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Il complesso di raccolta della luce del centro di reazione 1 (RC-LH1) è il componente fotosintetico principale dei batteri fototrofi viola. Abbiamo introdotto due strutture di criomicroscopia elettronica del complesso RC-LH1 di Rhodopseudomonas palustris. La struttura a risoluzione di 2,65 Å del complesso RC-LH114-W è costituita da 14 subunità di LH1 che circondano RC, interrotte dalla proteina W, mentre il complesso senza proteina W è completamente composto da RC circondato da RC. Ansa chiusa di LH1 a 16 subunità. Il confronto di queste strutture fornisce informazioni sulla dinamica del chinone nel complesso RC-LH1, inclusi i cambiamenti conformazionali precedentemente indeterminati durante il legame del chinone al sito QB di RC, nonché la posizione dei siti di legame ausiliari del chinone, che contribuiscono al loro passaggio a RC. La struttura unica della proteina W impedisce la chiusura dell'ansa di LH1, creando così un canale per accelerare lo scambio chinone/chinolone.
L'energia fornita dalla fotosintesi può sostenere quasi tutta la vita sulla Terra e ha un grande potenziale per la biotecnologia solare. Pur promuovendo la fotosintesi globale, i batteri fototrofi viola mostrano anche diverse modalità energetiche e capacità metaboliche. Possono evitare la fotosintesi e crescere come batteri eterotrofi al buio, possono fissare azoto e anidride carbonica, produrre idrogeno e degradare composti aromatici (1-3). Per fornire energia a questi processi, la luce deve essere convertita rapidamente ed efficientemente in energia chimica. Questo processo inizia quando il complesso antenna che intrappola la luce assorbe la luce e trasferisce l'energia intrappolata al centro di reazione (RC), avviando così la separazione di carica (4-7). L'unità di base della fotosintesi nei batteri fototrofi viola è composta da RC di tipo 2, circondata dal complesso di raccolta della luce 1 (LH1), che forma il complesso centrale RC-LH1. LH1 è formato da una serie di eterodimeri αβ curvi, ciascuno dei quali lega due molecole di clorofilla batterica (BChl) a e uno o due carotenoidi (8-12). L'antenna LH1 più semplice è costituita da 16 o 17 eterodimeri αβ che circondano RC (9-13) in un anello chiuso, ma in altri complessi del core, i peptidi transmembrana interrompono la continuità dell'LH1 circostante, promuovendo così la diffusione chinolo/chinone tra RC e il complesso citocromo bc1 (11, 13-15). La pianta fototrofica viola Rhodopseudomonas (Rps.) è un organismo modello in grado di comprendere il trasferimento di energia ed elettroni che supporta la fotosintesi. La prima struttura cristallina di Rps. Il modello del complesso RC-LH1 palustris è RC, circondato da 15 anelli LH1 eterodimerici, che sono interrotti da una proteina sconosciuta chiamata "Proteina W" (14). La proteina W è stata successivamente identificata come RPA4402, che è una proteina non caratterizzata da 10,5 kDa con tre eliche transmembrana previste (TMH) (16). Proponiamo di rinominare il gene rpa4402 che codifica la proteina W in pufW per coerenza con la nomenclatura utilizzata per i geni che codificano le subunità RC-L, M (pufL, pufM) e LH1α, β (pufA, pufB). È interessante notare che la proteina W è presente solo in circa il 10% di RC-LH1, rivelando che Rps. palustris produce due diversi complessi RC-LH1. Qui, riportiamo le strutture crio-EM ad alta risoluzione (cryo-EM) di due complessi core, uno con proteina W e 14 eterodimeri αβ, l'altro senza proteina W e un loop chiuso LH1 a 16 eterodimeri. La nostra struttura rappresenta un passo avanti nella comprensione del complesso RC-LH1 di Rps. palustris, perché abbiamo analizzato la popolazione omogenea di ciascuna variante e abbiamo una risoluzione sufficiente per assegnare chiaramente ciascun peptide e i pigmenti legati, nonché i lipidi e i chinoni correlati. Il confronto di queste strutture mostra che le tre proteine ​​TMH-W, finora non trovate in nessun altro complesso RC-LH1, generano un canale chinonico per accelerare lo scambio chinone/chinolone. Sono stati identificati diversi siti di legame conservati per lipidi e chinoni e abbiamo rivelato un nuovo cambiamento conformazionale dopo la combinazione di chinone e RC, che potrebbe essere adatto per il RC del fotosistema II (PSII) degli organismi fototrofi ossigenati. I nostri risultati forniscono nuove informazioni sulla cinetica del legame e dello scambio chinone/chinolone nel complesso centrale RC-LH1 dei batteri fototrofi viola.
Per facilitare uno studio dettagliato dei due complessi presenti in Rps. palustris, isoliamo ciascun RC-LH1 mediante metodi biochimici. Il complesso proteico W-deficiente (di seguito denominato ΔpufW) è stato purificato dal ceppo privo del gene pufW (16) e può essere prodotto un solo complesso RC-LH1. Il complesso contenente la proteina W è prodotto da un ceppo. La proteina W di questo ceppo è modificata con un tag His 10x al suo C-terminale, in modo che il complesso contenente la proteina W possa essere efficacemente combinato con la maggior parte delle proteine ​​W carenti mediante immobilizzazione di metallo. Il complesso viene efficacemente separato (16) mediante cromatografia di affinità (IMAC).
Come mostrato in Figura 1, entrambi i complessi contengono un RC a tre subunità (RC-L, RC-M e RC-H) circondato da un'antenna LH1. La struttura da 2,80 Å del complesso privo di proteina-W mostra 16 eterodimeri αβ, che formano un anello chiuso LH1 che circonda completamente RC, di seguito denominato complesso RC-LH116. La struttura da 2,65 Å del complesso contenente proteina-W presenta un eterodimero LH1 a 14 interrotti dalla proteina-W, di seguito denominato RC-LH114-W.
(A e B) Rappresentazione superficiale del composto. (C e D) Pigmenti legati espressi in bastoncelli. (E e F) I complessi osservati dalla superficie citoplasmatica hanno i peptidi e le subunità LH1 rappresentati in vignette e sono numerati in senso orario a partire dal gap proteina-W [coerente con la numerazione Rba. complesso sphaeroides (13)]. Per LH1-α, il colore della subunità proteica è giallo; per LH1-β, il colore della subunità proteica è blu; per proteina-W, la proteina è rossa; per RC-H, è ciano; per RC-L, è arancione; per RC-M, magenta. I cofattori sono rappresentati da bastoncelli, il verde rappresenta le molecole di BChl e BPh a, il viola rappresenta i carotenoidi e il giallo rappresenta le molecole di UQ10. (G e H) Vista ingrandita del gap proteina-W nella regione equivalente del complesso RC-LH114-W (G) e del complesso RC-LH116 (H). I cofattori sono visualizzati sotto forma di riempimento dello spazio, il chinone chelato è visualizzato in blu. Il gap proteina-W è evidenziato da una linea tratteggiata blu in (G), e i piccoli fori in cui il chinone/chinololo diffonde sull'anello LH116 sono evidenziati da una linea tratteggiata nera in (H).
La Figura 1 (A e B) mostra il complesso RC circondato da array aperti o chiusi di eterodimeri LH1αβ, ciascuno dei quali lega due BChl e un carotenoide (Figura 1, C e D). Studi precedenti hanno dimostrato che Rps è il complesso LH1. Nel percorso biosintetico della xantina della spirulina, queste specie contengono popolazioni miste di carotenoidi (17). Tuttavia, la spiropirroxantina è il carotenoide dominante e la sua densità è soddisfacente. Pertanto, abbiamo scelto di modellare la spiroxantina in tutti i siti di legame LH1. I polipeptidi alfa e beta sono singoli TMH con brevi regioni esterne di membrana (Figura 1, A, B, E e F). Sebbene la densità di 17 residui al C-terminale non sia stata osservata, il polipeptide alfa è stato scisso da Met1 ad Ala46 in entrambi i complessi. Il polipeptide β è stato ridotto da Gly4 a Tyr52 in RC-LH116 e da Ser5 a Tyr52 in RC-LH114-W. Non è stata osservata alcuna densità di 3 o 4 residui N-terminali o 13 residui C-terminali (Figura S1). L'analisi spettrometrica di massa del complesso misto RC-LH1 preparato dal ceppo selvatico ha mostrato che la regione mancante era il risultato della scissione eterologa di questi peptidi (Figure S1 e S2). È stata osservata anche la formilazione N-terminale di α-Met1 (f). L'analisi ha mostrato che l'α-peptide è costituito dai residui da fMet1 ad Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, e il β-peptide è costituito dai residui da Ser2 ad Ala53, il che è in buon accordo con la mappa di densità EM a bassa temperatura.
Il coordinamento di α-His29 e β-His36 rende i BChl faccia a faccia; ciascun eterodimero αβ si assembla con i suoi vicini per formare un anello aperto (RC-LH114-W) o un anello chiuso (RC-LH116) attorno al RC. La matrice di pigmenti accoppiati agli eccitoni (Figura 1, C e D). Rispetto alla banda a 877 nm di RC-LH114-W, lo spostamento verso il rosso di assorbimento a 880 nm di RC-LH116 è di 3 nm (Figura 2A). Tuttavia, lo spettro di dicroismo circolare è quasi lo stesso (Figura 2B), indicando che, sebbene vi sia una netta differenza tra anelli aperti e chiusi, l'ambiente locale dei BChl è molto simile. Lo spostamento verso il rosso dell'assorbimento può essere il risultato di un movimento termico ridotto e di una maggiore stabilità nel circuito chiuso (18, 19), del cambiamento nell'accoppiamento dei pigmenti causato dal circuito chiuso (20, 21) o di una combinazione di questi due effetti (11).
(A) Spettro di assorbimento ultravioletto/visibile/vicino infrarosso, i cui picchi sono contrassegnati con i corrispondenti pigmenti e normalizzati al picco BPh a 775 nm. (B) Spettro di dicroismo circolare normalizzato all'assorbanza di BChl a 805 nm. (C e D) Spettri ΔA selezionati dagli spettri di assorbimento risolti nel tempo del complesso RC-LH114-W (C) e del complesso RC-LH116 (D). Per una migliore comparabilità, tutti gli spettri sono normalizzati a ∆A di −A a 0,2 ps. (E) La velocità di ossidazione del citocromo c2 dopo irradiazione in presenza di varie concentrazioni di UQ2 (vedere la Figura S8 per i dati grezzi). (F) Nelle cellule coltivate sotto luce a bassa, media o alta intensità (rispettivamente 10, 30 o 300 μMm-2 s-1), le subunità proteiche W e RC-L nel complesso purificato e il rapporto di membrana separato. Determinare il livello proteico mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS e immunodosaggio (vedere Figura S9 per i dati grezzi). Determinare il rapporto relativo al complesso RC-LH114-W purificato. Il rapporto stechiometrico tra RC-L e proteina W del complesso è 1:1.
I BChl in posizione 1 nel loop αβ14 deformato di RC-LH114-W (Figura 1, A, C ed E) sono più vicini al donatore primario RC (P) di 6,8 Å rispetto ai BChl equivalenti in RC-LH116 (Figura 1, B, D ed F e Figura S3); tuttavia, la cinetica di assorbimento transitorio dei due complessi mostra che per RC-LH114-W e RC-LH116, le costanti di tempo di trasferimento dell'energia di eccitazione da LH1 a RC sono 40 ±4 e 44 ±3 ps (Figura 2, C e D, Figura S4 e Tabella S2). Non vi è inoltre alcuna differenza significativa nel trasferimento elettronico all'interno di RC (Figura S5 e testo supplementare correlato). Sospettiamo che la stretta corrispondenza del tempo di trasferimento energetico tra LH1 e RC-P sia dovuta alla distanza, all'angolo e all'energia potenziale simili della maggior parte delle BChl nei due loop di LH1. Sembra che esplorare il modello energetico di LH1 per raggiungere la distanza minima non sia più veloce del trasferimento diretto di energia dai siti subottimali a RC. Il loop di LH1 a loop aperto in RC-LH114-W può anche subire un movimento termico insignificante in condizioni di bassa temperatura per l'analisi strutturale, e si osserva una conformazione ad anello αβ14 più lunga a temperatura ambiente dovuta alla distanza di pigmentazione delle βBChl nella posizione di RC 1.
Il complesso RC-LH116 contiene 32 BChl e 16 carotenoidi e la sua disposizione complessiva è la stessa di quella ottenuta da Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), ceppo Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) e alghe verdi (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Dopo l'allineamento, sono state osservate solo piccole deviazioni nelle posizioni degli eterodimeri αβ, in particolare 1-5, 15 e 16 (Figura S6). La presenza della proteina-W ha un impatto significativo sulla struttura di LH1. I suoi tre TMH sono collegati da brevi anse, con l'estremità N-terminale sul lato lume del complesso e l'estremità C-terminale sul lato citoplasmatico (Figure 1A e 3, da A a D). La proteina W è in gran parte idrofobica (Figura 3B) e TMH2 e TMH3 interagiscono con LH1αβ-14 per formare una superficie transmembrana (Figura 3, B e da E a G). L'interfaccia è composta principalmente da residui di Phe, Leu e Val nella regione transmembrana. Questi residui sono impilati con amminoacidi idrofobici e pigmenti αβ-14. Anche alcuni residui polari contribuiscono all'interazione, incluso il legame idrogeno tra W-Thr68 e β-Trp42 sulla superficie della cavità complessa (Figura 3, F e G). Sulla superficie del citoplasma, Gln34 è adiacente al gruppo chetonico dei carotenoidi αβ-14. Inoltre, la molecola di n-dodecil β-d-maltoside (β-DDM) è stata risolta e la sua coda idrofobica si estendeva fino all'interfaccia tra la proteina-W e αβ-14, mentre la coda lipidica potrebbe essere localizzata nel corpo. Abbiamo anche notato che le regioni di risoluzione C-terminali della proteina W e RCH sono molto vicine, ma non nell'ambito della formazione di interazioni specifiche (Figura 1, A ed E). Tuttavia, potrebbero esserci interazioni negli amminoacidi C-terminali non risolti di queste due proteine, che potrebbero fornire un meccanismo per il reclutamento della proteina-W durante l'assemblaggio del complesso RC-LH114-W.
(A) La proteina W, che si trova all'interfaccia con LH1αβ14 in forma di fumetto, ha una catena laterale a forma di bastoncello (rossa), visualizzata in una parte del diagramma del potenziale elettrostatico (superficie grigia trasparente con un livello di contorno di 0,13). (B) La proteina W è rappresentata da una superficie colorata idrofobica. Le aree polari e cariche sono visualizzate in ciano, le aree idrofobiche sono visualizzate in bianco e le aree fortemente idrofobiche sono visualizzate in arancione. (C e D) La proteina W è rappresentata in forma di fumetto, il suo orientamento è lo stesso di (A) (C) e ruotato di 180° (D). A seconda della posizione nella sequenza, i residui distinguibili adottano uno schema di colori arcobaleno, dove l'N-terminale è blu e il C-terminale è rosso. (E) La proteina W è rappresentata nella stessa vista di (A) e i residui all'interfaccia proteina W:LH1 sono rappresentati da bastoncelli con segni attaccati. (F) La proteina W è ruotata di 90° rispetto a (E) e LH1αβ14 nella rappresentazione a fumetti, e rispetto ai residui di interfaccia nella rappresentazione a barre. I residui sporgenti del polipeptide beta sono etichettati. Il cofattore è mostrato come una barra corrispondente al colore della Figura 1, il β-DDM decomposto è mostrato in grigio e l'ossigeno è mostrato in rosso. (G) La vista in (F) è ruotata di 180°, con i residui prominenti del polipeptide alfa etichettato.
La proteina W sostituisce un eterodimero αβ (il 15° nella Figura 1F), impedendo così la chiusura del loop e inclinando i primi tre eterodimeri αβ. È stato osservato che l'angolo di inclinazione massimo del primo eterodimero αβ-1 rispetto alla normale del film era compreso tra 25° e 29° (Figura 1, A ed E), formato dall'inclinazione di 2° e 8° di αβ-1 in RC A sharp contrast-LH116 (Figura 1, B ed F). Il secondo e il terzo eterodimero sono inclinati rispettivamente di 12° e 22° e di 5° e 10°. A causa dell'ingombro sterico di RC, l'inclinazione di αβ-1 non include la seconda coppia di αβ (che corrisponde al 16° αβ nella Figura 1F), formando così un chiaro gap nell'anello LH1 (Figura 1, A ed E). A causa della mancanza di due eterodimeri αβ, accompagnata dalla perdita di quattro BChl e due carotenoidi, nessuno dei carotenoidi si lega alla subunità αβ-1 attorcigliata, risultando in un anello LH114-W contenente 13 carotenoidi vegetariani e 28 BChl. Le stime di risoluzione locale dei due complessi nelle regioni da αβ1 a 7 sono inferiori a quelle del resto del loop LH1, il che potrebbe riflettere la plasticità intrinseca della subunità LH1 adiacente al sito QB di RC (Figura 4).
Le immagini di RC-LH114-W (A e B) e RC-LH116 (C e D) sono mostrate dalla stessa vista dall'alto/vista laterale (A e B) (A e C) e dalla superficie della cavità della Figura 1. (B e D). I tasti colorati sono mostrati sulla destra.
L'unico altro complesso centrale caratteristico con un rapporto stechiometrico di 1:14 è il dimero RC-LH1-PufX di Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Tuttavia, la proteina W e PufX non presentano un'ovvia omologia e hanno un impatto significativo sulle rispettive strutture di LH1. PufX è un singolo TMH con un dominio citoplasmatico N-terminale che interagisce con il lato citoplasmatico della subunità RC-H (13) in una posizione corrispondente a Rps. palustris LH116αβ-16. PufX crea un canale per lo scambio chinone/chinolone tra RC-LH1 e il complesso del citocromo bcl ed è presente in tutti i complessi centrali di Rba. sphaeroides (13). Sebbene l'interfaccia monomero-monomero sia presente in Rba. Il dimero sferoide RC-LH1-PufX si trova nella posizione di legame della proteina W in RC-LH114-W, e il gap indotto da PufX e proteina-W si trova in una posizione equivalente (Figura S7A). Il gap in RC-LH114-W è anche allineato con l'ipotetico canale chinone (8) di Pseudomonas rosea LH1, formato da peptidi non correlati alla proteina W o PufX (Figura S7B). Inoltre, il canale chinone in Blc. Il canale chinone verde smeraldo LH1 formato escludendo una subunità γ (7) si trova in una posizione simile (Figura S7C). Sebbene mediato da proteine ​​diverse, la comparsa di questi canali chinone/chinololo in una posizione comune nel complesso RC-LH1 sembra essere un esempio di evoluzione convergente, indicando che il gap creato dalla proteina W potrebbe agire come un canale chinone.
L'interruzione nell'ansa LH114-W consente la formazione di una regione di membrana continua tra lo spazio interno del complesso RC-LH114-W e la membrana principale (Figura 1G), anziché collegare i due domini attraverso un poro proteico come nelle proteine. Il complesso RC-LH116 è simile a un complesso aghiforme Tch chiuso (22) (Figura 1H). Poiché la diffusione del chinone attraverso la membrana è più rapida della diffusione attraverso lo stretto canale proteico, l'ansa aperta LH114-W può consentire un turnover RC più rapido rispetto all'ansa chiusa LH116 e la diffusione del chinone nell'RC può essere più limitata. Per verificare se la proteina W influenzi la conversione dei chinoni attraverso l'RC, abbiamo eseguito un test di ossidazione del citocromo su una certa concentrazione di ubichinone 2 (UQ2) (un analogo dell'UQ10 naturale con una coda di isoprene più corta) (Figura 2E). Sebbene la presenza di chinone chelato impedisca la determinazione accurata della costante di Michaelis apparente (RC-LH114-W e RC-LH116 sono adatti rispettivamente per 0,2±0,1μM e 0,5±0,2μM), la velocità massima di RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) è maggiore del 28±5% rispetto a RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Inizialmente abbiamo stimato che la proteina-W fosse presente in circa il 10% del complesso centrale (16); in questo caso, i tassi di occupazione delle cellule in crescita in condizioni di scarsa, media e alta illuminazione sono rispettivamente del 15±0,6%, 11±1% e 0,9±0,5% (Figura 2F). Il confronto quantitativo della spettrometria di massa ha mostrato che l'aggiunta del tag istidina non ha ridotto l'abbondanza relativa di proteina-W rispetto ai ceppi wild-type (P = 0,59), quindi questi livelli non sono un artefatto della proteina-W modificata (Figura S10). Tuttavia, questa bassa occupazione di proteina-W nel complesso RC-LH1 può consentire ad alcune cellule RC di invertirsi a una velocità accelerata, mitigando così il più lento scambio chinone/chinolone nel complesso RC-LH116. Abbiamo notato che l'elevato tasso di occupazione della luce è incoerente con i recenti dati di trascrittomica, che indicano che l'espressione genica pufW aumenta sotto luce intensa (Figura S11) (23). La differenza tra la trascrizione di pufW e l'incorporazione della proteina W nel complesso RC-LH1 è confusa e potrebbe riflettere la complessa regolazione della proteina.
In RC-LH114-W, 6 molecole di cardiolipina (CDL), 7 di fosfatidilcolina (POPC), 1 di fosfatidilglicerolo (POPG) e 29 molecole di β-DDM sono allocate e modellate in esso: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG e 12 βDDM. RC-LH116 (Figura 5, A e B). In queste due strutture, la CDL è quasi localizzata sul lato citoplasmatico del complesso, mentre POPC, POPG e β-DDM sono per lo più localizzati sul lato luminale. Due molecole lipidiche e detergenti sono state isolate nella regione da αβ-1 ad αβ-6 del complesso RC-LH114-W (Figura 5A) e cinque sono state isolate nella regione equivalente di RC-LH116 (Figura 5B). Sono stati trovati altri lipidi sull'altro lato del complesso, principalmente CDL, accumulati tra RC e αβ-7 fino a αβ-13 (Figura 5, A e B). Altri lipidi e detergenti strutturalmente risolti si trovano all'esterno dell'anello LH1, e catene aciliche ben risolte si estendono tra le subunità LH1, designate provvisoriamente come β-DDM in RC-LH114-W e definite come β-DDM in RC Una miscela di β-DDM e POPC-LH116. Le posizioni simili dei lipidi chelanti e dei detergenti nella nostra struttura indicano che sono siti di legame fisiologicamente rilevanti (Figura S12A). Anche le posizioni delle molecole equivalenti in Tch presentano una buona coerenza. Gentle e Trv. I ceppi 970 RC-LH1 (Figura S12, da B a E) (9, 12) e i residui di legame idrogeno del gruppo di testa lipidica hanno mostrato una conservazione abbastanza buona nell'allineamento della sequenza (Figura S13), indicando che il CDL conservato che si lega a RC (24), questi siti possono essere conservati nel complesso RC-LH1.
(A e B) I peptidi RC-LH114-W (A) e RC-LH116 (B) sono rappresentati da cartoni animati e i pigmenti sono rappresentati da bastoncelli, utilizzando lo schema di colori della Figura 1. I lipidi sono mostrati in rosso e i detergenti sono mostrati in grigio. L'UQ legato ai siti RC QA e QB è giallo, mentre l'UQ isolato è blu. (C e D) Le stesse viste di (A) e (B), con i lipidi omessi. (Da E a G) Vista ingrandita di Q1(E), Q2(F) e Q3(G) di RC-LH116, con catene laterali che si influenzano a vicenda. I legami idrogeno sono mostrati come linee tratteggiate nere.
In RC-LH116, sia RC QA che QB UQ, che partecipano al trasferimento elettronico nel processo di separazione di carica, sono decomposti nei loro siti di legame. Tuttavia, in RC-LH114-W, il chinone QB non è stato risolto e sarà discusso in dettaglio di seguito. Oltre ai chinoni QA e QB, due molecole di UQ chelate (situate tra gli anelli RC e LH1) sono allocate nella struttura di RC-LH114-W in base ai loro gruppi di testa ben risolti (situati rispettivamente in Q1 e Q2). spazio). Figura 5C). Due unità di isoprene sono assegnate a Q1 e la mappa di densità risolve le 10 code di isoprene complete di Q2. Nella struttura di RC-LH116, tre molecole di UQ10 chelate (da Q1 a Q3, Figura 5D) sono state risolte e tutte le molecole presentano una densità chiara lungo tutta la coda (Figura 5, da D a G). Nelle due strutture, le posizioni delle teste chinoniche di Q1 e Q2 presentano un'eccellente coerenza (Figura S12F) e interagiscono solo con RC. Q1 si trova all'ingresso del gap W di RC-LH114-W (Figura 1G e 5, C, D ed E), mentre Q2 si trova vicino al sito di legame QB (Figura 5, C, D) e F). I residui conservati di L-Trp143 e L-Trp269 sono molto vicini a Q1 e Q2 e forniscono potenziali interazioni di π-stacking (Figura 5, E ed F, e Figura S12). L-Gln88, a 3,0 Å dall'ossigeno distale di Q1, fornisce un forte legame a idrogeno (Figura 5E); questo residuo è conservato in tutti i RC, tranne che nella relazione più distante (Figura S13). L-Ser91 è conservato come Thr nella maggior parte degli altri RC (Figura S13), dista 3,8 Angstrom dall'ossigeno metilico di Q1 e può fornire deboli legami idrogeno (Figura 5E). Q3 non sembra avere un'interazione specifica, ma è localizzato nella regione idrofobica tra la subunità RC-M e la subunità LH1-α 5-6 (Figura 5, D e G). Q1, Q2 e Q3 o chinoni chelati nelle vicinanze sono stati risolti anche in Tch. Gentle, Trv. Strain 970 e Blc. La struttura dell'iride (9, 10, 12) indica un sito di legame chinone ausiliario conservato nel complesso RC-LH1 (Figura S12G). I cinque UQ decomposti in RC-LH116 sono in buon accordo con il 5,8±0,7 di ciascun complesso determinato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), mentre i tre UQ decomposti in RC-LH114-W sono inferiori al valore misurato di 6,2±0,3 (Fig. S14) indica che nella struttura sono presenti molecole di UQ non risolte.
I polipeptidi pseudo-simmetrici L e M contengono ciascuno cinque TMH e formano un eterodimero che combina un dimero BChl, due monomeri BChl, due monomeri di batteriofago (BPh), un ferro non-eme e una o due molecole di UQ10. Attraverso la presenza di legami idrogeno sul gruppo chetonico terminale e il suo noto accumulo in Rps, i carotenoidi vengono incorporati nella subunità M, denominata cis-3,4-deidroorodopina. Specie (25). Il dominio di membrana esterna di RC-H è ancorato alla membrana da un singolo TMH. La struttura complessiva di RC è simile a quella delle tre subunità RC di specie correlate (come Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). I macrocicli di BChl e BPh, la struttura principale dei carotenoidi e il ferro non eme si sovrappongono all'interno dell'intervallo di risoluzione di queste strutture, così come il gruppo di testa UQ10 nel sito QA e il chinone QB in RC-LH116 (Figura S15).
La disponibilità di due strutture RC con diversi tassi di occupazione del sito QB offre una nuova opportunità per esaminare i cambiamenti conformazionali costanti che accompagnano il legame del chinone QB. Nel complesso RC-LH116, il chinone QB si trova nella posizione "prossimale" completamente legato (26), ma la separazione di RC-LH114-W non presenta chinone QB. Non c'è chinone QB in RC-LH114-W, il che è sorprendente perché il complesso è attivo, più del complesso RC-LH116 con chinone QB strutturalmente risolto. Sebbene i due anelli LH1 chelino circa sei chinoni, cinque sono strutturalmente risolti nell'anello chiuso RC-LH116, mentre solo tre sono strutturalmente limitati nell'anello aperto RC-LH114-W. Questo aumento del disordine strutturale potrebbe riflettere la più rapida sostituzione dei siti QB di RC-LH114-W, una cinetica più rapida del chinone nel complesso e una maggiore probabilità di attraversare il loop LH1. Suggeriamo che la mancanza di UQ nel sito RC QB di RC-LH114-W possa essere il risultato di un complesso più complesso e più attivo, e che il sito QB di RC-LH114-W sia stato immediatamente congelato nel turnover di UQ. La fase specifica (l'ingresso al sito QB è stato chiuso) riflette la conformazione di questa attività.
Senza QB, la rotazione di L-Phe217 in una posizione incompatibile con il legame con UQ10, causa una collisione spaziale con la prima unità isoprenica della coda (Figura 6A). Inoltre, i principali cambiamenti conformazionali sono evidenti, in particolare l'elica de (elica corta nell'ansa tra TMH D ed E) dove L-Phe217 viene spostata nella tasca di legame QB e la rotazione di L-Tyr223 (Figura 6A) per rompere il legame idrogeno con la struttura M-Asp45 e chiudere l'ingresso del sito di legame QB (Figura 6B). L'elica de ruota alla sua base, la Cα di L-Ser209 viene spostata di 0,33 Å, mentre la Cα di L-Val221 viene spostata di 3,52 Å. Non ci sono cambiamenti osservabili in TMH D ed E, che sono sovrapponibili in entrambe le strutture (Figura 6A). Per quanto ne sappiamo, questa è la prima struttura nel recettore di idrogeno naturale che chiude il sito QB. Un confronto con la struttura completa (legata a QB) mostra che prima che il chinone venga ridotto, è necessario un cambiamento conformazionale per farlo entrare nel chinone. L-Phe217 ruota per formare un'interazione di impilamento π con il gruppo di testa del chinone e l'elica si sposta verso l'esterno, consentendo allo scheletro di L-Gly222 e alla catena laterale di L-Tyr223 di formare una rete di legami a idrogeno con una struttura stabile (Figura 6, A e C).
(A) Fumetto sovrapposto dell'ologramma (catena L, arancione/catena M, magenta) e della struttura apo (grigio), in cui i residui chiave sono visualizzati sotto forma di una rappresentazione a bastoncino. UQ10 è rappresentato da una barra gialla. La linea tratteggiata indica i legami idrogeno formati nell'intera struttura. (B e C) La rappresentazione superficiale dell'apolipoproteina e dell'intera struttura ad anello, evidenziando l'ossigeno della catena laterale di L-Phe217 in blu e di L-Tyr223 in rosso, rispettivamente. La subunità L è arancione; le subunità M e H non sono colorate. (D ed E) Apolipoproteina (D) e siti RC QB interi (E) [colorati rispettivamente con (A)] e Thermophilus thermophilus PSII (verde, blu con chinone plastico; ID PDB: 3WU2) Allineamento (58).
Inaspettatamente, sebbene siano disponibili diverse strutture di RC con deficit di QB e senza LH1, i cambiamenti conformazionali osservati in questo studio non erano stati precedentemente riportati. Questi includono la struttura di deplezione di QB di Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) e Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), tutti pressoché identici alla loro struttura complessiva di QB. Un'analisi più attenta di 3PRC ha rivelato che le molecole di detergente LDAO (ossido di lauril dimetilammina) si legano all'ingresso della posizione QB, il che potrebbe impedirne il riarrangiamento in una conformazione chiusa. Sebbene LDAO non si decomponga nella stessa posizione in 1EYS o 1OGV, questi RC sono preparati utilizzando lo stesso detergente e quindi potrebbero produrre lo stesso effetto. La struttura cristallina di Rba. Anche la proteina RC di Sphaeroides co-cristallizzata con il citocromo c2 (PDB ID: 1L9B) sembra avere un sito QB chiuso. Tuttavia, in questo caso, la regione N-terminale del polipeptide RC-M (che interagisce con il sito di legame QB attraverso il legame H del residuo di Tyr sull'elica Q) adotta una conformazione innaturale e il cambiamento conformazionale di QB non è stato ulteriormente esplorato (30). Ciò che è rassicurante è che non abbiamo osservato questo tipo di deformazione del polipeptide M nella struttura RC-LH114-W, che è quasi la stessa della regione N-terminale della proteina RC-LH116. Va inoltre notato che dopo l'eradicazione dell'antenna LH1 basata sul detergente, le apolipoproteine ​​RC nel PDB sono state risolte, eliminando i pool interni di chinoni e i lipidi nello spazio tra la RC e la superficie interna dell'anello LH1 circostante (31, 32). Il RC rimane funzionale perché conserva tutti i cofattori, ad eccezione del chinone QB decomponibile, che è meno stabile e spesso viene perso durante il processo di preparazione (33). Inoltre, è noto che la rimozione di LH1 e dei lipidi ciclici naturali dal RC può avere un impatto sulle funzioni, come la riduzione della durata di vita dello stato P+QB a carica separata (31, 34, 35). Pertanto, ipotizziamo che l'esistenza dell'anello LH1 locale che circonda il RC possa mantenere il sito QB "chiuso", preservando così l'ambiente locale vicino al QB.
Sebbene l'apolipoproteina (senza chinone QB) e la struttura completa rappresentino solo due istantanee del turnover del sito QB, piuttosto che una serie di eventi, ci sono indicazioni che il legame possa essere regolato per impedire il re-legame da parte dell'idrochinone per inibire l'inibizione del substrato. L'interazione tra chinololo e chinone vicino al sito QB dell'apolipoproteina può essere diversa, il che porta al suo rigetto da parte delle cellule di reazione a catena (RC). È stato a lungo proposto che i cambiamenti conformazionali svolgano un ruolo nel legame e nella riduzione dei chinoni. La capacità delle cellule di reazione a catena congelate di ridurre i chinoni dopo l'adattamento al buio è compromessa (36); la cristallografia a raggi X mostra che questo danno è dovuto al fatto che i chinoni QB sono intrappolati in una conformazione "distale" a circa 4,5 Å dalla posizione prossimale attiva (26, 37). Suggeriamo che questa conformazione di legame distale sia un'istantanea dello stato intermedio tra l'apolipoproteina e la struttura ad anello completo, che segue l'interazione iniziale con il chinone e l'apertura del sito QB.
Il RC di tipo II presente nel complesso PSII di alcuni batteri e cianobatteri fototrofi, alghe e piante presenta una conservazione strutturale e funzionale (38). L'allineamento strutturale mostrato in Figura 6 (D ed E) sottolinea la somiglianza tra i RC del PSII e il sito QB del complesso RC batterico. Questo confronto è da tempo un modello per lo studio dei sistemi strettamente correlati di legame e riduzione dei chinoni. Precedenti pubblicazioni hanno suggerito che i cambiamenti conformazionali siano accompagnati dalla riduzione dei chinoni al PSII (39, 40). Pertanto, considerando la conservazione evolutiva del RC, questo meccanismo di legame precedentemente non osservato potrebbe essere applicabile anche al sito QB del RC del PSII nelle piante fototrofi ossigenate.
I ceppi Rps ΔpufW (delezione pufW non marcata) e PufW-His (proteina W C-terminale marcata con His 10x espressa dal locus pufW naturale). palustris CGA009 è stato descritto nel nostro lavoro precedente (16). Questi ceppi e il genitore selvatico isogenico sono stati recuperati dal congelatore strisciando un piccolo numero di cellule su una piastra di agar PYE (ciascuno da 5 g litro -1) (conservato in LB a -80 °C, contenente il 50% (p/v) di glicerolo) proteine, estratto di lievito e succinato [1,5% (p/v)]. La piastra è stata incubata per una notte al buio a temperatura ambiente in condizioni anaerobiche, quindi illuminata con luce bianca (~50 μmolm-2 s-1) fornita da lampadine alogene OSRAM da 116 W (RS Components, Regno Unito) per 3-5 giorni fino alla comparsa di una singola colonia. Una singola colonia è stata utilizzata per inoculare 10 ml di terreno M22+ (41) integrato con lo 0,1% (p/v) di casaminoacidi (di seguito denominato M22). La coltura è stata coltivata in condizioni di basso contenuto di ossigeno al buio a 34 °C con agitazione a 180 rpm per 48 ore, quindi 70 ml della coltura sono stati inoculati nelle stesse condizioni per 24 ore. Una coltura semi-aerobica con un volume di 1 ml è stata utilizzata per inoculare 30 ml di terreno M22 in una bottiglia di vetro trasparente con tappo a vite universale da 30 ml e irradiata con agitazione (~50 μmolm-2 s-1) per 48 ore mediante una bacchetta di agitazione a forza magnetica sterile. Quindi 30 ml della coltura sono stati inoculati con circa 1 litro di coltura nelle stesse condizioni, che è stato quindi utilizzato per inoculare circa 9 litri di coltura illuminata a ~200 μmolm-2 s-1 per 72 ore. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 7132 RCF per 30 minuti, risospese in ~10 ml di tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e conservate a -20°C fino al momento dell'uso.
Dopo lo scongelamento, aggiungere alle cellule risospese alcuni cristalli di desossiribonucleasi I (Merck, Regno Unito), lisozima (Merck, Regno Unito) e due compresse di inibitore della proteasi oloenzimatica Roche (Merck, Regno Unito). In una cella a pressione francese da 20.000 psi (Aminco, USA), le cellule sono state disgregate da 8 a 12 volte. Dopo aver rimosso le cellule integre e i detriti insolubili mediante centrifugazione a 18.500 RCF per 15 minuti a 4 °C, la membrana è stata precipitata dal lisato pigmentato mediante centrifugazione a 113.000 RCF per 2 ore a 43.000 °C. Scartare la frazione solubile e risospendere la membrana colorata in 100-200 ml di tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e omogeneizzare fino a quando non sono più visibili aggregati. La membrana sospesa è stata incubata in 20 mM di tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) contenente il 2% (p/v) di β-DDM per 1 ora al buio a 4 °C sotto agitazione delicata. Quindi centrifugare a 70 °C per sciogliere 150.000 RCF a 4 °C per 1 ora per rimuovere i residui insolubili.
La membrana solubilizzante del ceppo ΔpufW è stata applicata a una colonna a scambio ionico DEAE Sepharose da 50 ml con tre volumi di colonna (CV) di tampone di legame [20 mM tris-HCl (pH 8,0) contenente β-DDM allo 0,03% (p/v)]. Lavare la colonna con due tamponi di legame CV, quindi lavare la colonna con due tamponi di legame contenenti 50 mM NaCl. Il complesso RC-LH116 è stato eluito con un gradiente lineare da 150 a 300 mM NaCl (in tampone di legame) a 1,75 CV, e il complesso di legame rimanente è stato eluito con un tampone di legame contenente 300 mM NaCl a 0,5 CV. Raccogliere lo spettro di assorbimento tra 250 e 1000 nm, mantenere la frazione con rapporto di assorbanza (A880/A280) maggiore di 1 a 880-280 nm, diluirla due volte nel tampone di legame e utilizzare nuovamente la stessa procedura sulla colonna DEAE. Durante la purificazione, diluire le frazioni con rapporti A880/A280 superiori a 1,7 e rapporti A880/A805 superiori a 3,0, eseguire il terzo ciclo di scambio ionico e conservare le frazioni con rapporti A880/A280 superiori a 2,2 e rapporti A880/A805 superiori a 5,0. Il complesso parzialmente purificato è stato concentrato a ~2 ml in un filtro centrifugo Amicon con cut-off di peso molecolare (MWCO) di 100.000 (Merck, Regno Unito) e caricato su una colonna di esclusione dimensionale Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, Stati Uniti) contenente tampone NaCl 200 mM, quindi eluito nello stesso tampone a 1,5 CV. Raccogliere gli spettri di assorbimento della frazione di esclusione dimensionale e concentrare gli spettri di assorbimento con rapporti A880/A280 superiori a 2,4 e rapporti A880/A805 superiori a 5,8 a 100 A880, e utilizzarli immediatamente per la preparazione o la conservazione della griglia cryo-TEM. Conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.
La membrana solubilizzante del ceppo PufW-His è stata applicata a una colonna HisPrep FF Ni-NTA Sepharose da 20 ml (tris-HCl 20 mM (pH 8,0) contenente 200 mM NaCl e 0,03% (p/p)) in tampone IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. La colonna è stata lavata con cinque CV di tampone IMAC e poi con cinque CV di tampone IMAC contenenti 10 mM di istidina. Il complesso centrale è stato eluito dalla colonna con cinque tamponi IMAC contenenti 100 mM di istidina. La frazione contenente il complesso RC-LH114-W è stata concentrata a ~10 ml in un serbatoio agitato dotato di un filtro Amicon 100.000 MWCO (Merck, Regno Unito), diluita 20 volte con tampone di legame e quindi aggiunta a 25 ml Nella colonna DEAE Sepharose, vengono utilizzati in anticipo quattro CV legati al tampone. Lavare la colonna con quattro tamponi di legame CV, quindi eluire il complesso su otto CV su un gradiente lineare da 0 a 100 mM di NaCl (in tampone di legame) e i restanti quattro CV contenenti 100 mM di tampone di legame. I complessi residui eluiti sul cloruro di sodio combinato con il rapporto A880/A280 superiore a 2,4 e il rapporto A880/A805 superiore a 4,6 frazioni sono stati concentrati a ~2 ml in un filtro centrifugo Amicon 100.000 MWCO e riempiti con 1,5 CV IMAC in anticipo. Tampone equilibrato Superdex 200 16/600 colonna di esclusione dimensionale, quindi eluiti nello stesso tampone su 1,5 CV. Raccogliere gli spettri di assorbimento delle frazioni di esclusione dimensionale e concentrare gli spettri di assorbimento con rapporti A880/A280 superiori a 2,1 e rapporti A880/A805 superiori a 4,6 a 100 A880, che vengono immediatamente utilizzati per la preparazione della griglia TEM congelata o conservati a -80°C fino al momento dell'uso.
Per preparare le griglie TEM a bassa temperatura è stato utilizzato un congelatore a immersione Leica EM GP. Il complesso è stato diluito in tampone IMAC a una concentrazione di A880 pari a 50, quindi 5 μl sono stati caricati su una rete di rame rivestita di carbonio QUANTIFOIL 1.2/1.3 appena scaricata a luminescenza (Agar Scientific, Regno Unito). Incubare la griglia a 20 °C e 60% di umidità relativa per 30 secondi, quindi asciugarla per 3 secondi e infine raffreddarla in etano liquido a -176 °C.
I dati del complesso RC-LH114-W sono stati registrati sull'eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) con un microscopio Titan Krios, che funziona a una tensione di accelerazione di 300 kV, con un ingrandimento nominale di 130.000 × e un'energia di 20 eV. Un Gatan 968 GIF Quantum con rilevatore di picco K2 è stato utilizzato per registrare le immagini in modalità di conteggio per raccogliere i dati. La dimensione del pixel calibrato è 1,048 Å e il rateo di dose è 3,83 e-Å-2s-1. Il filmato è stato raccolto in 11 secondi e diviso in 40 parti. Utilizzare l'area rivestita di carbonio per rimettere a fuoco il microscopio, quindi raccogliere tre filmati per foro. In totale, sono stati raccolti 3130 filmati, con valori di sfocatura compresi tra -1 e -3 μm.
I dati per il complesso RC-LH116 sono stati raccolti utilizzando lo stesso microscopio presso l'Asterbury Biostructure Laboratory (Università di Leeds, Regno Unito). I dati sono stati raccolti in modalità di conteggio con un ingrandimento di 130 kJ e la dimensione dei pixel è stata calibrata a 1,065 Å con una dose di 4,6 e-Å-2s-1. Il filmato è stato registrato in 12 secondi e suddiviso in 48 parti. In totale, sono stati raccolti 3359 filmati, con valori di defocus compresi tra -1 e -3 μm.
Tutta l'elaborazione dei dati viene eseguita nella pipeline Relion 3.0 (42). Si utilizza Motioncorr 2 (43) per correggere il movimento del fascio mediante ponderazione della dose, quindi si utilizza CTFFIND 4.1 (44) per determinare il parametro CTF (funzione di trasferimento del contrasto). Tipiche microfotografie dopo queste fasi di elaborazione iniziali sono mostrate nella Figura 2. S16. Il modello di selezione automatica viene generato selezionando manualmente circa 250 pixel di 1000 particelle in un frame da 250 pixel e nessuna classificazione bidimensionale (2D) di riferimento, scartando così le classificazioni che soddisfano i requisiti di contaminazione del campione o non presentano caratteristiche discernibili. Quindi, la selezione automatica è stata eseguita su tutte le microfotografie e il complesso RC-LH114-W era composto da 849.359 particelle e il complesso RC-LH116 da 476.547 particelle. Tutte le particelle selezionate sono state sottoposte a due cicli di classificazione 2D non di riferimento e, dopo ogni ciclo, le particelle che soddisfano i requisiti dell'area del carbonio, della contaminazione del campione, dell'assenza di caratteristiche evidenti o delle particelle fortemente sovrapposte vengono scartate, con il risultato di 772.033 (90,9%) e 359.678 (75,5%) particelle. Le particelle vengono utilizzate per la classificazione 3D rispettivamente di RC-LH114-W e RC-LH116. Il modello di riferimento 3D iniziale è stato generato utilizzando il metodo di discesa del gradiente stocastico. Utilizzando il modello iniziale come riferimento, le particelle selezionate vengono classificate in quattro categorie in 3D. Utilizzando il modello in questa categoria come riferimento, eseguire la raffinazione 3D sulle particelle nella categoria più grande, quindi utilizzare il filtro passa-basso iniziale da 15 Å per coprire l'area del solvente, aggiungere 6 pixel di bordi sfumati e post-elaborare i pixel per correggere la funzione di trasferimento della modulazione del picco Gatan K2 del rivelatore superiore. Per il dataset RC-LH114-W, questo modello iniziale è stato modificato rimuovendo la forte densità ai bordi della maschera (scollegata dalla densità del complesso centrale in UCSF Chimera). I modelli risultanti (le risoluzioni di RC-LH114-W e RC-LH116 sono rispettivamente 3,91 e 4,16 Å) vengono utilizzati come riferimento per il secondo ciclo di classificazione 3D. Le particelle utilizzate sono raggruppate nella classe 3D iniziale e non presentano una forte correlazione con il vicinato. Sovrapposizione o mancanza di caratteristiche strutturali evidenti. Dopo il secondo ciclo di classificazione 3D, è stata selezionata la categoria con la risoluzione più elevata [Per RC-LH114-W, una categoria è composta da 377.703 particelle (44,5%), per RC-LH116, ci sono due categorie, per un totale di 260.752 particelle (54,7%), dove sono le stesse solo quando allineate dopo la rotazione iniziale con una piccola differenza]. Le particelle selezionate vengono estratte nuovamente in un box da 400 pixel e raffinate tramite raffinazione 3D. La maschera del solvente viene generata utilizzando il filtro passa-basso iniziale da 15 Å, l'espansione della mappa a 3 pixel e la maschera morbida a 3 pixel. Utilizzando il raffinamento CTF per particella, la correzione del movimento per particella e il secondo ciclo di raffinamento CTF per particella, il raffinamento 3D, la mascheratura del solvente e la post-elaborazione vengono eseguiti dopo ogni passaggio per perfezionare ulteriormente la texture risultante. Utilizzando il valore di cut-off FSC (coefficiente di correlazione di Fourier Shell) di 0,143, le risoluzioni dei modelli finali di RC-LH114-W e RC-LH116 sono rispettivamente di 2,65 e 2,80 Å. La curva FSC del modello finale è mostrata in Figura 2. S17.
Tutte le sequenze proteiche sono state scaricate da UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID UniProt: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProt: A0A4Z9); Protein-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) è stato utilizzato per costruire un modello di omologia di RC, che contiene le sequenze proteiche di RC-L, RC-M e RC-H e la struttura cristallina di Rba. sphaeroides RC è stato utilizzato come modello (ID PDB: 5LSE) (46). Utilizzare lo strumento "fit map" in UCSF Chimera per adattare il modello generato alla mappa (47), migliorare la struttura proteica e il cofattore [4×BChl a (nome residuo della libreria monomerica = BCL), 2×BPh a (BPH), uno o due tipi di UQ10 (U10), un ferro non eme (Fe) e una 3,4-diidroesacarbonilcolina (QAK)] utilizzare Coot (48) per aggiungere. Poiché QAK non è disponibile nella libreria monomerica, è stato parametrizzato utilizzando lo strumento eLBOW in PHENIX (49).
Successivamente, è stata costruita la subunità LH1. Inizialmente, lo strumento di costruzione automatica in PHENIX (49) è stato utilizzato per costruire automaticamente parte della sequenza LH1 utilizzando la mappa e le sequenze proteiche LH1-α e LH1-β come input. Selezionare la subunità LH1 più completa, estrarla e caricarla in Coot, aggiungere manualmente la sequenza mancante e perfezionare manualmente l'intera struttura prima di aggiungere due BCls a (BCL) e una spirilloxantina (CRT) [in base alla Rps pertinente, alla densità del complesso LH1 e al contenuto di carotenoidi noto. Specie (17)]. Copiare la subunità LH1 completa e utilizzare lo strumento "Docking Map Tool" di UCSF Chimera per agganciarla all'area non modello adiacente della densità LH1, quindi perfezionarla in Coot; ripetere il processo fino a quando tutte le subunità LH1 non sono state modellate. Per la struttura RC-LH114-W, estraendo la densità non allocata in Coot, la proteina viene segmentata dai componenti non proteici rimanenti nella mappa Chimera USCF e lo strumento Autobuild viene utilizzato per stabilire il modello iniziale e la modellazione delle subunità rimanenti (proteina-W). In PHENIX (49). Aggiungere eventuali sequenze mancanti al modello risultante in Coot (48), quindi perfezionare manualmente l'intera subunità. La densità non allocata rimanente si adatta alla combinazione di lipidi (ID della libreria monomerica PDB di CDL = CDL, POPC = 6PL e POPG = PGT), detergente β-DDM (LMT) e molecole UQ10 (U10). Utilizzare l'ottimizzazione PHENIX (49) e l'ottimizzazione manuale in Coot (48) per perfezionare il modello iniziale completo fino a quando le statistiche del modello e la qualità visiva dell'adattamento non possono essere ulteriormente migliorate. Infine, utilizzare LocScale (50) per affinare la mappa locale, quindi eseguire diversi altri cicli di modellazione della densità non allocata e ottimizzazione automatica e manuale.
I rispettivi peptidi, cofattori e altri lipidi e chinoni ancorati alle rispettive densità sono mostrati nelle Figure 1 e 2, da S18 a S23. Le informazioni statistiche del modello finale sono mostrate nella Tabella S1.
Salvo diversa indicazione, gli spettri di assorbimento UV/Vis/NIR sono stati raccolti su uno spettrofotometro Cary60 (Agilent, USA) a intervalli di 1 nm da 250 nm a 1000 nm e con un tempo di integrazione di 0,1 s.
Diluire il campione in una cuvetta di quarzo con un cammino ottico di 2 mm fino a A880 pari a 1 e raccogliere lo spettro di assorbimento tra 400 e 1000 nm. Gli spettri dicroici circolari sono stati raccolti su uno spettropolarimetro Jasco 810 (Jasco, Giappone) a intervalli di 1 nm tra 400 nm e 950 nm a una velocità di scansione di 20 nm min-1.
Il coefficiente di estinzione molare viene determinato diluendo il complesso centrale a un A880 di circa 50. Diluire il volume di 10 μl in 990 μl di tampone di legame o metanolo e raccogliere immediatamente lo spettro di assorbimento per ridurre al minimo la degradazione del BChl. Il contenuto di BChl di ciascun campione di metanolo è stato calcolato tramite il coefficiente di estinzione a 771 nm di 54,8 mM-1 cm-1 e il coefficiente di estinzione è stato determinato (51). Dividere la concentrazione di BChl misurata per 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) per determinare la concentrazione del complesso centrale, che viene quindi utilizzata per determinare lo spettro di assorbimento dello stesso campione raccolto nel tampone Coefficiente di estinzione. Parallelamente, sono state effettuate tre misurazioni ripetute per ciascun campione e l'assorbanza media del massimo di BChl Qy è stata utilizzata per il calcolo. Il coefficiente di estinzione di RC-LH114-W misurato a 878 nm è 3280±140 mM-1 cm-1, mentre il coefficiente di estinzione di RC-LH116 misurato a 880 nm è 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 è stato quantificato secondo il metodo in (52). In breve, è stata eseguita un'HPLC in fase inversa (RP-HPLC) utilizzando il sistema HPLC Agilent 1200. Sciogliere circa 0,02 nmol di RC-LH116 o RC-LH114-W in 50 μl di metanolo:cloroformio 50:50 contenente cloruro ferrico allo 0,02% (p/v) e iniettare la soluzione preequilibrata Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm. Sciogliere in 1 ml-1 min-1 a 40 °C in solvente HPLC (metanolo:2-propanolo 80:20) su una colonna da 25 cm. Eseguire un'eluizione isocratica in un solvente HPLC per monitorare l'assorbanza a 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoidi) e 780 nm (BChl) per 1 ora. È stato integrato il picco nel cromatogramma a 275 nm a 25,5 minuti, che non conteneva altri composti rilevabili. L'area integrata viene utilizzata per calcolare la quantità molare di UQ10 estratta con riferimento alla curva di calibrazione calcolata dall'iniezione di standard puri da 0 a 5,8 nmol (Figura S14). Ogni campione è stato analizzato in tre repliche e l'errore riportato corrisponde alla deviazione standard della media.
Una soluzione contenente il complesso RC-LH1 con un assorbimento Qy massimo di 0,1 è stata preparata con 30 μM di citocromo c2 ridotto di cuore di cavallo (Merck, Regno Unito) e da 0 a 50 μMUQ2 (Merck, Regno Unito). Tre campioni da 1 ml sono stati preparati a ciascuna concentrazione di UQ2 e incubati per una notte al buio a 4 °C per garantire il completo adattamento al buio prima della misurazione. La soluzione è stata caricata in uno spettrofotometro modulare OLIS RSM1000 dotato di un reticolo a fiamma da 300 nm/500 linee, fessure di ingresso da 1,24 mm, fessure centrali da 0,12 mm e fessure di uscita da 0,6 mm. Un filtro passa-lungo da 600 nm è posizionato all'ingresso del fototubo del campione e del fotomoltiplicatore di riferimento per escludere la luce di eccitazione. L'assorbanza è stata monitorata a 550 nm con un tempo di integrazione di 0,15 s. La luce di eccitazione viene emessa dal LED (diodo a emissione luminosa) M880F2 da 880 nm (Thorlabs Ltd., Regno Unito) attraverso un cavo in fibra ottica al 90% di intensità tramite un controller DC2200 (Thorlabs Ltd., Regno Unito) e viene emessa verso la sorgente luminosa con un angolo di 90°. Il fascio di misura è opposto allo specchio per restituire la luce non inizialmente assorbita dal campione. Monitorare l'assorbanza 10 s prima dell'illuminazione di 50 s. Quindi l'assorbanza è stata ulteriormente monitorata per 60 s al buio per valutare in che misura il chinololo riduce spontaneamente il citocromo c23+ (vedere la Figura S8 per i dati grezzi).
I dati sono stati elaborati adattando una velocità iniziale lineare compresa tra 0,5 e 10 s (a seconda della concentrazione di UQ2) e calcolando la media delle velocità di tutti e tre i campioni a ciascuna concentrazione di UQ2. La concentrazione di RC-LH1 calcolata tramite il rispettivo coefficiente di estinzione è stata utilizzata per convertire la velocità nell'efficienza catalitica, rappresentata graficamente in Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) e adattata al modello di Michaelis-Menten per determinare i valori apparenti di Km e Kcat.
Per le misurazioni di assorbimento transitorio, il campione RC-LH1 è stato diluito a ~2 μM in tampone IMAC contenente 50 mM di ascorbato di sodio (Merck, USA) e 0,4 mM di terbutina (Merck, USA). L'acido ascorbico viene utilizzato come donatore di elettroni sacrificale e il tert-butaclofene viene utilizzato come inibitore del QB per garantire che il principale donatore di RC rimanga ridotto (ovvero, non fotoossidato) durante l'intero processo di misurazione. Circa 3 ml di campione vengono aggiunti a una cella rotante personalizzata (circa 0,1 m di diametro, 350 giri al minuto) con un percorso ottico di 2 mm per garantire che il campione nel percorso laser abbia tempo sufficiente per l'adattamento al buio tra gli impulsi di eccitazione. Utilizzare impulsi laser da ~100 fs per amplificare il sistema laser Ti:Zaffiro (Spectra Physics, USA) per eccitare il campione a 880 nm a una frequenza di ripetizione di 1 kHz (20 nJ per NIR o 100 nJ per Vis). Prima di raccogliere i dati, esporre il campione alla luce di eccitazione per circa 30 minuti. L'esposizione causerà l'inattivazione del QA (riducendo eventualmente il QA una o due volte). Tuttavia, si noti che questo processo è reversibile perché, dopo un lungo periodo di adattamento al buio, il RC tornerà lentamente all'attività QA. Uno spettrometro Helios (Ultrafast Systems, USA) è stato utilizzato per misurare gli spettri transitori con un tempo di ritardo da -10 a 7000 ps. Utilizzare il software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) per separare i set di dati, quindi unirli e standardizzarli. Utilizzare il pacchetto software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) per utilizzare il set di dati combinato per ottenere spettri differenziali correlati al decadimento, oppure utilizzare una funzione che convolga più esponenti con la risposta dello strumento per adattare l'evoluzione spettrale a lunghezza d'onda singola in Origin (OriginLab, USA).
Come accennato in precedenza (53), è stato preparato un film fotosintetico contenente il complesso LH1 privo sia di RC che di antenna periferica LH2. La membrana è stata diluita in 20 mM di tris (pH 8,0) e quindi caricata in una cuvetta di quarzo con un cammino ottico di 2 mm. Un impulso laser da 30 nJ è stato utilizzato per eccitare il campione a 540 nm con un tempo di ritardo da -10 a 7000 ps. Elaborare il set di dati come descritto per il campione Rps. pal.
La membrana è stata centrifugata a 150.000 RCF per 2 ore a 4 °C, quindi la sua assorbanza a 880 nm è stata risospesa in 20 mM di tris-HCl (pH 8,0) e 200 mM di NaCl. Sciogliere la membrana agitando lentamente in β-DDM al 2% (p/v) per 1 ora al buio a 4 °C. Il campione è stato diluito in 100 mM di carbonato di trietilammonio (pH 8,0) (TEAB; Merck, Regno Unito) fino a una concentrazione proteica di 2,5 mg ml-1 (analisi Bio-Rad). L'ulteriore elaborazione è stata eseguita secondo il metodo precedentemente pubblicato (54), iniziando con la diluizione di 50 μg di proteina in un totale di 50 μl di TEAB contenente l'1% (p/v) di laurato di sodio (Merck, Regno Unito). Dopo sonicazione per 60 secondi, il campione è stato ridotto con 5 mM di tris(2-carbossietil)fosfina (Merck, Regno Unito) a 37 °C per 30 minuti. Per la S-alchilazione, incubare il campione con 10 mM di metil-S-metiltiometansolfonato (Merck, Regno Unito) e aggiungerlo da una soluzione madre di isopropanolo 200 mM per 10 minuti a temperatura ambiente. La digestione proteolitica è stata effettuata aggiungendo 2 μg di miscela tripsina/endoproteinasi Lys-C (Promega Regno Unito) e incubata a 37 °C per 3 ore. Il tensioattivo laurato è stato estratto aggiungendo 50 μl di acetato di etile e 10 μl di acido trifluoroacetico al 10% (v/v) di grado LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, Regno Unito) e agitando su vortex per 60 secondi. La separazione di fase è stata favorita mediante centrifugazione a 15.700 RCF per 5 minuti. Secondo il protocollo del produttore, è stata utilizzata una colonna centrifuga C18 (Thermo Fisher Scientific, Regno Unito) per aspirare e desalificare accuratamente la fase inferiore contenente il peptide. Dopo l'essiccazione mediante centrifugazione sotto vuoto, il campione è stato disciolto in TFA allo 0,5% e acetonitrile al 3% e 500 ng sono stati analizzati mediante cromatografia RP a nanoflusso accoppiata a spettrometria di massa utilizzando i parametri di sistema descritti in precedenza.
Utilizzare MaxQuant v.1.5.3.30 (56) per l'identificazione e la quantificazione delle proteine ​​per cercare il database del proteoma di Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). I dati di proteomica della spettrometria di massa sono stati depositati nella ProteomeXchange Alliance tramite il repository del partner PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) con l'identificativo del dataset PXD020402.
Per l'analisi mediante RPLC accoppiata alla spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray, il complesso RC-LH1 è stato preparato da Rps di tipo selvatico. Utilizzando il metodo precedentemente pubblicato (16), la concentrazione proteica prodotta nelle cellule palustris era di 2 mg ml-1 in 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl e 0,03% (p/v) β- (analisi Bio-Rad) DDM. Secondo il protocollo del produttore, utilizzare il kit di purificazione 2D (GE Healthcare, USA) per estrarre 10 μg di proteine ​​mediante metodo di precipitazione e sciogliere il precipitato in 20 μl di acido formico (FA) al 60% (v/v), acetonitrile al 20% (v/v) e acqua al 20% (v/v). Cinque microlitri sono stati analizzati mediante RPLC (Dionex RSLC) accoppiata alla spettrometria di massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Utilizzare la colonna MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Regno Unito) per la separazione a 60 °C e 100 μlmin-1, con un gradiente dell'85% (v/v) di solvente A [0,1% (v/v) di FA e 0,02% (V/v) di TFA in soluzione acquosa] all'85% (v/v) di solvente B [0,1% (v/v) di FA e 0,02% (v/v) in acetonitrile TFA al 90% (v/v)]. Utilizzando una sorgente di ionizzazione elettrospray standard e parametri predefiniti per più di 60 minuti, lo spettrometro di massa ottiene da 100 a 2750 m/z (rapporto massa-carica). Con l'aiuto dello strumento FindPept del portale di risorse bioinformatiche ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mappare lo spettro di massa alle subunità del complesso.
Le cellule sono state coltivate per 72 ore sotto 100 ml di luce NF-low (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) o high (300μMm-2 s-1). Terreno M22 (terreno M22 in cui il solfato di ammonio è omesso e il succinato di sodio è sostituito da acetato di sodio) in un flacone con tappo a vite da 100 ml (23). In cinque cicli da 30 secondi, microsfere di vetro da 0,1 micron sono state inglobate in un rapporto di volume di 1:1 per lisare le cellule e raffreddate in ghiaccio per 5 minuti. La materia insolubile, le cellule intatte e le microsfere di vetro sono state rimosse mediante centrifugazione a 16.000 RCF per 10 minuti in una microcentrifuga da banco. La membrana è stata separata in un rotore Ti 70.1 con 100.000 RCF in 20 mM di tris-HCl (pH 8,0) con un gradiente di saccarosio del 40/15% (p/p) per 10 ore.
Come descritto nel nostro lavoro precedente, l'immunodetezione del tag His su PufW (16) è stata effettuata utilizzando il complesso del core purificato (11,8 nM) o la membrana contenente la stessa concentrazione di RC (determinata per ossidazione sottraendo lo spettro di differenza ridotto e adattando il carico sul gel colorato) in tampone di caricamento SDS 2x (Merck, Regno Unito) diluito due volte. Le proteine ​​sono state separate su una replica del gel bis-tris NuPage al 12% (Thermo Fisher Scientific, Regno Unito). Un gel è stato colorato con Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Regno Unito) per caricare e visualizzare la subunità RC-L. La proteina sul secondo gel è stata trasferita su una membrana di polivinilidenfluoruro (PVDF) attivato con metanolo (Thermo Fisher Scientific, Regno Unito) per l'immunoanalisi. La membrana PVDF è stata bloccata in 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) di Tween-20 e 5% (p/v) di latte scremato in polvere, e quindi incubata con l'anticorpo primario anti-His (in Diluire il tampone anticorpale [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl e 0,05% (v/v) di Tween-20] in 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) per 4 ore. Dopo 3 lavaggi per 5 minuti nel tampone anticorpale, la membrana è stata combinata con l'anticorpo secondario anti-topo alla perossidasi di rafano (Sigma-Aldrich, Regno Unito) (diluito 1:10.000 nel tampone anticorpale). Incubare per consentire il rilevamento (5 minuti dopo 3 lavaggi nel tampone anticorpale) utilizzando il substrato di chemiluminescenza WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) e Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Regno Unito).
Disegnando la distribuzione dell'intensità di ogni gel colorato o corsia dell'immunoanalisi, integrando l'area sotto il picco e calcolando il rapporto di intensità di RC-L (gel colorato) e Protein-W (immunoanalisi), in ImageJ (57) Elaborare l'immagine. Questi rapporti sono stati convertiti in rapporti molari assumendo che il rapporto tra RC-L e proteina-W nel campione puro di RC-LH114-W fosse 1:1 e normalizzando di conseguenza l'intero set di dati.
Per materiali supplementari per questo articolo, vedere http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
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La struttura ad alta risoluzione del complesso della trappola luminosa 1 nel centro di reazione fornisce nuove informazioni sulla dinamica dei chinoni.
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