L'articolo fa parte del tema di ricerca "Tecnologie avanzate di biorisanamento e processi di riciclo dei composti organici sintetici (SOC)". Visualizza tutti i 14 articoli.
Gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) a basso peso molecolare, come il naftalene e i naftaleni sostituiti (metilnaftalene, acido naftoico, 1-naftil-N-metilcarbammato, ecc.), sono ampiamente utilizzati in diversi settori industriali e risultano genotossici, mutageni e/o cancerogeni per gli organismi viventi. Questi composti organici sintetici (COS) o xenobiotici sono considerati inquinanti prioritari e rappresentano una seria minaccia per l'ambiente globale e la salute pubblica. L'intensità delle attività umane (ad esempio gassificazione del carbone, raffinazione del petrolio, emissioni dei veicoli e applicazioni agricole) determina la concentrazione, il destino e il trasporto di questi composti onnipresenti e persistenti. Oltre ai metodi di trattamento/rimozione fisici e chimici, le tecnologie ecocompatibili e rispettose dell'ambiente, come la biorisanamento, che utilizzano microrganismi in grado di degradare completamente i COS o di convertirli in sottoprodotti non tossici, si sono affermate come un'alternativa sicura, economicamente vantaggiosa e promettente. Diverse specie batteriche appartenenti ai phyla Proteobacteria (Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia e Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus e Paenibacillus) e Actinobacteria (Rhodococcus e Arthrobacter) presenti nel microbiota del suolo hanno dimostrato la capacità di degradare vari composti organici. Studi metabolici, genomici e analisi metagenomiche ci aiutano a comprendere la complessità catabolica e la diversità presenti in queste semplici forme di vita, che possono essere ulteriormente applicate per una biodegradazione efficiente. La presenza a lungo termine degli IPA ha portato all'emergere di nuovi fenotipi di degradazione attraverso il trasferimento genico orizzontale mediante elementi genetici come plasmidi, trasposoni, batteriofagi, isole genomiche ed elementi coniugativi integrativi. La biologia dei sistemi e l'ingegneria genetica di specifici isolati o comunità modello (consorzi) possono consentire una biorisanamento completa, rapida ed efficiente di questi IPA attraverso effetti sinergici. In questa rassegna, ci concentriamo sui diversi percorsi metabolici e sulla loro diversità, sulla composizione e diversità genetica e sulle risposte/adattamenti cellulari dei batteri in grado di degradare il naftalene e i suoi derivati. Ciò fornirà informazioni ecologiche utili per le applicazioni sul campo e per l'ottimizzazione dei ceppi al fine di ottenere una biorisanamento efficiente.
Il rapido sviluppo industriale (petrolchimico, agricolo, farmaceutico, tessile, cosmetico, ecc.) ha contribuito alla prosperità economica globale e al miglioramento del tenore di vita. Questo sviluppo esponenziale ha portato alla produzione di un gran numero di composti organici sintetici (COS), utilizzati per la fabbricazione di diversi prodotti. Questi composti estranei, o COS, includono idrocarburi policiclici aromatici (IPA), pesticidi, erbicidi, plastificanti, coloranti, farmaci, organofosfati, ritardanti di fiamma, solventi organici volatili, ecc. Essi vengono emessi nell'atmosfera e negli ecosistemi acquatici e terrestri, dove hanno impatti multidimensionali, causando effetti dannosi su diverse forme di vita attraverso l'alterazione delle proprietà fisico-chimiche e della struttura della comunità (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Molti inquinanti aromatici hanno un impatto forte e distruttivo su numerosi ecosistemi intatti/punti caldi di biodiversità (ad esempio barriere coralline, calotte glaciali artiche/antartiche, laghi di alta montagna, sedimenti di acque profonde, ecc.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Recenti studi geomicrobiologici hanno dimostrato che la deposizione di materia organica sintetica (ad esempio inquinanti aromatici) e dei loro derivati ​​sulle superfici di strutture artificiali (ambiente costruito) (ad esempio siti del patrimonio culturale e monumenti in granito, pietra, legno e metallo) ne accelera il degrado (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Le attività umane possono intensificare e peggiorare il degrado biologico di monumenti ed edifici attraverso l'inquinamento atmosferico e i cambiamenti climatici (Liu et al. 2020). Questi contaminanti organici reagiscono con il vapore acqueo presente nell'atmosfera e si depositano sulla struttura, causando il degrado fisico e chimico del materiale. La biodegradazione è ampiamente riconosciuta come un insieme di cambiamenti indesiderati nell'aspetto e nelle proprietà dei materiali causati da organismi viventi che ne compromettono la conservazione (Pochon e Jaton, 1967). Un'ulteriore azione microbica (metabolismo) di questi composti può ridurre l'integrità strutturale, l'efficacia della conservazione e il valore culturale (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). D'altra parte, in alcuni casi, l'adattamento e la risposta microbica a queste strutture si sono rivelati benefici, in quanto i microrganismi formano biofilm e altre croste protettive che riducono il tasso di decadimento/decomposizione (Martino, 2016). Pertanto, lo sviluppo di strategie di conservazione efficaci e sostenibili a lungo termine per monumenti in pietra, metallo e legno richiede una comprensione approfondita dei processi chiave coinvolti in questo processo. Rispetto ai processi naturali (processi geologici, incendi boschivi, eruzioni vulcaniche, reazioni di piante e batteri), le attività umane comportano il rilascio di grandi quantità di idrocarburi policiclici aromatici (IPA) e altro carbonio organico (CO) negli ecosistemi. Molti IPA (idrocarburi policiclici aromatici) utilizzati in agricoltura (insetticidi e pesticidi come DDT, atrazina, carbaryl, pentaclorofenolo, ecc.), nell'industria (petrolio greggio, fanghi/rifiuti petroliferi, materie plastiche derivate dal petrolio, PCB, plastificanti, detergenti, disinfettanti, fumiganti, profumi e conservanti), nei prodotti per la cura personale (creme solari, disinfettanti, repellenti per insetti e muschi policiclici) e nelle munizioni (esplosivi come il 2,4,6-TNT) sono potenziali xenobiotici che possono avere un impatto sulla salute del pianeta (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna e Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Questo elenco può essere ampliato per includere composti derivati ​​dal petrolio (oli combustibili, lubrificanti, asfalteni), bioplastiche ad alto peso molecolare e liquidi ionici (Amde et al., 2015). La Tabella 1 elenca diversi inquinanti aromatici e le loro applicazioni in vari settori industriali. Negli ultimi anni, le emissioni antropogeniche di composti organici volatili, così come di anidride carbonica e altri gas serra, hanno iniziato ad aumentare (Dvorak et al., 2017). Tuttavia, gli impatti antropogenici superano significativamente quelli naturali. Inoltre, abbiamo scoperto che un certo numero di SOC persistono in molti ambienti e sono stati identificati come inquinanti emergenti con effetti negativi sui biomi (Figura 1). Agenzie ambientali come l'Agenzia per la Protezione Ambientale degli Stati Uniti (USEPA) hanno incluso molti di questi inquinanti nella loro lista di priorità a causa delle loro proprietà citotossiche, genotossiche, mutagene e cancerogene. Pertanto, sono necessarie normative rigorose sullo smaltimento e strategie efficaci per il trattamento/rimozione dei rifiuti dagli ecosistemi contaminati. Diversi metodi di trattamento fisico e chimico come la pirolisi, il trattamento termico ossidativo, l'aerazione dell'aria, la discarica, l'incenerimento, ecc. sono inefficaci e costosi e generano sottoprodotti corrosivi, tossici e difficili da trattare. Con la crescente consapevolezza ambientale a livello globale, i microrganismi in grado di degradare questi inquinanti e i loro derivati ​​(come quelli alogenati, nitro, alchilici e/o metilici) stanno attirando sempre maggiore attenzione (Fennell et al., 2004; Haritash e Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). L'utilizzo di questi microrganismi candidati autoctoni, da soli o in colture miste (colonie), per la rimozione degli inquinanti aromatici presenta vantaggi in termini di sicurezza ambientale, costi, efficienza, efficacia e sostenibilità. I ​​ricercatori stanno inoltre esplorando l'integrazione dei processi microbici con metodi redox elettrochimici, ovvero i sistemi bioelettrochimici (BES), come tecnologia promettente per il trattamento/la rimozione degli inquinanti (Huang et al., 2011). La tecnologia BES ha attirato sempre maggiore attenzione grazie alla sua elevata efficienza, al basso costo, alla sicurezza ambientale, al funzionamento a temperatura ambiente, ai materiali biocompatibili e alla capacità di recuperare sottoprodotti di valore (ad esempio, elettricità, carburante e sostanze chimiche) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). L'avvento del sequenziamento genomico ad alto rendimento e degli strumenti/metodi omici ha fornito una grande quantità di nuove informazioni sulla regolazione genetica, la proteomica e la flussomica delle reazioni di vari microrganismi degradatori. La combinazione di questi strumenti con la biologia dei sistemi ha ulteriormente migliorato la nostra comprensione della selezione e della messa a punto dei percorsi catabolici target nei microrganismi (ovvero, progettazione metabolica) per ottenere una biodegradazione efficiente ed efficace. Per progettare strategie di biorisanamento efficaci utilizzando microrganismi candidati idonei, è necessario comprendere il potenziale biochimico, la diversità metabolica, la composizione genetica e l'ecologia (autoecologia/sinocologia) dei microrganismi.
Figura 1. Fonti e percorsi degli IPA a basso peso molecolare attraverso vari ambienti e diversi fattori che influenzano la biota. Le linee tratteggiate rappresentano le interazioni tra gli elementi dell'ecosistema.
In questa rassegna, abbiamo cercato di riassumere i dati sulla degradazione di idrocarburi policiclici aromatici (IPA) semplici come il naftalene e i naftaleni sostituiti da parte di diversi isolati batterici, analizzando le vie metaboliche e la diversità, gli enzimi coinvolti nella degradazione, la composizione/il contenuto genico e la diversità, le risposte cellulari e vari aspetti della biorisanamento. La comprensione dei livelli biochimici e molecolari aiuterà a identificare ceppi ospiti idonei e la loro successiva ingegneria genetica per un efficace biorisanamento di tali inquinanti prioritari. Ciò contribuirà allo sviluppo di strategie per la creazione di consorzi batterici sito-specifici per un biorisanamento efficace.
La presenza di un gran numero di composti aromatici tossici e pericolosi (che soddisfano la regola di Huckel 4n + 2π elettroni, n = 1, 2, 3, …) rappresenta una seria minaccia per diversi comparti ambientali come aria, suolo, sedimenti e acque superficiali e sotterranee (Puglisi et al., 2007). Questi composti hanno un singolo anello benzenico (monociclici) o più anelli benzenici (policiclici) disposti in forma lineare, angolare o a cluster e mostrano stabilità (stabilità/instabilità) nell'ambiente grazie all'elevata energia di risonanza negativa e inerzia (inerzia), che può essere spiegata dalla loro idrofobicità e stato ridotto. Quando l'anello aromatico viene ulteriormente sostituito da gruppi metile (-CH3), carbossile (-COOH), idrossile (-OH) o solfonato (-HSO3), diventa più stabile, ha una maggiore affinità per le macromolecole ed è bioaccumulabile nei sistemi biologici (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Alcuni idrocarburi policiclici aromatici a basso peso molecolare (LMWAH), come il naftalene e i suoi derivati ​​[metilnaftalene, acido naftoico, naftalensolfonato e 1-naftil N-metilcarbammato (carbaryl)], sono stati inclusi nell'elenco degli inquinanti organici prioritari dall'Agenzia per la protezione ambientale degli Stati Uniti in quanto genotossici, mutageni e/o cancerogeni (Cerniglia, 1984). Il rilascio di questa classe di NM-PAH nell'ambiente può comportare il bioaccumulo di questi composti a tutti i livelli della catena alimentare, influenzando così la salute degli ecosistemi (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Le fonti e i percorsi degli IPA verso la biota avvengono principalmente attraverso la migrazione e le interazioni tra diverse componenti dell'ecosistema, come il suolo, le acque sotterranee, le acque superficiali, le colture e l'atmosfera (Arey e Atkinson, 2003). La Figura 1 mostra le interazioni e la distribuzione di diversi IPA a basso peso molecolare negli ecosistemi e i loro percorsi verso la biota/l'esposizione umana. Gli IPA si depositano sulle superfici a seguito dell'inquinamento atmosferico e attraverso la migrazione (deriva) delle emissioni dei veicoli, dei gas di scarico industriali (gassificazione del carbone, combustione e produzione di coke) e la loro deposizione. Attività industriali come la produzione di tessuti sintetici, coloranti e vernici; la conservazione del legno; la lavorazione della gomma; le attività di produzione del cemento; la produzione di pesticidi; e le applicazioni agricole sono le principali fonti di IPA nei sistemi terrestri e acquatici (Bamforth e Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Studi hanno dimostrato che i suoli nelle aree suburbane e urbane, vicino alle autostrade e nelle grandi città sono più suscettibili agli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) a causa delle emissioni provenienti da centrali elettriche, riscaldamento residenziale, traffico atmosferico e stradale e attività di costruzione (Suman et al., 2016). Uno studio del 2008 ha mostrato che gli IPA nel suolo vicino alle strade di New Orleans, Louisiana, USA, raggiungevano i 7189 μg/kg, mentre negli spazi aperti erano solo 2404 μg/kg. Analogamente, livelli di IPA fino a 300 μg/kg sono stati segnalati in aree vicine a siti di gassificazione del carbone in diverse città degli Stati Uniti (Kanaly e Harayama, 2000; Bamforth e Singleton, 2005). È stato riportato che i suoli di varie città indiane come Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni e Venkataraman, 2000) e Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) contengono elevate concentrazioni di IPA (idrocarburi policiclici aromatici). I composti aromatici vengono adsorbiti più facilmente dalle particelle del suolo, dalla sostanza organica e dai minerali argillosi, diventando così importanti serbatoi di carbonio negli ecosistemi (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Le principali fonti di IPA negli ecosistemi acquatici sono le precipitazioni (precipitazioni umide/secche e vapore acqueo), il deflusso urbano, lo scarico di acque reflue, la ricarica delle falde acquifere, ecc. (Srogi, 2007). Si stima che circa l'80% degli IPA negli ecosistemi marini derivi da precipitazioni, sedimentazione e scarichi di rifiuti (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Concentrazioni più elevate di IPA nelle acque superficiali o nel percolato proveniente dai siti di smaltimento dei rifiuti solidi finiscono per infiltrarsi nelle acque sotterranee, rappresentando una grave minaccia per la salute pubblica, dato che oltre il 70% della popolazione del Sud e del Sud-Est asiatico beve acqua di falda (Duttagupta et al., 2019). Un recente studio di Duttagupta et al. (2020) su analisi di fiumi (32) e acque sotterranee (235) del Bengala Occidentale, in India, ha rilevato che circa il 53% dei residenti urbani e il 44% dei residenti rurali (per un totale di 20 milioni di residenti) potrebbero essere esposti al naftalene (4,9–10,6 μg/L) e ai suoi derivati. Le diverse modalità di utilizzo del suolo e l'aumento dell'estrazione di acque sotterranee sono considerati i principali fattori che controllano il trasporto verticale (advezione) degli IPA a basso peso molecolare nel sottosuolo. È stato riscontrato che il deflusso agricolo, gli scarichi di acque reflue urbane e industriali e gli scarichi di rifiuti solidi/spazzatura sono influenzati dalla presenza di IPA nei bacini fluviali e nei sedimenti del sottosuolo. Le precipitazioni atmosferiche aggravano ulteriormente l'inquinamento da IPA. Elevate concentrazioni di IPA e dei loro derivati ​​alchilici (51 in totale) sono state segnalate in fiumi/bacini idrografici di tutto il mondo, come il fiume Fraser, il fiume Louan, il fiume Denso, il fiume Missouri, il fiume Anacostia, il fiume Ebro e il fiume Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Nei sedimenti del bacino del fiume Gange, il naftalene e il fenantrene sono risultati essere i più significativi (rilevati nel 70% dei campioni) (Duttagupta et al., 2019). Inoltre, studi hanno dimostrato che la clorazione dell'acqua potabile può portare alla formazione di IPA ossigenati e clorurati più tossici (Manoli e Samara, 1999). Gli IPA si accumulano nei cereali, nella frutta e nella verdura a seguito dell'assorbimento da parte delle piante da suoli, acque sotterranee e precipitazioni contaminati (Fismes et al., 2002). Molti organismi acquatici come pesci, cozze, vongole e gamberetti sono contaminati da IPA attraverso il consumo di cibo e acqua di mare contaminati, nonché attraverso tessuti e pelle (Mackay e Fraser, 2000). Anche i metodi di cottura/lavorazione come grigliatura, arrostimento, affumicatura, frittura, essiccazione, cottura al forno e cottura a carbone possono portare a quantità significative di IPA negli alimenti. Ciò dipende in gran parte dalla scelta del materiale per l'affumicatura, dal contenuto di idrocarburi fenolici/aromatici, dalla procedura di cottura, dal tipo di riscaldatore, dal contenuto di umidità, dall'apporto di ossigeno e dalla temperatura di combustione (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) sono stati rilevati anche nel latte a concentrazioni variabili (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). L'accumulo di questi IPA negli alimenti dipende anche dalle proprietà fisico-chimiche degli alimenti stessi, mentre i loro effetti tossici sono correlati alle funzioni fisiologiche, all'attività metabolica, all'assorbimento, alla distribuzione e alla distribuzione nell'organismo (Mechini et al., 2011).
La tossicità e gli effetti nocivi degli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) sono noti da tempo (Cherniglia, 1984). Gli idrocarburi policiclici aromatici a basso peso molecolare (IPA a due o tre anelli) possono legarsi covalentemente a diverse macromolecole come DNA, RNA e proteine ​​e sono cancerogeni (Santarelli et al., 2008). A causa della loro natura idrofobica, vengono separati dalle membrane lipidiche. Nell'uomo, le monoossigenasi del citocromo P450 ossidano gli IPA in epossidi, alcuni dei quali sono altamente reattivi (ad esempio, l'epossido di baediolo) e possono portare alla trasformazione delle cellule normali in cellule maligne (Marston et al., 2001). Inoltre, i prodotti di trasformazione degli IPA, come chinoni, fenoli, epossidi, dioli, ecc., sono più tossici dei composti di partenza. Alcuni IPA e i loro intermedi metabolici possono influenzare gli ormoni e vari enzimi del metabolismo, con conseguenti effetti negativi sulla crescita, sul sistema nervoso centrale, sul sistema riproduttivo e sul sistema immunitario (Swetha e Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). È stato riportato che l'esposizione a breve termine a IPA a basso peso molecolare può causare compromissione della funzionalità polmonare e trombosi nei soggetti asmatici, nonché aumentare il rischio di tumori della pelle, dei polmoni, della vescica e del tratto gastrointestinale (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Studi su animali hanno inoltre dimostrato che l'esposizione agli IPA può avere effetti negativi sulla funzione riproduttiva e sullo sviluppo, causando cataratta, danni renali ed epatici e ittero. È stato dimostrato che diversi prodotti di biotrasformazione degli IPA, come dioli, epossidi, chinoni e radicali liberi (cationi), formano addotti al DNA. È stato dimostrato che gli addotti stabili alterano il meccanismo di replicazione del DNA, mentre gli addotti instabili possono depurinare il DNA (principalmente in adenina e talvolta in guanina); entrambi possono generare errori che portano a mutazioni (Schweigert et al. 2001). Inoltre, i chinoni (benzo-/pan-) possono generare specie reattive dell'ossigeno (ROS), causando danni letali al DNA e ad altre macromolecole, compromettendo così la funzionalità e la vitalità dei tessuti (Ewa e Danuta 2017). È stato riportato che l'esposizione cronica a basse concentrazioni di pirene, bifenile e naftalene causa il cancro negli animali da esperimento (Diggs et al. 2012). Data la loro tossicità letale, la bonifica e la rimozione di questi IPA dai siti contaminati rappresentano una priorità.
Per rimuovere gli IPA (idrocarburi policiclici aromatici) da siti/ambienti contaminati sono stati utilizzati diversi metodi fisici e chimici. Processi come l'incenerimento, la declorazione, l'ossidazione UV, la fissazione e l'estrazione con solventi presentano numerosi svantaggi, tra cui la formazione di sottoprodotti tossici, la complessità del processo, problemi di sicurezza e normativi, la bassa efficienza e gli alti costi. Tuttavia, la biodegradazione microbica (detta biorisanamento) rappresenta un approccio alternativo promettente che prevede l'utilizzo di microrganismi sotto forma di colture pure o colonie. Rispetto ai metodi fisici e chimici, questo processo è ecocompatibile, non invasivo, economicamente vantaggioso e sostenibile. La biorisanamento può essere effettuata nel sito contaminato (in situ) o in un sito appositamente preparato (ex situ) ed è pertanto considerata un metodo di risanamento più sostenibile rispetto ai metodi fisici e chimici tradizionali (Juhasz e Naidu, 2000; Andreoni e Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
La comprensione delle fasi metaboliche microbiche coinvolte nella degradazione degli inquinanti aromatici ha enormi implicazioni scientifiche ed economiche per la sostenibilità ecologica e ambientale. Si stima che a livello globale siano immagazzinati 2,1 × 10¹⁸ grammi di carbonio (C) nei sedimenti e nei composti organici (petrolio, gas naturale e carbone, ovvero combustibili fossili), contribuendo in modo significativo al ciclo globale del carbonio. Tuttavia, la rapida industrializzazione, l'estrazione di combustibili fossili e le attività umane stanno esaurendo queste riserve di carbonio litosferico, rilasciando ogni anno nell'atmosfera circa 5,5 × 10¹⁵ g di carbonio organico (sotto forma di inquinanti) (Gonzalez-Gaya et al., 2019). La maggior parte di questo carbonio organico entra negli ecosistemi terrestri e marini attraverso la sedimentazione, il trasporto e il deflusso superficiale. Inoltre, i nuovi inquinanti sintetici derivati ​​dai combustibili fossili, come le materie plastiche, i plastificanti e gli stabilizzanti per materie plastiche (ftalati e i loro isomeri), inquinano gravemente gli ecosistemi marini, del suolo e acquatici e la loro biota, esacerbando così i rischi climatici globali. Diverse tipologie di microplastiche, nanoplastiche, frammenti di plastica e i loro monomeri tossici derivati ​​dal polietilene tereftalato (PET) si sono accumulati nell'Oceano Pacifico tra il Nord America e il Sud-est asiatico, formando la "Grande Isola di Plastica del Pacifico" e danneggiando la vita marina (Newell et al., 2020). Studi scientifici hanno dimostrato che non è possibile rimuovere tali inquinanti/rifiuti con metodi fisici o chimici. In questo contesto, i microrganismi più utili sono quelli in grado di metabolizzare ossidativamente gli inquinanti in anidride carbonica, energia chimica e altri sottoprodotti non tossici che entrano infine in altri processi di ciclo dei nutrienti (H, O, N, S, P, Fe, ecc.). Pertanto, comprendere l'ecofisiologia microbica della mineralizzazione degli inquinanti aromatici e il suo controllo ambientale è fondamentale per valutare il ciclo microbico del carbonio, il bilancio netto del carbonio e i futuri rischi climatici. Data l'urgente necessità di rimuovere tali composti dall'ambiente, sono emerse diverse eco-industrie focalizzate su tecnologie pulite. In alternativa, la valorizzazione dei rifiuti industriali/dei rifiuti chimici accumulati negli ecosistemi (ovvero l'approccio "dai rifiuti alla ricchezza") è considerata uno dei pilastri dell'economia circolare e degli obiettivi di sviluppo sostenibile (Close et al., 2012). Pertanto, la comprensione degli aspetti metabolici, enzimatici e genetici di questi potenziali candidati alla degradazione è di fondamentale importanza per la rimozione e la biorisanamento efficaci di tali inquinanti aromatici.
Tra i numerosi inquinanti aromatici, prestiamo particolare attenzione agli IPA a basso peso molecolare come il naftalene e i naftaleni sostituiti. Questi composti sono componenti principali di combustibili derivati ​​dal petrolio, coloranti tessili, prodotti di consumo, pesticidi (naftalina e repellenti per insetti), plastificanti e tannini e sono quindi ampiamente diffusi in molti ecosistemi (Preuss et al., 2003). Recenti studi evidenziano l'accumulo di concentrazioni di naftalene nei sedimenti delle falde acquifere, nelle acque sotterranee e nei suoli del sottosuolo, nelle zone vadose e nei letti dei fiumi, suggerendo la sua bioaccumulazione nell'ambiente (Duttagupta et al., 2019, 2020). La Tabella 2 riassume le proprietà fisico-chimiche, le applicazioni e gli effetti sulla salute del naftalene e dei suoi derivati. Rispetto ad altri IPA ad alto peso molecolare, il naftalene e i suoi derivati ​​sono meno idrofobici, più solubili in acqua e ampiamente distribuiti negli ecosistemi, pertanto vengono spesso utilizzati come substrati modello per studiare il metabolismo, la genetica e la diversità metabolica degli IPA. Un gran numero di microrganismi è in grado di metabolizzare il naftalene e i suoi derivati, e sono disponibili informazioni complete sui loro percorsi metabolici, enzimi e meccanismi di regolazione (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Inoltre, il naftalene e i suoi derivati ​​sono considerati composti prototipo per la valutazione dell'inquinamento ambientale grazie alla loro elevata abbondanza e biodisponibilità. L'Agenzia per la Protezione Ambientale degli Stati Uniti (EPA) stima che i livelli medi di naftalene siano pari a 5,19 μg per metro cubo derivanti dal fumo di sigaretta, principalmente a causa della combustione incompleta, e da 7,8 a 46 μg dal fumo laterale, mentre l'esposizione a creosoto e naftalene è da 100 a 10.000 volte superiore (Preuss et al. 2003). In particolare, è stato riscontrato che il naftalene presenta tossicità respiratoria e cancerogenicità specie-, regione- e sesso-specifiche. Sulla base di studi su animali, l'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) ha classificato il naftalene come "possibile cancerogeno per l'uomo" (Gruppo 2B)1. L'esposizione a naftaleni sostituiti, principalmente per inalazione o somministrazione parenterale (orale), causa danni al tessuto polmonare e aumenta l'incidenza di tumori polmonari nei ratti e nei topi (National Toxicology Program 2). Gli effetti acuti includono nausea, vomito, dolore addominale, diarrea, mal di testa, confusione, sudorazione profusa, febbre, tachicardia, ecc. D'altra parte, è stato riportato che l'insetticida carbammato ad ampio spettro carbaryl (1-naftil N-metilcarbammato) è tossico per gli invertebrati acquatici, gli anfibi, le api e gli esseri umani e ha dimostrato di inibire l'acetilcolinesterasi causando paralisi (Smulders et al., 2003; Bulen e Distel, 2011). Pertanto, comprendere i meccanismi di degradazione microbica, regolazione genetica, reazioni enzimatiche e cellulari è fondamentale per sviluppare strategie di biorisanamento in ambienti contaminati.
Tabella 2. Informazioni dettagliate sulle proprietà fisico-chimiche, gli usi, i metodi di identificazione e le malattie associate al naftalene e ai suoi derivati.
Negli ambienti inquinati, gli inquinanti aromatici idrofobici e lipofili possono causare una varietà di effetti cellulari sul microbioma ambientale (comunità), come cambiamenti nella fluidità e nella permeabilità della membrana, rigonfiamento del doppio strato lipidico, interruzione del trasferimento di energia (catena di trasporto degli elettroni/forza motrice protonica) e attività delle proteine ​​associate alla membrana (Sikkema et al., 1995). Inoltre, alcuni intermedi solubili come i catecoli e i chinoni generano specie reattive dell'ossigeno (ROS) e formano addotti con il DNA e le proteine ​​(Penning et al., 1999). Pertanto, l'abbondanza di tali composti negli ecosistemi esercita una pressione selettiva sulle comunità microbiche affinché diventino degradatori efficienti a vari livelli fisiologici, tra cui assorbimento/trasporto, trasformazione intracellulare, assimilazione/utilizzo e compartimentalizzazione.
Una ricerca nel Ribosomal Database Project-II (RDP-II) ha rivelato che un totale di 926 specie batteriche sono state isolate da terreni di coltura o colture di arricchimento contaminati con naftalene o suoi derivati. Il gruppo Proteobacteria presentava il maggior numero di rappresentanti (n = 755), seguito da Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) e batteri non classificati (8) (Figura 2). I rappresentanti dei γ-Proteobacteria (Pseudomonadales e Xanthomonadales) dominavano tutti i gruppi Gram-negativi con un alto contenuto di G+C (54%), mentre Clostridiales e Bacillales (30%) erano gruppi Gram-positivi con un basso contenuto di G+C. È stato riportato che i batteri del genere Pseudomonas (il numero più elevato, 338 specie) sono in grado di degradare il naftalene e i suoi derivati ​​metilici in diversi ecosistemi inquinati (catrame di carbone, petrolio, greggio, fanghi, sversamenti di petrolio, acque reflue, rifiuti organici e discariche), così come in ecosistemi intatti (suolo, fiumi, sedimenti e acque sotterranee) (Figura 2). Inoltre, studi di arricchimento e analisi metagenomiche di alcune di queste regioni hanno rivelato che specie di Legionella e Clostridium non coltivate potrebbero avere capacità degradative, indicando la necessità di coltivare questi batteri per studiare nuove vie metaboliche e la diversità metabolica.
Figura 2. Diversità tassonomica e distribuzione ecologica dei rappresentanti batterici in ambienti contaminati da naftalene e derivati ​​del naftalene.
Tra i vari microrganismi in grado di degradare gli idrocarburi aromatici, la maggior parte è capace di degradare il naftalene come unica fonte di carbonio ed energia. La sequenza di eventi coinvolti nel metabolismo del naftalene è stata descritta per Pseudomonas sp. (ceppi: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 e CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 e altri ceppi (ND6 e AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis e Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Il metabolismo è avviato da una diossigenasi multicomponente [naftalene diossigenasi (NDO), una diossigenasi idrossilante dell'anello] che catalizza l'ossidazione di uno degli anelli aromatici del naftalene utilizzando l'ossigeno molecolare come altro substrato, convertendo il naftalene in cis-naftalendiolo (Figura 3). Il cis-diidrodiolo è convertita in 1,2-diidrossinaftalene da una deidrogenasi. Una diossigenasi che scinde l'anello, la 1,2-diidrossinaftalene diossigenasi (12DHNDO), converte l'1,2-diidrossinaftalene in acido 2-idrossicromene-2-carbossilico. L'isomerizzazione cis-trans enzimatica produce trans-o-idrossibenzilidenpiruvato, che viene scisso dall'idratasi aldolasi in aldeide salicilica e piruvato. L'acido organico piruvato è stato il primo composto C3 derivato dallo scheletro carbonioso del naftalene e indirizzato nella via metabolica centrale del carbonio. Inoltre, la salicilaldeide deidrogenasi NAD+-dipendente converte la salicilaldeide in acido salicilico. Il metabolismo in questa fase è chiamato "via superiore" della degradazione del naftalene. Questa via è molto comune nella maggior parte dei batteri che degradano il naftalene. Tuttavia, ci sono Vi sono alcune eccezioni; ad esempio, nel Bacillus hamburgii 2 termofilo, la degradazione del naftalene è avviata dalla naftalene 2,3-diossigenasi per formare 2,3-diidrossinaftalene (Annweiler et al., 2000).
Figura 3. Vie metaboliche di degradazione del naftalene, del metilnaftalene, dell'acido naftoico e del carbaryl. I numeri cerchiati rappresentano gli enzimi responsabili della conversione sequenziale del naftalene e dei suoi derivati ​​nei prodotti successivi. 1 — naftalene diossigenasi (NDO); 2, cis-diidrodiolo deidrogenasi; 3, 1,2-diidrossinaftalene diossigenasi; 4, 2-idrossicromene-2-acido carbossilico isomerasi; 5, trans-O-idrossibenzilidenpiruvato idratasi aldolasi; 6, salicilaldeide deidrogenasi; 7, salicilato 1-idrossilasi; 8, catecolo 2,3-diossigenasi (C23DO); 9, 2-idrossimuconato semialdeide deidrogenasi; 10, 2-ossopent-4-enoato idratasi; 11, 4-idrossi-2-ossopentanoato aldolasi; 12, acetaldeide deidrogenasi; 13, catecol-1,2-diossigenasi (C12DO); 14, muconato cicloisomerasi; 15, muconolattone delta-isomerasi; 16, β-chetoadipatonollattone idrolasi; 17, β-chetoadipato succinil-CoA transferasi; 18, β-chetoadipato-CoA tiolasi; 19, succinil-CoA: acetil-CoA succiniltransferasi; 20, salicilato 5-idrossilasi; 21 – gentisato 1,2-diossigenasi (GDO); 22, maleilpiruvato isomerasi; 23, fumarilpiruvato idrolasi; 24, metilnaftalene idrossilasi (NDO); 25, idrossimetilnaftalene deidrogenasi; 26, naftaldeide deidrogenasi; 27, 3-formilsalicilato ossidasi; 28, idrossiisoftalato decarbossilasi; 29, carbaryl idrolasi (CH); 30, 1-naftolo-2-idrossilasi.
A seconda dell'organismo e del suo corredo genetico, l'acido salicilico risultante viene ulteriormente metabolizzato attraverso la via del catecolo utilizzando la salicilato 1-idrossilasi (S1H) o attraverso la via del gentisato utilizzando la salicilato 5-idrossilasi (S5H) (Figura 3). Poiché l'acido salicilico è il principale intermedio nel metabolismo del naftalene (via superiore), le fasi che portano dall'acido salicilico all'intermedio TCA sono spesso indicate come via inferiore e i geni sono organizzati in un singolo operone. È comune osservare che i geni nell'operone della via superiore (nah) e nell'operone della via inferiore (sal) sono regolati da fattori regolatori comuni; ad esempio, NahR e l'acido salicilico agiscono come induttori, consentendo a entrambi gli operoni di metabolizzare completamente il naftalene (Phale et al., 2019, 2020).
Inoltre, il catecolo viene scisso ciclicamente in 2-idrossimuconato semialdeide attraverso la via meta dalla catecolo 2,3-diossigenasi (C23DO) (Yen et al., 1988) e ulteriormente idrolizzato dalla 2-idrossimuconato semialdeide idrolasi per formare acido 2-idrossipent-2,4-dienoico. Il 2-idrossipent-2,4-dienoato viene quindi convertito in piruvato e acetaldeide da un'idratasi (2-ossopent-4-enoato idratasi) e da un'aldolasi (4-idrossi-2-ossopentanoato aldolasi) e quindi entra nella via centrale del carbonio (Figura 3). In alternativa, il catecolo viene scisso ciclicamente in cis,cis-muconato attraverso la via orto dalla catecolo 1,2-ossigenasi (C12DO). La muconato cicloisomerasi, la muconolattone isomerasi e la β-chetoadipato-nollattone idrolasi convertono il cis,cis-muconato in 3-ossoadipato, che entra nella via metabolica centrale del carbonio attraverso il succinil-CoA e l'acetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (Figura 3).
Nella via metabolica del gentisato (2,5-diidrossibenzoato), l'anello aromatico viene scisso dalla gentisato 1,2-diossigenasi (GDO) per formare maleilpiruvato. Questo prodotto può essere idrolizzato direttamente a piruvato e malato, oppure può essere isomerizzato per formare fumarilpiruvato, che può poi essere idrolizzato a piruvato e fumarato (Larkin e Day, 1986). La scelta della via metabolica alternativa è stata osservata sia nei batteri Gram-negativi che in quelli Gram-positivi a livello biochimico e genetico (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). I batteri Gram-negativi (Pseudomonas) preferiscono utilizzare l'acido salicilico, che è un induttore del metabolismo del naftalene, decarbossilandolo a catecolo tramite la salicilato 1-idrossilasi (Gibson e Subramanian, 1984). D'altra parte, nei batteri Gram-positivi (Rhodococcus), la salicilato 5-idrossilasi converte l'acido salicilico in acido gentisico, mentre l'acido salicilico non ha alcun effetto induttivo sulla trascrizione dei geni del naftalene (Grund et al., 1992) (Figura 3).
È stato riportato che specie come Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, e specie di Pseudomonas e Mycobacterium possono degradare il monometilnaftalene o il dimetilnaftalene (Dean-Raymond e Bartha, 1975; Cane e Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Tra queste, il percorso di degradazione del 1-metilnaftalene e del 2-metilnaftalene di Pseudomonas sp. CSV86 è stato chiaramente studiato a livello biochimico ed enzimatico (Mahajan et al., 1994). L'1-metilnaftalene viene metabolizzato attraverso due vie metaboliche. In primo luogo, l'anello aromatico (l'anello non sostituito del metilnaftalene) viene idrossilato per formare il cis-1,2-diidrossi-1,2-diidro-8-metilnaftalene, che viene ulteriormente ossidato a salicilato di metile e metilcatecolo, e quindi entra nella via metabolica centrale del carbonio dopo la scissione dell'anello (Figura 3). Questa via metabolica è chiamata "via della fonte di carbonio". Nella seconda "via di detossificazione", il gruppo metilico può essere idrossilato dall'NDO per formare l'1-idrossimetilnaftalene, che viene ulteriormente ossidato ad acido 1-naftoico ed escreto nel mezzo di coltura come prodotto finale. Studi hanno dimostrato che il ceppo CSV86 non è in grado di crescere utilizzando acido 1- e 2-naftoico come unica fonte di carbonio ed energia, confermando il suo percorso di detossificazione (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). Nel 2-metilnaftalene, il gruppo metilico subisce un'idrossilazione da parte dell'idrossilasi per formare 2-idrossimetilnaftalene. Inoltre, l'anello non sostituito dell'anello naftalenico subisce un'idrossilazione dell'anello per formare un diidrodiolo, che viene ossidato a 4-idrossimetilcatecolo in una serie di reazioni catalizzate da enzimi ed entra nella via metabolica centrale del carbonio attraverso la via di scissione dell'anello meta. Analogamente, è stato riportato che S. paucimobilis 2322 utilizza NDO per idrossilare il 2-metilnaftalene, che viene ulteriormente ossidato per formare salicilato di metile e metilcatecolo (Dutta et al., 1998).
Gli acidi naftoici (sostituiti/non sostituiti) sono sottoprodotti di detossificazione/biotrasformazione che si formano durante la degradazione del metilnaftalene, del fenantrene e dell'antracene e vengono rilasciati nel terreno di coltura esausto. È stato riportato che l'isolato del suolo Stenotrophomonas maltophilia CSV89 è in grado di metabolizzare l'acido 1-naftoico come fonte di carbonio (Phale et al., 1995). Il metabolismo inizia con la diidrossilazione dell'anello aromatico per formare 1,2-diidrossi-8-carbossinaftalene. Il diolo risultante viene ossidato a catecolo attraverso 2-idrossi-3-carbossibenzilidenpiruvato, acido 3-formilsalicilico, acido 2-idrossiisoftalico e acido salicilico ed entra nella via metabolica centrale del carbonio attraverso la via di scissione dell'anello meta (Figura 3).
Il carbaryl è un pesticida appartenente alla classe dei naftil carbammati. Dalla Rivoluzione Verde in India negli anni '70, l'uso di fertilizzanti chimici e pesticidi ha portato a un aumento delle emissioni di idrocarburi policiclici aromatici (IPA) provenienti da fonti agricole diffuse (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Si stima che il 55% (85.722.000 ettari) della superficie coltivata totale in India sia trattata con pesticidi chimici. Negli ultimi cinque anni (2015-2020), il settore agricolo indiano ha utilizzato in media dalle 55.000 alle 60.000 tonnellate di pesticidi all'anno (Dipartimento delle Cooperative e del Benessere degli Agricoltori, Ministero dell'Agricoltura, Governo dell'India, agosto 2020). Nelle pianure settentrionali e centrali del Gange (gli stati con la più alta popolazione e densità di popolazione), l'uso di pesticidi sulle colture è diffuso, con una predominanza di insetticidi. Il carbaryl (1-naftil-N-metilcarbammato) è un insetticida carbammato ad ampio spettro, da moderatamente ad altamente tossico, utilizzato nell'agricoltura indiana a un dosaggio medio di 100-110 tonnellate. Viene comunemente venduto con il nome commerciale Sevin ed è impiegato per il controllo di insetti (afidi, formiche rosse, pulci, acari, ragni e molti altri parassiti esterni) che colpiscono diverse colture (mais, soia, cotone, frutta e verdura). Alcuni microrganismi come Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus e Arthrobacter possono essere utilizzati anche per il controllo di altri parassiti. È stato riportato che RC100 può degradare il carbaryl (Larkin e Day, 1986; Chapalamadugu e Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha e Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Il percorso di degradazione del carbaryl è stato ampiamente studiato a livello biochimico, enzimatico e genetico in isolati del suolo di Pseudomonas sp. Ceppi C4, C5 e C6 (Swetha e Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Fig. 3). Il percorso metabolico inizia con l'idrolisi del legame estere da parte della carbaryl idrolasi (CH) per formare 1-naftolo, metilammina e anidride carbonica. Il 1-naftolo viene quindi convertito in 1,2-diidrossinaftalene dall'enzima 1-naftolo idrossilasi (1-NH), che viene ulteriormente metabolizzato attraverso la via del carbonio centrale tramite salicilato e gentisato. È stato riportato che alcuni batteri in grado di degradare il carbaryl lo metabolizzano in acido salicilico tramite la scissione dell'anello orto del catecolo (Larkin e Day, 1986; Chapalamadugu e Chaudhry, 1991). In particolare, i batteri che degradano il naftalene metabolizzano principalmente l'acido salicilico tramite il catecolo, mentre i batteri che degradano il carbaryl preferiscono metabolizzare l'acido salicilico attraverso la via del gentisato.
I derivati ​​dell'acido naftalensolfonico/disolfonico e dell'acido naftilamminosolfonico possono essere utilizzati come intermedi nella produzione di coloranti azoici, agenti bagnanti, disperdenti, ecc. Sebbene questi composti abbiano una bassa tossicità per l'uomo, le valutazioni di citotossicità hanno dimostrato che sono letali per pesci, dafnie e alghe (Greim et al., 1994). È stato riportato che i rappresentanti del genere Pseudomonas (ceppi A3, C22) iniziano il metabolismo mediante una doppia idrossilazione dell'anello aromatico contenente il gruppo acido solfonico per formare un diidrodiolo, che viene ulteriormente convertito in 1,2-diidrossinaftalene mediante scissione spontanea del gruppo solfito (Brilon et al., 1981). Il 1,2-diidrossinaftalene risultante viene catabolizzato attraverso la via classica del naftalene, ovvero la via del catecolo o del gentisato (Figura 4). È stato dimostrato che l'acido aminonaftalensolfonico e l'acido idrossinaftalensolfonico possono essere completamente degradati da consorzi batterici misti con vie cataboliche complementari (Nortemann et al., 1986). È stato dimostrato che un membro del consorzio desolfora l'acido aminonaftalensolfonico o l'acido idrossinaftalensolfonico mediante 1,2-diossigenazione, mentre l'aminosalicilato o l'idrossisalicilato vengono rilasciati nel mezzo di coltura come metaboliti terminali e successivamente assorbiti da altri membri del consorzio. L'acido naftalendisolfonico è relativamente polare ma scarsamente biodegradabile e può quindi essere metabolizzato attraverso diverse vie. La prima desolforazione avviene durante la diidrossilazione regioselettiva dell'anello aromatico e del gruppo acido solfonico; La seconda desolforazione avviene durante l'idrossilazione dell'acido 5-solfosalicilico da parte della salicilato 5-idrossilasi per formare acido gentisico, che entra nella via metabolica centrale del carbonio (Brilon et al., 1981) (Figura 4). Gli enzimi responsabili della degradazione del naftalene sono anche responsabili del metabolismo del naftalensolfonato (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figura 4. Vie metaboliche per la degradazione del naftalensolfonato. I numeri all'interno dei cerchi rappresentano gli enzimi responsabili del metabolismo del naftilsolfonato, simili/identici agli enzimi descritti nella Figura 3.
Gli IPA a basso peso molecolare (LMW-PAH) sono riducibili, idrofobici e scarsamente solubili, e pertanto non soggetti a degradazione naturale. Tuttavia, i microrganismi aerobici sono in grado di ossidarli assorbendo ossigeno molecolare (O2). Questi enzimi appartengono principalmente alla classe delle ossidoreduttasi e possono svolgere diverse reazioni come l'idrossilazione dell'anello aromatico (mono- o diidrossilazione), la deidrogenazione e la scissione dell'anello aromatico. I prodotti ottenuti da queste reazioni si trovano in uno stato di ossidazione più elevato e vengono metabolizzati più facilmente attraverso la via metabolica centrale del carbonio (Phale et al., 2020). È stato riportato che gli enzimi coinvolti nella via di degradazione sono inducibili. L'attività di questi enzimi è molto bassa o trascurabile quando le cellule vengono coltivate su semplici fonti di carbonio come glucosio o acidi organici. La Tabella 3 riassume i vari enzimi (ossigenasi, idrolasi, deidrogenasi, ossidasi, ecc.) coinvolti nel metabolismo del naftalene e dei suoi derivati.
Tabella 3. Caratteristiche biochimiche degli enzimi responsabili della degradazione del naftalene e dei suoi derivati.
Studi con radioisotopi (18O2) hanno dimostrato che l'incorporazione di O2 molecolare negli anelli aromatici da parte delle ossigenasi è la fase più importante nell'attivazione dell'ulteriore biodegradazione di un composto (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). L'incorporazione di un atomo di ossigeno (O) dall'ossigeno molecolare (O2) nel substrato è avviata da monoossigenasi endogene o esogene (chiamate anche idrossilasi). Un altro atomo di ossigeno viene ridotto ad acqua. Le monoossigenasi esogene riducono la flavina con NADH o NADPH, mentre nelle endomonoossigenasi la flavina viene ridotta dal substrato. La posizione dell'idrossilazione determina la diversità nella formazione del prodotto. Ad esempio, la salicilato 1-idrossilasi idrossila l'acido salicilico in posizione C1, formando catecolo. D'altra parte, la salicilato 5-idrossilasi multicomponente (contenente subunità reduttasi, ferredossina e ossigenasi) idrossila l'acido salicilico in posizione C5, formando acido gentisico (Yamamoto et al., 1965).
Le diossigenasi incorporano due atomi di O2 nel substrato. A seconda dei prodotti formati, si dividono in diossigenasi che idrossilano l'anello e diossigenasi che scindono l'anello. Le diossigenasi che idrossilano l'anello convertono i substrati aromatici in cis-diidrodioli (ad esempio, naftalene) e sono ampiamente diffuse tra i batteri. Ad oggi, è stato dimostrato che gli organismi contenenti diossigenasi che idrossilano l'anello sono in grado di crescere su diverse fonti di carbonio aromatico, e questi enzimi sono classificati come NDO (naftalene), toluene diossigenasi (TDO, toluene) e bifenil diossigenasi (BPDO, bifenile). Sia la NDO che la BPDO possono catalizzare la doppia ossidazione e l'idrossilazione della catena laterale di vari idrocarburi aromatici policiclici (toluene, nitrotoluene, xilene, etilbenzene, naftalene, bifenile, fluorene, indolo, metilnaftalene, naftalensolfonato, fenantrene, antracene, acetofenone, ecc.) (Boyd e Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). La NDO è un sistema multicomponente costituito da un'ossidoreduttasi, una ferredossina e un componente ossigenasi contenente il sito attivo (Gibson e Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). L'unità catalitica della NDO è costituita da una grande subunità α e una piccola subunità β disposte in una configurazione α3β3. La NDO appartiene a una vasta famiglia di ossigenasi e la sua subunità α contiene un sito di Rieske [2Fe-2S] e un ferro mononucleare non eme, che determina la specificità del substrato della NDO (Parales et al., 1998). Tipicamente, in un ciclo catalitico, due elettroni dalla riduzione del nucleotide piridinico vengono trasferiti allo ione Fe(II) nel sito attivo tramite una reduttasi, una ferredossina e un sito di Rieske. Gli equivalenti riducenti attivano l'ossigeno molecolare, che è un prerequisito per la diidrossilazione del substrato (Ferraro et al., 2005). Ad oggi, solo poche NDO sono state purificate e caratterizzate in dettaglio da diversi ceppi e il controllo genetico delle vie metaboliche coinvolte nella degradazione del naftalene è stato studiato in dettaglio (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Le diossigenasi che scindono l'anello (enzimi che scindono l'anello in posizione endo o orto ed enzimi che scindono l'anello in posizione esodiolica o meta) agiscono sui composti aromatici idrossilati. Ad esempio, la diossigenasi che scinde l'anello in posizione orto è la catecol-1,2-diossigenasi, mentre la diossigenasi che scinde l'anello in posizione meta è la catecol-2,3-diossigenasi (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Oltre alle varie ossigenasi, esistono anche diverse deidrogenasi responsabili della deidrogenazione di diidrodioli aromatici, alcoli e aldeidi, che utilizzano NAD+/NADP+ come accettori di elettroni e che rappresentano alcuni degli enzimi più importanti coinvolti nel metabolismo (Gibson e Subramanian, 1984; Shaw e Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Gli enzimi come le idrolasi (esterasi, amidasi) rappresentano una seconda importante classe di enzimi che utilizzano l'acqua per scindere i legami covalenti e mostrano un'ampia specificità di substrato. La carbaryl idrolasi e altre idrolasi sono considerate componenti del periplasma (transmembrana) nei batteri Gram-negativi (Kamini et al., 2018). Il carbaryl possiede sia un legame amidico che un legame estere; pertanto, può essere idrolizzato sia da esterasi che da amidasi per formare 1-naftolo. È stato riportato che il carbaryl nel ceppo AC10023 di Rhizobium e nel ceppo RC100 di Arthrobacter funziona rispettivamente come esterasi e amidasi. Il carbaryl nel ceppo RC100 di Arthrobacter funziona anche come amidasi. È stato dimostrato che RC100 idrolizza quattro insetticidi della classe N-metilcarbammato come carbaryl, metomil, acido mefenamico e XMC (Hayaatsu et al., 2001). È stato riportato che CH in Pseudomonas sp. C5pp può agire su carbaryl (attività del 100%) e 1-naftil acetato (attività del 36%), ma non su 1-naftilacetammide, indicando che si tratta di un'esterasi (Trivedi et al., 2016).
Studi biochimici, modelli di regolazione enzimatica e analisi genetiche hanno dimostrato che i geni per la degradazione del naftalene sono costituiti da due unità regolatorie inducibili o "operoni": nah (la "via a monte", che converte il naftalene in acido salicilico) e sal (la "via a valle", che converte l'acido salicilico nella via metabolica centrale del carbonio tramite il catecolo). L'acido salicilico e i suoi analoghi possono agire da induttori (Shamsuzzaman e Barnsley, 1974). In presenza di glucosio o acidi organici, l'operone viene represso. La Figura 5 mostra l'organizzazione genetica completa della degradazione del naftalene (in forma di operone). Sono state descritte diverse varianti/forme del gene nah (ndo/pah/dox) che presentano un'elevata omologia di sequenza (90%) tra tutte le specie di Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). I geni della via metabolica a monte del naftalene erano generalmente disposti in un ordine consensuale, come mostrato nella Figura 5A. Un altro gene, nahQ, è stato segnalato come coinvolto nel metabolismo del naftalene ed era solitamente localizzato tra nahC e nahE, ma la sua effettiva funzione deve ancora essere chiarita. Analogamente, il gene nahY, responsabile della chemiotassi sensibile al naftalene, è stato trovato all'estremità distale dell'operone nah in alcuni membri. In Ralstonia sp., il gene U2 che codifica per la glutatione S-transferasi (gsh) è stato trovato localizzato tra nahAa e nahAb, ma non ha influenzato le caratteristiche di utilizzo del naftalene (Zylstra et al., 1997).
Figura 5. Organizzazione genetica e diversità osservate durante la degradazione del naftalene tra le specie batteriche; (A) Via metabolica superiore del naftalene, metabolismo del naftalene ad acido salicilico; (B) Via metabolica inferiore del naftalene, acido salicilico tramite catecolo alla via metabolica centrale del carbonio; (C) acido salicilico tramite gentisato alla via metabolica centrale del carbonio.
Il “percorso inferiore” (operone sal) è tipicamente costituito da nahGTHINLMOKJ e converte il salicilato in piruvato e acetaldeide attraverso la via di scissione del metaring del catecolo. Il gene nahG (che codifica per la salicilato idrossilasi) è risultato conservato all'estremità prossimale dell'operone (Fig. 5B). Rispetto ad altri ceppi in grado di degradare il naftalene, in P. putida CSV86 gli operoni nah e sal sono in tandem e molto strettamente correlati (circa 7,5 kb). In alcuni batteri Gram-negativi, come Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 e P. putida AK5, il naftalene viene metabolizzato come metabolita centrale del carbonio attraverso la via del gentisato (nella forma dell'operone sgp/nag). La cassetta genica è tipicamente rappresentata nella forma nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, dove nagR (che codifica per un regolatore di tipo LysR) si trova all'estremità superiore (Figura 5C).
Il carbaryl entra nel ciclo centrale del carbonio attraverso il metabolismo del 1-naftolo, del 1,2-diidrossinaftalene, dell'acido salicilico e dell'acido gentisico (Figura 3). Sulla base di studi genetici e metabolici, è stato proposto di suddividere questo percorso in "a monte" (conversione del carbaryl in acido salicilico), "intermedio" (conversione dell'acido salicilico in acido gentisico) e "a valle" (conversione dell'acido gentisico in intermedi del ciclo centrale del carbonio) (Singh et al., 2013). L'analisi genomica di C5pp (supercontig A, 76,3 kb) ha rivelato che il gene mcbACBDEF è coinvolto nella conversione del carbaryl in acido salicilico, seguito da mcbIJKL nella conversione dell'acido salicilico in acido gentisico e da mcbOQP nella conversione dell'acido gentisico in intermedi del carbonio centrale (fumarato e piruvato, Trivedi et al., 2016) (Figura 6).
È stato riportato che gli enzimi coinvolti nella degradazione degli idrocarburi aromatici (tra cui naftalene e acido salicilico) possono essere indotti dai corrispondenti composti e inibiti da semplici fonti di carbonio come il glucosio o gli acidi organici (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Tra le varie vie metaboliche del naftalene e dei suoi derivati, le caratteristiche regolatorie del naftalene e del carbaryl sono state studiate in una certa misura. Per il naftalene, i geni sia nella via a monte che in quella a valle sono regolati da NahR, un regolatore positivo trans-agente di tipo LysR. È necessario per l'induzione del gene nah da parte dell'acido salicilico e la sua successiva espressione ad alto livello (Yen e Gunsalus, 1982). Inoltre, studi hanno dimostrato che il fattore integrativo dell'ospite (IHF) e XylR (regolatore trascrizionale dipendente da sigma 54) sono fondamentali anche per l'attivazione trascrizionale dei geni nel metabolismo del naftalene (Ramos et al., 1997). Studi hanno dimostrato che gli enzimi della via di apertura dell'anello meta del catecolo, ovvero la catecolo 2,3-diossigenasi, sono indotti in presenza di naftalene e/o acido salicilico (Basu et al., 2006). Studi hanno dimostrato che gli enzimi della via di apertura dell'anello orto del catecolo, ovvero la catecolo 1,2-diossigenasi, sono indotti in presenza di acido benzoico e cis,cis-muconato (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Nel ceppo C5pp, cinque geni, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR e mcbS, codificano per regolatori appartenenti alla famiglia LysR/TetR di regolatori trascrizionali responsabili del controllo della degradazione del carbaryl. Il gene omologo mcbG è risultato essere strettamente correlato al regolatore di tipo LysR PhnS (58% di identità amminoacidica) coinvolto nel metabolismo del fenantrene in Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Il gene mcbH è risultato coinvolto nella via metabolica intermedia (conversione dell'acido salicilico in acido gentisico) e appartiene al regolatore trascrizionale di tipo LysR NagR/DntR/NahR in Pseudomonas e Burkholderia. È stato riportato che i membri di questa famiglia riconoscono l'acido salicilico come molecola effettore specifica per l'induzione dei geni di degradazione. D'altra parte, tre geni, mcbN, mcbR e mcbS, appartenenti ai regolatori trascrizionali di tipo LysR e TetR, sono stati identificati nella via metabolica a valle (metaboliti della via del carbonio centrale del gentisato).
Nei procarioti, i processi di trasferimento genico orizzontale (acquisizione, scambio o trasferimento) tramite plasmidi, trasposoni, profagi, isole genomiche ed elementi coniugativi integrativi (ICE) sono le principali cause di plasticità nei genomi batterici, che portano all'acquisizione o alla perdita di funzioni/caratteristiche specifiche. Ciò consente ai batteri di adattarsi rapidamente a diverse condizioni ambientali, fornendo potenziali vantaggi metabolici adattativi all'ospite, come la degradazione di composti aromatici. I cambiamenti metabolici sono spesso ottenuti attraverso la messa a punto degli operoni di degradazione, dei loro meccanismi regolatori e delle specificità enzimatiche, il che facilita la degradazione di una gamma più ampia di composti aromatici (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). È stato scoperto che le cassette geniche per la degradazione del naftalene sono localizzate su una varietà di elementi mobili come plasmidi (coniugativi e non coniugativi), trasposoni, genomi, ICE e combinazioni di diverse specie batteriche (Figura 5). In Pseudomonas G7, gli operoni nah e sal del plasmide NAH7 sono trascritti nella stessa direzione e fanno parte di un trasposone difettivo che richiede la trasposasi Tn4653 per la mobilitazione (Sota et al., 2006). Nel ceppo di Pseudomonas NCIB9816-4, il gene è stato trovato sul plasmide coniugativo pDTG1 come due operoni (distanti circa 15 kb) che sono stati trascritti in direzioni opposte (Dennis e Zylstra, 2004). Nel ceppo AK5 di Pseudomonas putida, il plasmide non coniugativo pAK5 codifica l'enzima responsabile della degradazione del naftalene attraverso la via del gentisato (Izmalkova et al., 2013). Nel ceppo PMD-1 di Pseudomonas, l'operone nah è localizzato sul cromosoma, mentre l'operone sal è localizzato sul plasmide coniugativo pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Tuttavia, in Pseudomonas stutzeri AN10, tutti i geni di degradazione del naftalene (operoni nah e sal) sono localizzati sul cromosoma e sono presumibilmente reclutati attraverso eventi di trasposizione, ricombinazione e riarrangiamento (Bosch et al., 2000). In Pseudomonas sp. Nel genoma del ceppo CSV86, gli operoni nah e sal sono localizzati sotto forma di ICE (ICECSV86). La struttura è protetta da tRNAGly seguito da ripetizioni dirette che indicano siti di ricombinazione/attacco (attR e attL) e da un'integrasi di tipo fagico situata ad entrambe le estremità del tRNAGly, risultando quindi strutturalmente simile all'elemento ICEclc (ICEclcB13 in Pseudomonas knackmusii per la degradazione del clorocatecolo). È stato riportato che i geni presenti sull'ICE possono essere trasferiti per coniugazione con una frequenza di trasferimento estremamente bassa (10⁻⁸), trasferendo così le proprietà di degradazione al ricevente (Basu e Phale, 2008; Phale et al., 2019).
La maggior parte dei geni responsabili della degradazione del carbaryl si trova sui plasmidi. Arthrobacter sp. RC100 contiene tre plasmidi (pRC1, pRC2 e pRC300), di cui due plasmidi coniugativi, pRC1 e pRC2, codificano gli enzimi che convertono il carbaryl in gentisato. D'altra parte, gli enzimi coinvolti nella conversione del gentisato nei metaboliti del carbonio centrale si trovano sul cromosoma (Hayaatsu et al., 1999). Batteri del genere Rhizobium. Ceppo AC100, utilizzato per la conversione del carbaryl in 1-naftolo, contengono il plasmide pAC200, che porta il gene cehA che codifica per CH come parte del trasposone Tnceh circondato da sequenze simili a elementi di inserzione (istA e istB) (Hashimoto et al., 2002). Nel ceppo CF06 di Sphingomonas, si ritiene che il gene per la degradazione del carbaryl sia presente in cinque plasmidi: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 e pCF05. L'omologia del DNA di questi plasmidi è elevata, il che indica l'esistenza di un evento di duplicazione genica (Feng et al., 1997). In un simbionte in grado di degradare il carbaryl, composto da due specie di Pseudomonas, il ceppo 50581 contiene un plasmide coniugativo pCD1 (50 kb) che codifica per il gene della carbaryl idrolasi mcd, mentre il plasmide coniugativo nel ceppo 50552 codifica per un enzima in grado di degradare il 1-naftolo (Chapalamadugu e Chaudhry, 1991). Nel ceppo WM111 di Achromobacter, il gene della furadan idrolasi mcd è localizzato su un plasmide di 100 kb (pPDL11). È stato dimostrato che questo gene è presente su diversi plasmidi (100, 105, 115 o 124 kb) in diversi batteri provenienti da diverse regioni geografiche (Parekh et al., 1995). In Pseudomonas sp. C5pp, tutti i geni responsabili della degradazione del carbaryl sono localizzati in un genoma che si estende per 76,3 kb di sequenza (Trivedi et al., 2016). L'analisi del genoma (6,15 Mb) ha rivelato la presenza di 42 MGE e 36 GEI, di cui 17 MGE erano localizzati nel supercontig A (76,3 kb) con un contenuto medio asimmetrico di G+C (54-60 mol%), suggerendo possibili eventi di trasferimento genico orizzontale (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 presenta una disposizione simile di geni per la degradazione del carbaryl, ma questi geni sono localizzati su un plasmide (Zhu et al., 2019).
Oltre all'efficienza metabolica a livello biochimico e genomico, i microrganismi mostrano anche altre proprietà o risposte come la chemiotassi, le proprietà di modificazione della superficie cellulare, la compartimentalizzazione, l'utilizzo preferenziale, la produzione di biosurfattanti, ecc., che li aiutano a metabolizzare in modo più efficiente gli inquinanti aromatici negli ambienti contaminati (Figura 7).
Figura 7. Diverse strategie di risposta cellulare di batteri ideali per la degradazione di idrocarburi aromatici, al fine di ottenere una biodegradazione efficiente di composti inquinanti estranei.
Le risposte chemiotattiche sono considerate fattori che migliorano la degradazione degli inquinanti organici negli ecosistemi eterogeneamente inquinati. (2002) hanno dimostrato che la chemiotassi di Pseudomonas sp. G7 verso il naftalene aumentava il tasso di degradazione del naftalene nei sistemi acquatici. Il ceppo selvatico G7 degradava il naftalene molto più velocemente di un ceppo mutante carente di chemiotassi. È stato scoperto che la proteina NahY (538 amminoacidi con topologia di membrana) viene cotrascritta con i geni della via di metaclivaggio sul plasmide NAH7 e, come i trasduttori di chemiotassi, questa proteina sembra funzionare come un chemiorecettore per la degradazione del naftalene (Grimm e Harwood 1997). Un altro studio di Hansel et al. (2009) ha mostrato che la proteina è chemiotattica, ma il suo tasso di degradazione è elevato. (2011) hanno dimostrato una risposta chemiotattica di Pseudomonas (P. putida) al naftalene gassoso, in cui la diffusione in fase gassosa ha determinato un flusso costante di naftalene verso le cellule, che ha controllato la risposta chemiotattica delle cellule. I ricercatori hanno sfruttato questo comportamento chemiotattico per ingegnerizzare microbi che avrebbero migliorato la velocità di degradazione. Gli studi hanno dimostrato che le vie chemiosensoriali regolano anche altre funzioni cellulari come la divisione cellulare, la regolazione del ciclo cellulare e la formazione di biofilm, contribuendo così a controllare la velocità di degradazione. Tuttavia, sfruttare questa proprietà (chemiotassi) per una degradazione efficiente è ostacolato da diversi colli di bottiglia. Gli ostacoli principali sono: (a) diversi recettori paraloghi riconoscono gli stessi composti/ligandi; (b) esistenza di recettori alternativi, ovvero tropismo energetico; (c) differenze di sequenza significative nei domini sensoriali della stessa famiglia di recettori; e (d) mancanza di informazioni sulle principali proteine ​​sensore batteriche (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Talvolta, la biodegradazione degli idrocarburi aromatici produce molteplici metaboliti/intermedi, che possono essere chemiotattici per un gruppo di batteri ma repulsivi per altri, complicando ulteriormente il processo. Per identificare le interazioni dei ligandi (idrocarburi aromatici) con i recettori chimici, abbiamo costruito proteine ​​sensore ibride (PcaY, McfR e NahY) fondendo i domini sensore e di segnalazione di Pseudomonas putida ed Escherichia coli, che si legano rispettivamente ai recettori per gli acidi aromatici, gli intermedi del TCA e il naftalene (Luu et al., 2019).
Sotto l'influenza del naftalene e di altri idrocarburi policiclici aromatici (IPA), la struttura della membrana batterica e l'integrità dei microrganismi subiscono cambiamenti significativi. Studi hanno dimostrato che il naftalene interferisce con l'interazione della catena acilica attraverso interazioni idrofobiche, aumentando così il rigonfiamento e la fluidità della membrana (Sikkema et al., 1995). Per contrastare questo effetto dannoso, i batteri regolano la fluidità della membrana modificando il rapporto e la composizione degli acidi grassi tra acidi grassi a catena ramificata iso/anteiso e isomerizzando gli acidi grassi insaturi cis nei corrispondenti isomeri trans (Heipieper e de Bont, 1994). In Pseudomonas stutzeri coltivato su trattamento con naftalene, il rapporto tra acidi grassi saturi e insaturi è aumentato da 1,1 a 2,1, mentre in Pseudomonas JS150 questo rapporto è aumentato da 7,5 a 12,0 (Mrozik et al., 2004). Quando coltivate su naftalene, le cellule di Achromobacter KAs 3–5 hanno mostrato aggregazione cellulare attorno ai cristalli di naftalene e una diminuzione della carica superficiale cellulare (da -22,5 a -2,5 mV) accompagnata da condensazione citoplasmatica e vacuolizzazione, indicando cambiamenti nella struttura cellulare e nelle proprietà della superficie cellulare (Mohapatra et al., 2019). Sebbene i cambiamenti cellulari/superficiali siano direttamente associati a un migliore assorbimento di inquinanti aromatici, le relative strategie di bioingegneria non sono state ottimizzate a fondo. La manipolazione della forma cellulare è stata raramente utilizzata per ottimizzare i processi biologici (Volke e Nikel, 2018). L'eliminazione dei geni che influenzano la divisione cellulare provoca cambiamenti nella morfologia cellulare. L'eliminazione dei geni che influenzano la divisione cellulare provoca cambiamenti nella morfologia cellulare. Nel Bacillus subtilis, la proteina del setto cellulare SepF ha dimostrato di essere coinvolta nella formazione del setto ed è necessaria per le fasi successive della divisione cellulare, ma non è un gene essenziale. L'eliminazione dei geni che codificano per le peptidi glicano idrolasi nel Bacillus subtilis ha portato all'allungamento cellulare, all'aumento del tasso di crescita specifico e al miglioramento della capacità di produzione enzimatica (Cui et al., 2018).
La compartimentalizzazione del percorso di degradazione del carbaryl è stata proposta per ottenere una degradazione efficiente dei ceppi di Pseudomonas C5pp e C7 (Kamini et al., 2018). Si ipotizza che il carbaryl venga trasportato nello spazio periplasmatico attraverso il setto della membrana esterna e/o attraverso porine diffusibili. La CH è un enzima periplasmatico che catalizza l'idrolisi del carbaryl in 1-naftolo, che è più stabile, più idrofobico e più tossico. La CH è localizzata nel periplasma e ha una bassa affinità per il carbaryl, controllando così la formazione di 1-naftolo, prevenendone l'accumulo nelle cellule e riducendone la tossicità (Kamini et al., 2018). Il 1-naftolo risultante viene trasportato nel citoplasma attraverso la membrana interna mediante ripartizione e/o diffusione, e viene quindi idrossilato a 1,2-diidrossinaftalene dall'enzima ad alta affinità 1NH per un ulteriore metabolismo nella via centrale del carbonio.
Sebbene i microrganismi possiedano le capacità genetiche e metaboliche per degradare le fonti di carbonio xenobiotiche, la struttura gerarchica del loro utilizzo (ovvero, l'uso preferenziale di fonti di carbonio semplici rispetto a quelle complesse) rappresenta un ostacolo importante alla biodegradazione. La presenza e l'utilizzo di fonti di carbonio semplici riducono l'espressione dei geni che codificano gli enzimi che degradano fonti di carbonio complesse/non preferite, come gli IPA. Un esempio ben studiato è quello dell'Escherichia coli, in cui glucosio e lattosio vengono somministrati contemporaneamente: il glucosio viene utilizzato in modo più efficiente del lattosio (Jacob e Monod, 1965). È stato riportato che Pseudomonas degrada una varietà di IPA e composti xenobiotici come fonti di carbonio. La gerarchia di utilizzo delle fonti di carbonio in Pseudomonas è acidi organici > glucosio > composti aromatici (Hylemon e Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Tuttavia, esiste un'eccezione. È interessante notare che Pseudomonas sp. Il ceppo CSV86 presenta una struttura gerarchica unica che utilizza preferenzialmente idrocarburi aromatici (acido benzoico, naftalene, ecc.) piuttosto che glucosio e co-metabolizza gli idrocarburi aromatici con acidi organici (Basu et al., 2006). In questo batterio, i geni per la degradazione e il trasporto degli idrocarburi aromatici non vengono downregolati nemmeno in presenza di una seconda fonte di carbonio come glucosio o acidi organici. Quando coltivato in un terreno contenente glucosio e idrocarburi aromatici, è stato osservato che i geni per il trasporto e il metabolismo del glucosio venivano downregolati, gli idrocarburi aromatici venivano utilizzati nella prima fase logaritmica e il glucosio veniva utilizzato nella seconda fase logaritmica (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). D'altra parte, la presenza di acidi organici non ha influenzato l'espressione del metabolismo degli idrocarburi aromatici, quindi questo batterio è considerato un ceppo candidato per studi di biodegradazione (Phale et al., 2020).
È noto che la biotrasformazione degli idrocarburi può causare stress ossidativo e sovraregolazione degli enzimi antiossidanti nei microrganismi. L'inefficace biodegradazione del naftalene, sia nelle cellule in fase stazionaria che in presenza di composti tossici, porta alla formazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) (Kang et al. 2006). Poiché gli enzimi che degradano il naftalene contengono cluster ferro-zolfo, in condizioni di stress ossidativo il ferro presente nell'eme e nelle proteine ​​ferro-zolfo si ossida, causando l'inattivazione delle proteine. La ferredossina-NADP+ reduttasi (Fpr), insieme alla superossido dismutasi (SOD), media la reazione redox reversibile tra NADP+/NADPH e due molecole di ferredossina o flavodossina, eliminando così le ROS e ripristinando il centro ferro-zolfo in condizioni di stress ossidativo (Li et al. 2006). È stato riportato che sia Fpr che SodA (SOD) in Pseudomonas possono essere indotti dallo stress ossidativo e che un aumento delle attività di SOD e catalasi è stato osservato in quattro ceppi di Pseudomonas (O1, W1, As1 e G1) durante la crescita in condizioni di aggiunta di naftalene (Kang et al., 2006). Studi hanno dimostrato che l'aggiunta di antiossidanti come l'acido ascorbico o il ferro ferroso (Fe2+) può aumentare il tasso di crescita del naftalene. Quando Rhodococcus erythropolis è cresciuto in un terreno contenente naftalene, la trascrizione dei geni del citocromo P450 correlati allo stress ossidativo, tra cui sodA (superossido dismutasi Fe/Mn), sodC (superossido dismutasi Cu/Zn) e recA, è risultata aumentata (Sazykin et al., 2019). L'analisi proteomica quantitativa comparativa delle cellule di Pseudomonas coltivate in naftalene ha mostrato che la sovraregolazione di varie proteine ​​associate alla risposta allo stress ossidativo è una strategia di adattamento allo stress (Herbst et al., 2013).
È stato dimostrato che i microrganismi producono biosurfattanti sotto l'azione di fonti di carbonio idrofobiche. Questi tensioattivi sono composti anfifilici tensioattivi in ​​grado di formare aggregati all'interfaccia olio-acqua o aria-acqua. Ciò favorisce la pseudo-solubilizzazione e facilita l'adsorbimento degli idrocarburi aromatici, con conseguente efficiente biodegradazione (Rahman et al., 2002). Grazie a queste proprietà, i biosurfattanti sono ampiamente utilizzati in diversi settori industriali. L'aggiunta di tensioattivi chimici o biosurfattanti alle colture batteriche può migliorare l'efficienza e la velocità di degradazione degli idrocarburi. Tra i biosurfattanti, i ramnolipidi prodotti da Pseudomonas aeruginosa sono stati ampiamente studiati e caratterizzati (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Inoltre, altri tipi di biosurfattanti includono lipopeptidi (mucina da Pseudomonas fluorescens), emulsionante 378 (da Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg e Ron, 1999), lipidi disaccaridici di trealosio da Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenina da Bacillus (Saraswathy e Hallberg, 2002) e tensioattivi da Bacillus subtilis (Siegmund e Wagner, 1991) e Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). È stato dimostrato che questi potenti tensioattivi riducono la tensione superficiale da 72 dyne/cm a meno di 30 dyne/cm, consentendo un migliore assorbimento di idrocarburi. È stato riportato che Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia e altre specie batteriche possono produrre vari biosurfattanti a base di ramnolipidi e glicolipidi quando coltivati ​​in terreni di coltura a base di naftalene e metilnaftalene (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 può produrre il biosurfattante extracellulare Biosur-Pm quando coltivato su composti aromatici come l'acido naftoico (Phale et al., 1995). La cinetica della formazione di Biosur-Pm ha mostrato che la sua sintesi è un processo dipendente dalla crescita e dal pH. È stato riscontrato che la quantità di Biosur-Pm prodotta dalle cellule a pH neutro era maggiore di quella a pH 8,5. Le cellule coltivate a pH 8,5 erano più idrofobiche e avevano una maggiore affinità per i composti aromatici e alifatici rispetto alle cellule coltivate a pH 7,0. In Rhodococcus spp. L'azoto (N6), un rapporto carbonio/azoto (C:N) più elevato e la limitazione del ferro rappresentano condizioni ottimali per la produzione di biosurfattanti extracellulari (Mutalik et al., 2008). Sono stati compiuti tentativi per migliorare la biosintesi dei biosurfattanti (surfactine) ottimizzando i ceppi e la fermentazione. Tuttavia, il titolo di tensioattivo nel mezzo di coltura è basso (1,0 g/L), il che rappresenta una sfida per la produzione su larga scala (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Pertanto, sono stati utilizzati metodi di ingegneria genetica per migliorarne la biosintesi. Tuttavia, la sua modificazione ingegneristica è difficile a causa delle grandi dimensioni dell'operone (∼25 kb) e della complessa regolazione biosintetica del sistema di quorum sensing (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Sono state effettuate diverse modifiche genetiche nei batteri del genere Bacillus, principalmente con l'obiettivo di aumentare la produzione di surfactina mediante la sostituzione del promotore (operone srfA), la sovraespressione della proteina di esportazione della surfactina YerP e dei fattori regolatori ComX e PhrC (Jiao et al., 2017). Tuttavia, questi metodi di ingegneria genetica hanno permesso di ottenere solo una o poche modifiche genetiche e non hanno ancora raggiunto la produzione commerciale. Pertanto, è necessario un ulteriore studio dei metodi di ottimizzazione basati sulla conoscenza.
Gli studi sulla biodegradazione degli IPA vengono condotti principalmente in condizioni di laboratorio standard. Tuttavia, nei siti o negli ambienti contaminati, è stato dimostrato che molti fattori abiotici e biotici (temperatura, pH, ossigeno, disponibilità di nutrienti, biodisponibilità del substrato, altri xenobiotici, inibizione da prodotto finale, ecc.) possono alterare e influenzare la capacità degradativa dei microrganismi.
La temperatura ha un effetto significativo sulla biodegradazione degli IPA. Con l'aumento della temperatura, la concentrazione di ossigeno disciolto diminuisce, influenzando il metabolismo dei microrganismi aerobici, poiché questi necessitano di ossigeno molecolare come uno dei substrati per le ossigenasi che catalizzano le reazioni di idrossilazione o di scissione dell'anello. Si osserva spesso che l'aumento della temperatura converte gli IPA di partenza in composti più tossici, inibendo così la biodegradazione (Muller et al., 1998).
È stato osservato che molti siti contaminati da IPA presentano valori di pH estremi, come ad esempio i siti contaminati da drenaggio acido di miniera (pH 1-4) e i siti di gassificazione di gas naturale/carbone contaminati da percolato alcalino (pH 8-12). Queste condizioni possono influenzare seriamente il processo di biodegradazione. Pertanto, prima di utilizzare microrganismi per la biorisanamento, si raccomanda di regolare il pH aggiungendo sostanze chimiche idonee (con potenziale di ossidoriduzione da moderato a molto basso) come solfato di ammonio o nitrato di ammonio per i terreni alcalini, oppure calcinando con carbonato di calcio o carbonato di magnesio per i siti acidi (Bowlen et al. 1995; Gupta e Sar 2020).
L'apporto di ossigeno all'area interessata è il fattore limitante per la biodegradazione degli IPA. A causa delle condizioni redox dell'ambiente, i processi di biorisanamento in situ richiedono solitamente l'introduzione di ossigeno da fonti esterne (lavorazione del terreno, insufflazione d'aria e aggiunta di sostanze chimiche) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) hanno dimostrato che l'aggiunta di perossido di magnesio (un composto che rilascia ossigeno) a una falda acquifera contaminata potrebbe biorisanare efficacemente i composti BTEX. Un altro studio ha indagato la degradazione in situ del fenolo e dei BTEX in una falda acquifera contaminata mediante l'iniezione di nitrato di sodio e la costruzione di pozzi di estrazione per ottenere un biorisanamento efficace (Bewley e Webb, 2001).