modificazione della superficie cellulare, la compartimentazione, l'utilizzo preferenziale, la produzione di biosurfattante, ecc., che li aiutano a metabolizzare in modo più efficiente gli inquinanti aromatici negli ambienti contaminati (Figura 7).
Figura 7. Diverse strategie di risposta cellulare di batteri ideali per la degradazione degli idrocarburi aromatici per una biodegradazione efficiente di composti inquinanti estranei.
Le risposte chemiotattiche sono considerate fattori che favoriscono la degradazione degli inquinanti organici in ecosistemi eterogeneamente inquinati. (2002) hanno dimostrato che la chemiotassi di Pseudomonas sp. G7 al naftalene aumentava la velocità di degradazione del naftalene nei sistemi acquatici. Il ceppo selvatico G7 degradava il naftalene molto più velocemente di un ceppo mutante con deficit di chemiotassi. È stato scoperto che la proteina NahY (538 amminoacidi con topologia di membrana) è co-trascritta con i geni del pathway di metaclivaggio sul plasmide NAH7 e, come i trasduttori della chemiotassi, questa proteina sembra funzionare come chemocettore per la degradazione del naftalene (Grimm e Harwood 1997). Un altro studio di Hansel et al. (2009) ha dimostrato che la proteina è chemiotattica, ma la sua velocità di degradazione è elevata. (2011) hanno dimostrato una risposta chemiotattica di Pseudomonas (P. putida) al naftalene gassoso, in cui la diffusione in fase gassosa determinava un flusso costante di naftalene verso le cellule, che controllava la risposta chemiotattica delle cellule. I ricercatori hanno sfruttato questo comportamento chemiotattico per ingegnerizzare microbi che avrebbero aumentato la velocità di degradazione. Studi hanno dimostrato che le vie chemiosensoriali regolano anche altre funzioni cellulari come la divisione cellulare, la regolazione del ciclo cellulare e la formazione di biofilm, contribuendo così a controllare la velocità di degradazione. Tuttavia, lo sfruttamento di questa proprietà (chemiotassi) per una degradazione efficiente è ostacolato da diversi colli di bottiglia. I principali ostacoli sono: (a) diversi recettori paraloghi riconoscono gli stessi composti/ligandi; (b) esistenza di recettori alternativi, ovvero tropismo energetico; (c) differenze significative di sequenza nei domini sensoriali della stessa famiglia di recettori; e (d) mancanza di informazioni sulle principali proteine ​​sensore batteriche (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Talvolta, la biodegradazione degli idrocarburi aromatici produce molteplici metaboliti/intermedi, che possono essere chemiotattici per un gruppo di batteri ma repulsivi per altri, complicando ulteriormente il processo. Per identificare le interazioni dei ligandi (idrocarburi aromatici) con i recettori chimici, abbiamo costruito proteine ​​sensore ibride (PcaY, McfR e NahY) fondendo i domini sensore e di segnalazione di Pseudomonas putida ed Escherichia coli, che hanno come target rispettivamente i recettori per gli acidi aromatici, gli intermedi TCA e il naftalene (Luu et al., 2019).
Sotto l'influenza del naftalene e di altri idrocarburi policiclici aromatici (IPA), la struttura della membrana batterica e l'integrità dei microrganismi subiscono cambiamenti significativi. Studi hanno dimostrato che il naftalene interferisce con l'interazione della catena acilica attraverso interazioni idrofobiche, aumentando così il rigonfiamento e la fluidità della membrana (Sikkema et al., 1995). Per contrastare questo effetto dannoso, i batteri regolano la fluidità della membrana modificando il rapporto e la composizione in acidi grassi tra acidi grassi a catena ramificata iso/anteiso e isomerizzando gli acidi grassi cis-insaturi nei corrispondenti isomeri trans (Heipieper e de Bont, 1994). In Pseudomonas stutzeri coltivato con trattamento a base di naftalene, il rapporto tra acidi grassi saturi e insaturi è aumentato da 1,1 a 2,1, mentre in Pseudomonas JS150 questo rapporto è aumentato da 7,5 a 12,0 (Mrozik et al., 2004). Quando coltivate con naftalene, le cellule di Achromobacter KAs 3–5 hanno mostrato aggregazione cellulare attorno ai cristalli di naftalene e una diminuzione della carica superficiale cellulare (da -22,5 a -2,5 mV) accompagnata da condensazione citoplasmatica e vacuolizzazione, indicando cambiamenti nella struttura cellulare e nelle proprietà della superficie cellulare (Mohapatra et al., 2019). Sebbene i cambiamenti cellulari/superficiali siano direttamente associati a un migliore assorbimento di inquinanti aromatici, le strategie di bioingegneria pertinenti non sono state completamente ottimizzate. La manipolazione della forma cellulare è stata raramente utilizzata per ottimizzare i processi biologici (Volke e Nikel, 2018). La delezione di geni che influenzano la divisione cellulare causa alterazioni nella morfologia cellulare. In Bacillus subtilis, la proteina del setto cellulare SepF ha dimostrato di essere coinvolta nella formazione del setto ed è necessaria per le fasi successive della divisione cellulare, ma non è un gene essenziale. La delezione dei geni che codificano per le peptidi glicano idrolasi in Bacillus subtilis ha determinato l'allungamento cellulare, un aumento del tasso di crescita specifico e una migliore capacità di produzione enzimatica (Cui et al., 2018).
È stata proposta la compartimentalizzazione del percorso di degradazione del carbarile per ottenere una degradazione efficiente dei ceppi C5pp e C7 di Pseudomonas (Kamini et al., 2018). Si ipotizza che il carbarile venga trasportato nello spazio periplasmatico attraverso il setto della membrana esterna e/o attraverso porine diffusibili. CH è un enzima periplasmatico che catalizza l'idrolisi del carbarile a 1-naftolo, che è più stabile, più idrofobico e più tossico. CH è localizzato nel periplasma e ha una bassa affinità per il carbarile, controllando così la formazione di 1-naftolo, prevenendone l'accumulo nelle cellule e riducendone la tossicità per le cellule (Kamini et al., 2018). L'1-naftolo risultante viene trasportato nel citoplasma attraverso la membrana interna mediante ripartizione e/o diffusione, e viene quindi idrossilato a 1,2-diidrossinaftalene dall'enzima ad alta affinità 1NH per un ulteriore metabolismo nel percorso del carbonio centrale.
Sebbene i microrganismi abbiano le capacità genetiche e metaboliche per degradare le fonti di carbonio xenobiotiche, la struttura gerarchica del loro utilizzo (ovvero, l'uso preferenziale di fonti di carbonio semplici rispetto a quelle complesse) rappresenta un ostacolo importante alla biodegradazione. La presenza e l'utilizzo di fonti di carbonio semplici riduce la produzione di geni che codificano per enzimi che degradano fonti di carbonio complesse/non preferite, come gli IPA. Un esempio ben studiato è che quando glucosio e lattosio vengono somministrati insieme a Escherichia coli, il glucosio viene utilizzato in modo più efficiente del lattosio (Jacob e Monod, 1965). È stato riportato che Pseudomonas degrada una varietà di IPA e composti xenobiotici come fonti di carbonio. La gerarchia di utilizzo delle fonti di carbonio in Pseudomonas è: acidi organici > glucosio > composti aromatici (Hylemon e Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Tuttavia, esiste un'eccezione. È interessante notare che Pseudomonas sp. CSV86 presenta una struttura gerarchica unica che utilizza preferenzialmente idrocarburi aromatici (acido benzoico, naftalene, ecc.) piuttosto che glucosio e co-metabolizza gli idrocarburi aromatici con acidi organici (Basu et al., 2006). In questo batterio, i geni per la degradazione e il trasporto degli idrocarburi aromatici non sono sottoregolati nemmeno in presenza di una seconda fonte di carbonio come glucosio o acidi organici. Quando coltivato in un terreno contenente glucosio e idrocarburi aromatici, è stato osservato che i geni per il trasporto e il metabolismo del glucosio erano sottoregolati, gli idrocarburi aromatici venivano utilizzati nella prima fase logaritmica e il glucosio nella seconda fase logaritmica (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). D'altra parte, la presenza di acidi organici non ha influenzato l'espressione del metabolismo degli idrocarburi aromatici, quindi si prevede che questo batterio sia un ceppo candidato per studi di biodegradazione (Phale et al., 2020).
È noto che la biotrasformazione degli idrocarburi può causare stress ossidativo e sovraregolazione degli enzimi antiossidanti nei microrganismi. La biodegradazione inefficiente del naftalene, sia nelle cellule in fase stazionaria che in presenza di composti tossici, porta alla formazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) (Kang et al. 2006). Poiché gli enzimi che degradano il naftalene contengono cluster ferro-zolfo, in condizioni di stress ossidativo il ferro presente nelle proteine ​​eme e ferro-zolfo verrà ossidato, portando all'inattivazione proteica. La ferredossina-NADP+ reduttasi (Fpr), insieme alla superossido dismutasi (SOD), media la reazione redox reversibile tra NADP+/NADPH e due molecole di ferredossina o flavodossina, eliminando così i ROS e ripristinando il centro ferro-zolfo in condizioni di stress ossidativo (Li et al. 2006). È stato riportato che sia Fpr che SodA (SOD) in Pseudomonas possono essere indotti dallo stress ossidativo, e un aumento dell'attività di SOD e catalasi è stato osservato in quattro ceppi di Pseudomonas (O1, W1, As1 e G1) durante la crescita in condizioni di aggiunta di naftalene (Kang et al., 2006). Studi hanno dimostrato che l'aggiunta di antiossidanti come l'acido ascorbico o il ferro ferroso (Fe2+) può aumentare il tasso di crescita del naftalene. Quando Rhodococcus erythropolis è cresciuto in mezzo naftalene, la trascrizione dei geni del citocromo P450 correlati allo stress ossidativo, tra cui sodA (superossido dismutasi Fe/Mn), sodC (superossido dismutasi Cu/Zn) e recA, è aumentata (Sazykin et al., 2019). L'analisi proteomica quantitativa comparativa delle cellule di Pseudomonas coltivate in naftalene ha dimostrato che la regolazione positiva di varie proteine ​​associate alla risposta allo stress ossidativo è una strategia di adattamento allo stress (Herbst et al., 2013).
È stato segnalato che i microrganismi producono biosurfattanti sotto l'azione di fonti di carbonio idrofobiche. Questi tensioattivi sono composti tensioattivi anfifilici che possono formare aggregati alle interfacce olio-acqua o aria-acqua. Ciò promuove la pseudo-solubilizzazione e facilita l'adsorbimento di idrocarburi aromatici, con conseguente efficiente biodegradazione (Rahman et al., 2002). Grazie a queste proprietà, i biosurfattanti sono ampiamente utilizzati in vari settori industriali. L'aggiunta di tensioattivi chimici o biosurfattanti alle colture batteriche può migliorare l'efficienza e la velocità di degradazione degli idrocarburi. Tra i biosurfattanti, i ramnolipidi prodotti da Pseudomonas aeruginosa sono stati ampiamente studiati e caratterizzati (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Inoltre, altri tipi di biosurfattanti includono lipopeptidi (mucine da Pseudomonas fluorescens), emulsionante 378 (da Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg e Ron, 1999), lipidi disaccaridici di trealosio da Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenina da Bacillus (Saraswathy e Hallberg, 2002) e tensioattivi da Bacillus subtilis (Siegmund e Wagner, 1991) e Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). È stato dimostrato che questi potenti tensioattivi riducono la tensione superficiale da 72 dyne/cm a meno di 30 dyne/cm, consentendo un migliore assorbimento degli idrocarburi. È stato riportato che Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia e altre specie batteriche possono produrre vari biosurfatanti a base di ramnolipidi e glicolipidi quando coltivati ​​in terreni di naftalene e metilnaftalene (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 può produrre il biosurfattante extracellulare Biosur-Pm quando coltivato su composti aromatici come l'acido naftoico (Phale et al., 1995). La cinetica di formazione di Biosur-Pm ha mostrato che la sua sintesi è un processo dipendente dalla crescita e dal pH. È stato riscontrato che la quantità di Biosur-Pm prodotta dalle cellule a pH neutro era maggiore rispetto a quella a pH 8,5. Le cellule coltivate a pH 8,5 erano più idrofobiche e avevano una maggiore affinità per i composti aromatici e alifatici rispetto alle cellule coltivate a pH 7,0. In Rhodococcus spp. N6, un rapporto carbonio/azoto (C:N) più elevato e una limitazione del ferro sono condizioni ottimali per la produzione di biosurfattanti extracellulari (Mutalik et al., 2008). Sono stati fatti tentativi per migliorare la biosintesi dei biosurfattanti (surfattene) ottimizzando i ceppi e la fermentazione. Tuttavia, il titolo di tensioattivo nel terreno di coltura è basso (1,0 g/L), il che rappresenta una sfida per la produzione su larga scala (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Pertanto, sono stati utilizzati metodi di ingegneria genetica per migliorarne la biosintesi. Tuttavia, la sua modifica ingegneristica è difficile a causa delle grandi dimensioni dell'operone (∼25 kb) e della complessa regolazione biosintetica del sistema di quorum sensing (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Sono state effettuate numerose modifiche di ingegneria genetica nei batteri Bacillus, principalmente volte ad aumentare la produzione di surfattina sostituendo il promotore (operone srfA), sovraesprimendo la proteina di esportazione della surfattina YerP e i fattori regolatori ComX e PhrC (Jiao et al., 2017). Tuttavia, questi metodi di ingegneria genetica hanno ottenuto solo una o poche modifiche genetiche e non hanno ancora raggiunto la produzione commerciale. Pertanto, sono necessari ulteriori studi sui metodi di ottimizzazione basati sulla conoscenza.
Gli studi sulla biodegradazione degli IPA vengono condotti principalmente in condizioni di laboratorio standard. Tuttavia, in siti o ambienti contaminati, è stato dimostrato che molti fattori abiotici e biotici (temperatura, pH, ossigeno, disponibilità di nutrienti, biodisponibilità del substrato, altri xenobiotici, inibizione del prodotto finale, ecc.) alterano e influenzano la capacità degradativa dei microrganismi.
La temperatura ha un effetto significativo sulla biodegradazione degli IPA. All'aumentare della temperatura, la concentrazione di ossigeno disciolto diminuisce, influenzando il metabolismo dei microrganismi aerobici, poiché richiedono ossigeno molecolare come uno dei substrati per le ossigenasi che svolgono le reazioni di idrossilazione o di scissione dell'anello. Si nota spesso che temperature elevate convertono gli IPA di origine in composti più tossici, inibendo così la biodegradazione (Muller et al., 1998).
È stato osservato che molti siti contaminati da IPA presentano valori di pH estremi, come i siti contaminati da drenaggio minerario acido (pH 1–4) e i siti di gassificazione di gas naturale/carbone contaminati da percolato alcalino (pH 8–12). Queste condizioni possono compromettere seriamente il processo di biodegradazione. Pertanto, prima di utilizzare microrganismi per il biorisanamento, si raccomanda di regolare il pH aggiungendo sostanze chimiche idonee (con potenziale di ossidoriduzione da moderato a molto basso) come solfato di ammonio o nitrato di ammonio per i terreni alcalini o calcinazione con carbonato di calcio o carbonato di magnesio per i siti acidi (Bowlen et al. 1995; Gupta e Sar 2020).
L'apporto di ossigeno all'area interessata è il fattore limitante la velocità di biodegradazione degli IPA. A causa delle condizioni redox dell'ambiente, i processi di biorisanamento in situ richiedono solitamente l'introduzione di ossigeno da fonti esterne (aratura, air sparging e aggiunta di sostanze chimiche) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) hanno dimostrato che l'aggiunta di perossido di magnesio (un composto che rilascia ossigeno) a un acquifero contaminato può efficacemente biorisanare i composti BTEX. Un altro studio ha indagato la degradazione in situ di fenolo e BTEX in un acquifero contaminato mediante l'iniezione di nitrato di sodio e la costruzione di pozzi di estrazione per ottenere un biorisanamento efficace (Bewley e Webb, 2001).