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Il complesso di raccolta della luce del centro di reazione 1 (RC-LH1) è il componente fotosintetico fondamentale dei batteri fototrofi viola. Abbiamo introdotto due strutture del complesso RC-LH1 di Rhodopseudomonas palustris ottenute tramite microscopia crioelettronica. La struttura a risoluzione di 2,65 Å del complesso RC-LH114-W è costituita da 14 anelli LH1 che circondano il centro di reazione (RC), interrotti dalla proteina W, mentre il complesso senza proteina W è composto interamente dal centro di reazione (RC) circondato da un anello LH1 chiuso a 16 subunità. Il confronto di queste strutture fornisce informazioni sulla dinamica del chinone nel complesso RC-LH1, inclusi cambiamenti conformazionali precedentemente non determinati durante il legame del chinone al sito QB del centro di reazione (RC), nonché la posizione di siti di legame ausiliari per il chinone, che ne facilitano il passaggio al centro di reazione (RC). La struttura unica della proteina W impedisce la chiusura dell'anello LH1, creando così un canale per accelerare lo scambio chinone/chinolone.
L'energia fornita dalla fotosintesi può sostenere quasi tutta la vita sulla Terra e ha un grande potenziale per la biotecnologia solare. Oltre a promuovere la fotosintesi globale, i batteri fototrofi viola mostrano anche diverse modalità energetiche e capacità metaboliche. Possono evitare la fotosintesi e crescere come batteri eterotrofi al buio, possono fissare azoto e anidride carbonica, produrre idrogeno e degradare composti aromatici (1-3). Per fornire energia a questi processi, la luce deve essere convertita rapidamente ed efficientemente in energia chimica. Questo processo inizia quando il complesso antenna di cattura della luce assorbe la luce e trasferisce l'energia intrappolata al centro di reazione (RC), avviando così la separazione di carica (4-7). L'unità base della fotosintesi nei batteri fototrofi viola è composta da un RC di tipo 2, circondato dal complesso di raccolta della luce 1 (LH1), che forma il complesso centrale RC-LH1. LH1 è formato da una serie di eterodimeri αβ curvi, ognuno dei quali lega due molecole di clorofilla batterica (BChl) a e uno o due carotenoidi (8-12). L'antenna LH1 più semplice è costituita da 16 o 17 eterodimeri αβ che circondano RC (9-13) in un anello chiuso, ma in altri complessi centrali, i peptidi transmembrana interrompono la continuità dell'LH1 circostante, promuovendo così la diffusione di chinolo/chinone tra RC e il complesso citocromo bc1 (11, 13-15). La pianta fototrofa viola Rhodopseudomonas (Rps.) è un organismo modello che può comprendere il trasferimento di energia ed elettroni che supporta la fotosintesi. La prima struttura cristallina di Rps. Il modello del complesso RC-LH1 di palustris è RC, circondato da 15 anelli eterodimerici di LH1, che sono interrotti da una proteina sconosciuta chiamata "Proteina W" (14). La Proteina W è stata successivamente identificata come RPA4402, che è una proteina non caratterizzata di 10,5 kDa con tre eliche transmembrana (TMH) previste (16). Proponiamo di rinominare il gene rpa4402 che codifica la proteina W in pufW per essere coerenti con la nomenclatura utilizzata per i geni che codificano le subunità RC-L, M (pufL, pufM) e LH1α, β (pufA, pufB). È interessante notare che la proteina W è presente solo in circa il 10% di RC-LH1, rivelando che Rps. palustris produce due diversi complessi RC-LH1. Qui, riportiamo le strutture ad alta risoluzione ottenute tramite crio-EM (crio-EM) di due complessi centrali, uno con la proteina W e 14 eterodimeri αβ, l'altro senza la proteina W e un anello LH1 chiuso a 16 eterodimeri. La nostra struttura rappresenta un cambiamento di rotta nella comprensione del complesso RC-LH1 di Rps. palustris, perché abbiamo analizzato la popolazione omogenea di ciascuna variante e abbiamo una risoluzione sufficiente per assegnare chiaramente ogni peptide e i pigmenti legati e i lipidi e chinoni correlati. Il confronto di queste strutture mostra che le tre proteine ​​TMH-W che non sono state trovate in nessun altro complesso RC-LH1 finora generano un canale per i chinoni per accelerare lo scambio chinone/chinolone. Sono stati identificati numerosi siti di legame conservati per lipidi e chinoni e abbiamo rivelato un nuovo cambiamento conformazionale dopo la combinazione di chinone e RC, che potrebbe essere adatto per il fotosistema II (PSII) RC degli organismi fototrofi ossigenati. I nostri risultati forniscono nuove informazioni sulla cinetica del legame e dello scambio chinone/chinolone nel complesso centrale RC-LH1 dei batteri fototrofi viola.
Al fine di facilitare uno studio dettagliato dei due complessi trovati in Rps. palustris, isoliamo ciascun RC-LH1 mediante metodi biochimici. Il complesso carente di proteina W (di seguito denominato ΔpufW) è stato purificato dal ceppo privo del gene pufW (16), e può essere prodotto un solo complesso RC-LH1. Il complesso contenente la proteina W è prodotto da un ceppo. La proteina W di questo ceppo è modificata con un tag 10x His al suo C-terminale, in modo che il complesso contenente la proteina W possa essere efficacemente combinato con la maggior parte della proteina W priva mediante immobilizzazione del metallo. Il complesso viene efficacemente separato (16) mediante cromatografia di affinità (IMAC).
Come illustrato nella Figura 1, entrambi i complessi contengono un RC a tre subunità (RC-L, RC-M e RC-H) circondato da un'antenna LH1. La struttura a 2,80 Å del complesso privo di proteina W mostra 16 eterodimeri αβ, che formano un anello LH1 chiuso che circonda completamente l'RC, di seguito denominato complesso RC-LH116. La struttura a 2,65 Å del complesso contenente proteina W presenta un LH1 a 14 eterodimeri interrotto dalla proteina W, di seguito denominato RC-LH114-W.
(A e B) Rappresentazione di superficie del composto. (C e D) Pigmenti legati espressi in bastoncini. (E e F) I complessi osservati dalla superficie citoplasmatica hanno i peptidi e le subunità LH1 rappresentati in cartoni animati e sono numerati in senso orario a partire dallo spazio proteina-W [in linea con la numerazione Rba. complesso sphaeroides (13)]. Per LH1-α, il colore della subunità proteica è giallo; per LH1-β, il colore della subunità proteica è blu; per la proteina-W, la proteina è rossa; per RC-H, è ciano; per RC-L, è arancione; per RC-M, magenta. I cofattori sono rappresentati da bastoncini, il verde rappresenta le molecole di BChl e BPh a, il viola rappresenta i carotenoidi e il giallo rappresenta le molecole di UQ10. (G e H) Vista ingrandita dello spazio proteina-W nella regione equivalente del complesso RC-LH114-W (G) e del complesso RC-LH116 (H). I cofattori sono visualizzati come spazi vuoti, il chinone chelato è visualizzato in blu. Lo spazio tra la proteina W e l'anello LH116 è evidenziato da una linea tratteggiata blu in (G), e i piccoli fori in cui il chinone/chinololo diffonde sull'anello LH116 sono evidenziati da una linea tratteggiata nera in (H).
La Figura 1 (A e B) mostra il RC circondato da array aperti o chiusi di eterodimeri LH1αβ, ognuno dei quali lega due BChl e un carotenoide (Figura 1, C e D). Studi precedenti hanno dimostrato che Rps è il complesso LH1. Nel percorso biosintetico della xantina di spirulina, queste specie contengono popolazioni miste di carotenoidi (17). Tuttavia, la spiropirroxantina è il carotenoide dominante e la sua densità è soddisfacente. Pertanto, abbiamo scelto di modellare la spiroxantina in tutti i siti di legame LH1. I polipeptidi alfa e beta sono singoli TMH con brevi regioni esterne di membrana (Figura 1, A, B, E e F). Sebbene non sia stata osservata la densità di 17 residui al C-terminale, il polipeptide alfa è stato scisso da Met1 ad Ala46 in entrambi i complessi. Il polipeptide β è stato ridotto da Gly4 a Tyr52 in RC-LH116 e da Ser5 a Tyr52 in RC-LH114-W. Non è stata osservata alcuna densità di 3 o 4 residui N-terminali o 13 residui C-terminali (Figura S1). L'analisi mediante spettrometria di massa del complesso misto RC-LH1 preparato dal ceppo wild-type ha mostrato che la regione mancante era il risultato della scissione eterologa di questi peptidi (Figure S1 e S2). È stata osservata anche la formilazione N-terminale di α-Met1 (f). L'analisi ha mostrato che il peptide α è costituito dai residui fMet1 a Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 e il peptide β è costituito dai residui Ser2 a Ala53, il che è in buon accordo con la mappa di densità EM a bassa temperatura.
Il coordinamento di α-His29 e β-His36 fa sì che le BChl si trovino faccia a faccia; ogni eterodimero αβ si assembla con i suoi vicini per formare un anello aperto (RC-LH114-W) o un anello chiuso (RC-LH116) attorno all'array di pigmenti accoppiati all'eccitone RC (Figura 1, C e D). Rispetto alla banda a 877 nm di RC-LH114-W, lo spostamento verso il rosso dell'assorbimento a 880 nm di RC-LH116 è di 3 nm (Figura 2A). Tuttavia, lo spettro di dicroismo circolare è quasi identico (Figura 2B), indicando che, sebbene vi sia una chiara differenza tra anelli aperti e chiusi, l'ambiente locale delle BChl è molto simile. Lo spostamento verso il rosso dell'assorbimento può essere il risultato di un moto termico ridotto e di una maggiore stabilità sul circuito chiuso (18, 19), del cambiamento nell'accoppiamento del pigmento causato dal circuito chiuso (20, 21), o di una combinazione di questi due effetti (11).
(A) Spettro di assorbimento ultravioletto/visibile/vicino infrarosso, i cui picchi sono contrassegnati con i rispettivi pigmenti e normalizzati al picco BPh a 775 nm. (B) Spettro di dicroismo circolare normalizzato all'assorbanza BChl a 805 nm. (C e D) Spettri ΔA selezionati dagli spettri di assorbimento risolti nel tempo del complesso RC-LH114-W (C) e del complesso RC-LH116 (D). Per una migliore comparabilità, tutti gli spettri sono normalizzati a ∆A di −A a 0,2 ps. (E) Velocità di ossidazione del citocromo c2 dopo irradiazione in presenza di varie concentrazioni di UQ2 (vedere la Figura S8 per i dati grezzi). (F) Nelle cellule coltivate sotto luce a bassa, media o alta intensità (rispettivamente 10, 30 o 300 μMm-2 s-1), le subunità proteiche W e RC-L nel complesso purificato e il rapporto della membrana separata. Determinare il livello proteico mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS e immunodosaggio (vedere la Figura S9 per i dati grezzi). Determinare il rapporto relativo al complesso RC-LH114-W purificato. Il rapporto stechiometrico di RC-L rispetto alla proteina W del complesso è 1:1.
Le BChl in posizione 1 nell'ansa αβ14 deformata di RC-LH114-W (Figura 1, A, C ed E) sono più vicine al donatore primario RC (P) di 6,8 Å rispetto alle BChl equivalenti in RC-LH116 (Figura 1, B, D ed F e Figura S3); tuttavia, la cinetica di assorbimento transitorio dei due complessi mostra che per RC-LH114-W e RC-LH116, le costanti di tempo di trasferimento dell'energia di eccitazione da LH1 a RC sono 40 ±4 e 44 ±3 ps (Figura 2, C e D, Figura S4 e Tabella S2). Non vi è inoltre alcuna differenza significativa nel trasferimento elettronico all'interno di RC (Figura S5 e relativo testo supplementare). Sospettiamo che la stretta corrispondenza del tempo di trasferimento di energia tra LH1 e RC-P sia dovuta alla simile distanza, angolo ed energia potenziale della maggior parte delle BChl nelle due anse LH1. Sembra che esplorare il modello energetico LH1 per raggiungere la distanza minima non sia più veloce del trasferimento di energia diretto da siti subottimali a RC. L'anello aperto LH1 in RC-LH114-W può anche subire un movimento termico insignificante in condizioni di bassa temperatura per l'analisi strutturale, e c'è una conformazione dell'anello αβ14 più lunga a temperatura ambiente dalla distanza di pigmentazione delle βBChl nella posizione di RC 1.
Il complesso RC-LH116 contiene 32 BChl e 16 carotenoidi, e la sua disposizione generale è la stessa ottenuta da Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) ceppo 970 (PDB ID 7C9R) (12) e alghe verdi (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Dopo l'allineamento, sono state osservate solo piccole deviazioni nelle posizioni degli eterodimeri αβ, in particolare 1-5, 15 e 16 (Figura S6). La presenza della proteina W ha un impatto significativo sulla struttura di LH1. I suoi tre TMH sono collegati da brevi anelli, con l'N-terminale sul lato del lume del complesso e il C-terminale sul lato citoplasmatico (Figure 1A e 3, da A a D). La proteina W è in gran parte idrofobica (Figura 3B) e TMH2 e TMH3 interagiscono con LH1αβ-14 per formare una superficie transmembrana (Figura 3, B e da E a G). L'interfaccia è composta principalmente da residui di Phe, Leu e Val nella regione transmembrana. Questi residui sono impilati con amminoacidi idrofobici e pigmenti αβ-14. Anche alcuni residui polari contribuiscono all'interazione, incluso il legame idrogeno tra W-Thr68 e β-Trp42 sulla superficie della cavità del complesso (Figura 3, F e G). Sulla superficie del citoplasma, Gln34 è adiacente al gruppo chetonico dei carotenoidi αβ-14. Inoltre, è stata risolta la molecola di n-dodecil β-d-maltoside (β-DDM) e la sua coda idrofobica si estendeva fino all'interfaccia tra la proteina W e αβ-14, mentre la coda lipidica potrebbe essere localizzata nel corpo. Abbiamo anche notato che le regioni di risoluzione C-terminale della proteina W e di RCH sono molto vicine, ma non tali da formare interazioni specifiche (Figura 1, A ed E). Tuttavia, potrebbero esserci interazioni negli amminoacidi C-terminali non risolti di queste due proteine, il che potrebbe fornire un meccanismo per il reclutamento della proteina W durante l'assemblaggio del complesso RC-LH114-W.
(A) La proteina W, che si trova di fronte all'interfaccia con LH1αβ14 in forma di cartone animato, ha una catena laterale a forma di bastoncino (rossa), visualizzata in una parte del diagramma del potenziale elettrostatico (superficie grigia trasparente con un livello di contorno di 0,13). (B) Proteina W rappresentata da una superficie colorata idrofobica. Le aree polari e cariche sono visualizzate in ciano, le aree idrofobiche sono visualizzate in bianco e le aree fortemente idrofobiche sono visualizzate in arancione. (C e D) Proteina W rappresentata in forma di cartone animato, il suo orientamento è lo stesso di (A) (C), e ruotata di 180° (D). In base alla posizione nella sequenza, i residui distinguibili adottano uno schema di colori arcobaleno, dove l'N-terminale è blu e il C-terminale è rosso. (E) Proteina W nella stessa vista di (A), e i residui all'interfaccia proteina W:LH1 sono rappresentati da bastoncini con marcatori allegati. (F) La proteina W è ruotata di 90° rispetto a (E) e LH1αβ14 nella rappresentazione a cartone animato e rispetto ai residui dell'interfaccia nella rappresentazione a barre. I residui sporgenti del polipeptide beta sono etichettati. Il cofattore è mostrato come una barra corrispondente al colore della Figura 1, il β-DDM decomposto è mostrato in grigio e l'ossigeno è mostrato in rosso. (G) La vista in (F) è ruotata di 180°, con i residui prominenti del polipeptide alfa etichettato.
La proteina W sostituisce un eterodimero αβ (il 15° nella Figura 1F), impedendo così la chiusura dell'ansa e inclinando i primi tre eterodimeri αβ. È stato osservato che l'angolo di inclinazione massimo del primo eterodimero αβ-1 rispetto alla normale del film era compreso tra 25° e 29° (Figura 1, A ed E), formato dall'inclinazione di 2°-8° di αβ-1 in RC A sharp contrast-LH116 (Figura 1, B ed F). Il secondo e il terzo eterodimero sono inclinati rispettivamente di 12°-22° e 5°-10°. A causa dell'ingombro sterico del RC, l'inclinazione di αβ-1 non include la seconda coppia di αβ (che corrisponde alla 16a αβ nella Figura 1F), formando così un chiaro spazio vuoto nell'anello LH1 (Figura 1, A ed E). A causa della mancanza di due eterodimeri αβ, accompagnata dalla perdita di quattro BChl e due carotenoidi, nessuno dei carotenoidi si lega alla subunità αβ-1 attorcigliata, risultando in un anello LH114-W contenente 13 carotenoidi e 28 BChl. Le stime di risoluzione locale dei due complessi nelle regioni da αβ1 a 7 sono inferiori a quelle del resto dell'ansa LH1, il che potrebbe riflettere l'intrinseca plasticità della subunità LH1 adiacente al sito RC QB (Figura 4).
Le immagini di RC-LH114-W (A e B) e RC-LH116 (C e D) sono mostrate dalla stessa vista dall'alto/laterale (A e B) (A e C) e dalla superficie della cavità della Fig. 1 (B e D). Le legende colorate sono mostrate a destra.
L'unico altro complesso centrale caratteristico con un rapporto stechiometrico di 1:14 è il dimero RC-LH1-PufX di Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Tuttavia, la proteina W e PufX non hanno un'omologia evidente e hanno un impatto significativo sulle rispettive strutture LH1. PufX è un singolo TMH con un dominio citoplasmatico N-terminale che interagisce con il lato citoplasmatico della subunità RC-H (13) in una posizione corrispondente a Rps. palustris LH116αβ-16. PufX crea un canale per lo scambio chinone/chinolone tra RC-LH1 e il complesso citocromo bcl ed è presente in tutti i complessi centrali di Rba. sphaeroides (13). Sebbene l'interfaccia monomero-monomero sia in Rba. Il dimero RC-LH1-PufX di Sphaeroides si trova nella posizione di legame della proteina W in RC-LH114-W, e lo spazio indotto da PufX e dalla proteina W si trova in una posizione equivalente (Figura S7A). Lo spazio in RC-LH114-W è anche allineato con l'ipotetico canale del chinone (8) di Pseudomonas rosea LH1, che è formato da peptidi non correlati alla proteina W o a PufX (Figura S7B). Inoltre, il canale del chinone in Blc. L'LH1 verde smeraldo formato escludendo una subunità γ (7) si trova in una posizione simile (Figura S7C). Sebbene mediati da proteine ​​diverse, la comparsa di questi canali chinone/chinololo in una posizione comune nel complesso RC-LH1 sembra essere un esempio di evoluzione convergente, indicando che lo spazio creato dalla proteina W può agire come un canale del chinone.
Lo spazio vuoto nell'ansa LH114-W consente la formazione di una regione di membrana continua tra lo spazio interno del complesso RC-LH114-W e la membrana circostante (Figura 1G), anziché collegare i due domini attraverso un poro proteico come nelle proteine. Il complesso RC-LH116 è simile a un complesso Tch. aghiforme chiuso (22) (Figura 1H). Poiché la diffusione del chinone attraverso la membrana è più veloce della diffusione attraverso lo stretto canale proteico, l'ansa LH114-W aperta può consentire un turnover RC più rapido rispetto all'ansa LH116 chiusa e la diffusione del chinone nell'RC può essere più limitata. Per verificare se la proteina W influisce sulla conversione dei chinoni attraverso l'RC, abbiamo eseguito un saggio di ossidazione del citocromo su una certa concentrazione di ubichinone 2 (UQ2) (un analogo dell'UQ10 naturale con una coda isoprenica più corta) (Figura 2E). Sebbene la presenza di chinone chelato ostacoli la determinazione accurata della costante di Michaelis apparente (RC-LH114-W e RC-LH116 sono adatti rispettivamente per 0,2±0,1μM e 0,5±0,2μM), la velocità massima di RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) è del 28±5% maggiore di quella di RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Inizialmente abbiamo stimato che la proteina W è presente in circa il 10% del complesso centrale (16); qui, i tassi di occupazione delle cellule di crescita a bassa, media e alta luce sono rispettivamente 15±0,6%, 11±1% e 0,9±0,5% (Figura 2F). Il confronto quantitativo della spettrometria di massa ha mostrato che l'aggiunta del tag di istidina non ha ridotto l'abbondanza relativa della proteina W rispetto ai ceppi di tipo selvatico (P = 0,59), quindi questi livelli non sono un artefatto della proteina W modificata (Figura S10). Tuttavia, questa bassa occupazione della proteina W nel complesso RC-LH1 potrebbe consentire ad alcuni RC di ribaltarsi a una velocità accelerata, mitigando così il più lento scambio chinone/chinolone nel complesso RC-LH116. Abbiamo notato che il tasso di occupazione ad alta luce è incoerente con i recenti dati di trascrittomica, che indicano che l'espressione del gene pufW aumenta in condizioni di luce forte (Figura S11) (23). La differenza tra la trascrizione di pufW e l'incorporazione della proteina W nel complesso RC-LH1 è fonte di confusione e potrebbe riflettere la complessa regolazione della proteina.
In RC-LH114-W, 6 molecole di cardiolipina (CDL), 7 di fosfatidilcolina (POPC), 1 di fosfatidilglicerolo (POPG) e 29 di β-DDM sono allocate e modellate in esso 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG e 12 βDDM. RC-LH116 (Figura 5, A e B). In queste due strutture, la CDL è quasi localizzata sul lato citoplasmatico del complesso, mentre POPC, POPG e β-DDM sono per lo più localizzati sul lato luminale. Due molecole di lipidi e detergenti sono state isolate nella regione αβ-1 a αβ-6 del complesso RC-LH114-W (Figura 5A), e cinque sono state isolate nella regione equivalente di RC-LH116 (Figura 5B). Sono stati trovati più lipidi sull'altro lato del complesso, principalmente CDL, accumulati tra RC e αβ-7 a αβ-13 (Figura 5, A e B). Altri lipidi e detergenti strutturalmente risolti si trovano all'esterno dell'anello LH1 e catene aciliche ben risolte si estendono tra le subunità LH1, provvisoriamente designate come β-DDM in RC-LH114-W e definite come β-DDM in RC Una miscela di β-DDM e POPC-LH116. Le posizioni simili dei lipidi chelanti e dei detergenti nella nostra struttura indicano che sono siti di legame fisiologicamente rilevanti (Figura S12A). Anche le posizioni delle molecole equivalenti in Tch hanno una buona coerenza. Gentle e Trv. Il ceppo 970 RC-LH1s (Figura S12, da B a E) (9, 12) e i residui di legame idrogeno del gruppo della testa lipidica hanno mostrato una conservazione abbastanza buona nell'allineamento della sequenza (Figura S13), indicando che CDL conservato che si lega a RC (24), questi siti possono essere conservati nel complesso RC-LH1.
(A e B) I peptidi RC-LH114-W (A) e RC-LH116 (B) sono rappresentati da cartoni animati e i pigmenti da bastoncini, utilizzando lo schema di colori della Figura 1. I lipidi sono mostrati in rosso e i detergenti in grigio. L'UQ legato ai siti RC QA e QB è giallo, mentre l'UQ isolato è blu. (C e D) Le stesse viste di (A) e (B), con i lipidi omessi. (E-G) Vista ingrandita di Q1(E), Q2(F) e Q3(G) da RC-LH116, con catene laterali che si influenzano reciprocamente. I legami idrogeno sono mostrati come linee tratteggiate nere.
In RC-LH116, sia RC QA che QB UQ, che partecipano al trasferimento di elettroni nel processo di separazione di carica, sono decomposti nei loro siti di legame. Tuttavia, in RC-LH114-W, il chinone QB non è stato risolto e verrà discusso in dettaglio di seguito. Oltre ai chinoni QA e QB, due molecole di UQ chelate (situate tra gli anelli RC e LH1) sono allocate nella struttura di RC-LH114-W in base ai loro gruppi di testa ben risolti (situati rispettivamente in Q1 e Q2). Figura 5C). Due unità di isoprene sono assegnate a Q1 e la mappa di densità risolve le 10 code di isoprene complete di Q2. Nella struttura di RC-LH116, sono state risolte tre molecole di UQ10 chelate (da Q1 a Q3, Figura 5D) e tutte le molecole hanno una densità chiara lungo tutta la coda (Figura 5, da D a G). Nelle due strutture, le posizioni dei gruppi terminali chinonici di Q1 e Q2 presentano un'eccellente coerenza (Figura S12F) e interagiscono solo con RC. Q1 si trova all'ingresso del gap W di RC-LH114-W (Figura 1G e 5, C, D ed E), e Q2 si trova vicino al sito di legame QB (Figura 5, C, D ed F). I residui conservati L-Trp143 e L-Trp269 sono molto vicini a Q1 e Q2 e forniscono potenziali interazioni di π-stacking (Figura 5, E ed F, e Figura S12). L-Gln88, a 3,0 Å dall'ossigeno distale di Q1, fornisce un forte legame idrogeno (Figura 5E); questo residuo è conservato in tutti gli RC tranne che in quello più distante (Figura S13). L-Ser91 è sostituito in modo conservativo con Thr nella maggior parte degli altri RC (Figura S13), si trova a 3,8 Angstrom dall'ossigeno metilico di Q1 e può fornire deboli legami idrogeno (Figura 5E). Q3 non sembra avere un'interazione specifica, ma è situato nella regione idrofobica tra la subunità RC-M e la subunità LH1-α da 5 a 6 (Figura 5, D e G). Q1, Q2 e Q3 o chinoni chelati vicini sono stati risolti anche in Tch. Gentle, Trv. Strain 970 e Blc. La struttura dell'iride (9, 10, 12) indica un sito di legame per il chinone ausiliario conservato nel complesso RC-LH1 (Figura S12G). I cinque UQ decomposti in RC-LH116 sono in buon accordo con il 5,8±0,7 di ciascun complesso determinato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), mentre i tre UQ decomposti in RC-LH114-W sono inferiori al valore misurato di 6,2±0,3 (Fig. S14) indica che ci sono molecole di UQ non risolte nella struttura.
I polipeptidi pseudo-simmetrici L e M contengono ciascuno cinque TMH e formano un eterodimero che combina un dimero di BChl, due monomeri di BChl, due monomeri di batteriofago (BPh) e un ferro non eme e una o due molecole di UQ10. Grazie alla presenza di legami idrogeno sul gruppo chetonico terminale e al suo noto accumulo in Rps, i carotenoidi vengono incorporati nella subunità M, che è chiamata cis-3,4-deidroorodopina. Specie (25). Il dominio della membrana esterna di RC-H è ancorato alla membrana da un singolo TMH. La struttura RC complessiva è simile alla RC a tre subunità di specie correlate (come Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). I macrocicli di BChl e BPh, lo scheletro carotenoide e il ferro non eme si sovrappongono entro l'intervallo di risoluzione di queste strutture, così come il gruppo di testa UQ10 nel sito QA e il chinone QB in RC-LH116 (Figura S15).
La disponibilità di due strutture RC con diverse velocità di occupazione del sito QB offre una nuova opportunità per esaminare i cambiamenti conformazionali coerenti che accompagnano il legame del chinone QB. Nel complesso RC-LH116, il chinone QB si trova nella posizione "prossimale" completamente legata (26), ma la separazione di RC-LH114-W non presenta il chinone QB. Non c'è chinone QB in RC-LH114-W, il che è sorprendente perché il complesso è attivo, più del complesso RC-LH116 con chinone QB strutturalmente risolto. Sebbene i due anelli LH1 chelino circa sei chinoni, cinque sono strutturalmente risolti nell'anello chiuso RC-LH116, mentre solo tre sono strutturalmente limitati nell'anello aperto RC-LH114-W. Questo aumento del disordine strutturale può riflettere la sostituzione più rapida dei siti QB di RC-LH114-W, la cinetica più rapida del chinone nel complesso e la maggiore probabilità di attraversare l'ansa LH1. Suggeriamo che la mancanza di UQ nel sito RC QB di RC-LH114-W possa essere il risultato di un complesso più complesso e più attivo, e che il sito QB di RC-LH114-W sia stato immediatamente bloccato nel turnover di UQ. La fase specifica (l'ingresso al sito QB è stato chiuso) riflette la conformazione di questa attività.
Senza QB, la rotazione concomitante di L-Phe217 in una posizione incompatibile con il legame UQ10, poiché causerà una collisione spaziale con la prima unità isoprenica della coda (Figura 6A). Inoltre, sono evidenti i principali cambiamenti conformazionali, in particolare l'elica de (breve elica nell'ansa tra TMH D ed E) dove L-Phe217 è spostata nella tasca di legame QB e la rotazione di L-Tyr223 (Figura 6A) per rompere il legame idrogeno con lo scheletro M-Asp45 e chiudere l'ingresso del sito di legame QB (Figura 6B). L'elica de ruota sulla sua base, il Cα di L-Ser209 è spostato di 0,33 Å, mentre L-Val221Cα è spostato di 3,52 Å. Non ci sono cambiamenti osservabili in TMH D ed E, che sono sovrapponibili in entrambe le strutture (Figura 6A). Per quanto ne sappiamo, questa è la prima struttura nel centro di reazione naturale che chiude il sito QB. Un confronto con la struttura completa (legata a QB) mostra che prima che il chinone venga ridotto, è necessario un cambiamento conformazionale per farlo entrare nel chinone. L-Phe217 ruota per formare un'interazione di π-stacking con il gruppo di testa del chinone e l'elica si sposta verso l'esterno, consentendo allo scheletro di L-Gly222 e alla catena laterale di L-Tyr223 di formare una rete di legami idrogeno con una struttura di legame idrogeno stabile (Figura 6, A e C).
(A) Rappresentazione a cartone animato sovrapposta dell'ologramma (catena L, arancione/catena M, magenta) e della struttura apo (grigia), in cui i residui chiave sono visualizzati sotto forma di rappresentazione a bastoncino. UQ10 è rappresentato da una barra gialla. La linea tratteggiata indica i legami idrogeno formati nell'intera struttura. (B e C) Rappresentazione di superficie dell'apolipoproteina e dell'intera struttura ad anello, evidenziando rispettivamente l'ossigeno della catena laterale di L-Phe217 in blu e L-Tyr223 in rosso. La subunità L è arancione; le subunità M e H non sono colorate. (D e E) Siti RC QB dell'apolipoproteina (D) e dell'intera (E) [colorati rispettivamente da (A)] e PSII di Thermophilus thermophilus (verde, blu con chinone plastico; ID PDB: 3WU2) Allinea (58).
Inaspettatamente, sebbene siano disponibili diverse strutture di RC carenti di QB senza LH1, i cambiamenti conformazionali osservati in questo studio non sono stati precedentemente riportati. Questi includono la struttura di deplezione di QB da Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) e Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), tutte quasi identiche alla loro struttura QB complessiva. Un'attenta ispezione di 3PRC ha rivelato che le molecole del detergente LDAO (ossido di lauril dimetilammina) si legano all'ingresso della posizione QB, il che potrebbe impedire il riarrangiamento in una conformazione chiusa. Sebbene LDAO non si decomponga nella stessa posizione in 1EYS o 1OGV, questi RC sono preparati utilizzando lo stesso detergente e quindi potrebbero produrre lo stesso effetto. La struttura cristallina di Rba. Anche il centro di reazione RC di Sphaeroides co-cristallizzato con il citocromo c2 (PDB ID: 1L9B) sembra avere un sito QB chiuso. Tuttavia, in questo caso, la regione N-terminale del polipeptide RC-M (che interagisce con il sito di legame QB attraverso il legame H del residuo Tyr sull'elica Q) adotta una conformazione innaturale e il cambiamento conformazionale di QB non viene ulteriormente esplorato (30). Ciò che è rassicurante è che non abbiamo visto questo tipo di deformazione del polipeptide M nella struttura RC-LH114-W, che è quasi la stessa della regione N-terminale del centro di reazione RC-LH116. Va anche notato che dopo l'eliminazione dell'antenna LH1 a base di detergente, i centri di reazione RC dell'apolipoproteina nel PDB sono stati risolti, il che ha eliminato i pool interni di chinoni e lipidi nello spazio tra il centro di reazione e la superficie interna dell'anello LH1 circostante (31, 32). Il RC rimane funzionale perché conserva tutti i cofattori, ad eccezione del chinone QB decomponibile, che è meno stabile e spesso viene perso durante il processo di preparazione (33). Inoltre, è noto che la rimozione di LH1 e dei lipidi ciclici naturali dal RC può avere un impatto sulle funzioni, come la durata ridotta dello stato P+QB-a carica separata (31, 34, 35). Pertanto, ipotizziamo che l'esistenza dell'anello LH1 locale che circonda il RC possa mantenere il sito QB "chiuso", preservando così l'ambiente locale vicino al QB.
Sebbene l'apolipoproteina (senza chinone QB) e la struttura completa rappresentino solo due istantanee del turnover del sito QB, piuttosto che una serie di eventi, vi sono indicazioni che il legame possa essere controllato per impedire il rilegame da parte dell'idrochinone per inibire l'inibizione del substrato. L'interazione del chinololo e del chinone vicino al sito QB dell'apolipoproteina potrebbe essere diversa, il che porta al suo rigetto da parte del RC. È stato a lungo proposto che i cambiamenti conformazionali svolgano un ruolo nel legame e nella riduzione dei chinoni. La capacità dei RC congelati di ridurre i chinoni dopo l'adattamento al buio è compromessa (36); la cristallografia a raggi X mostra che questo danno è dovuto al fatto che i chinoni QB sono intrappolati in una conformazione "distale" a circa 4,5 Å dalla posizione prossimale attiva (26), 37). Suggeriamo che questa conformazione di legame distale sia un'istantanea dello stato intermedio tra l'apolipoproteina e la struttura ad anello completa, che segue l'interazione iniziale con il chinone e l'apertura del sito QB.
Il tipo II RC presente nel complesso PSII di alcuni batteri e cianobatteri fototrofi, alghe e piante ha una conservazione strutturale e funzionale (38). L'allineamento strutturale mostrato nella Figura 6 (D ed E) sottolinea la somiglianza tra i PSII RC e il sito QB del complesso RC batterico. Questo confronto è stato a lungo un modello per lo studio dei sistemi strettamente correlati di legame e riduzione del chinone. Precedenti pubblicazioni hanno suggerito che i cambiamenti conformazionali sono accompagnati dalla riduzione dei chinoni da parte del PSII (39, 40). Pertanto, considerando la conservazione evolutiva del RC, questo meccanismo di legame precedentemente non osservato potrebbe essere applicabile anche al sito QB del PSII RC nelle piante fototrofe ossigenate.
I ceppi Rps ΔpufW (delezione pufW non marcata) e PufW-His (proteina-W con tag 10x His C-terminale espressa dal locus pufW naturale). palustris CGA009 è stato descritto nel nostro precedente lavoro (16). Questi ceppi e il genitore isogenico di tipo selvatico sono stati recuperati dal congelatore mediante strisciatura di un piccolo numero di cellule su piastra di agar PYE (5 g litro -1 ciascuno) (conservato in LB a -80 °C, contenente 50% (p/v) glicerolo) proteina, estratto di lievito e succinato) [1,5% (p/v)]. La piastra è stata incubata per una notte al buio a temperatura ambiente in condizioni anaerobiche, quindi illuminata con luce bianca (~50 μmolm-2 s-1) fornita da lampadine alogene OSRAM 116-W (RS Components, Regno Unito) per 3-5 giorni fino alla comparsa di una singola colonia. Una singola colonia è stata utilizzata per inoculare 10 ml di terreno M22+ (41) supplementato con lo 0,1% (p/v) di amminoacidi di casamina (di seguito denominato M22). La coltura è stata fatta crescere in condizioni di basso ossigeno al buio a 34 °C con agitazione a 180 rpm per 48 ore, e quindi 70 ml della coltura sono stati inoculati nelle stesse condizioni per 24 ore. Una coltura semi-aerobica con un volume di 1 ml è stata utilizzata per inoculare 30 ml di terreno M22 in una bottiglia di vetro trasparente universale con tappo a vite da 30 ml e irradiata con agitazione (~50 μmol m-2 s-1) per 48 ore mediante un'asta di agitazione magnetica sterile. Quindi 30 ml della coltura sono stati inoculati con circa 1 litro di coltura nelle stesse condizioni, che è stato poi utilizzato per inoculare circa 9 litri di coltura illuminata a ~200 μmol m-2 s-1 per 72 ore. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 7132 RCF per 30 minuti, risospese in circa 10 ml di Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e conservate a -20 °C fino al momento dell'utilizzo.
Dopo lo scongelamento, aggiungere alle cellule risospese alcuni cristalli di deossiribonucleasi I (Merck, Regno Unito), lisozima (Merck, Regno Unito) e due compresse di inibitore della proteasi oloenzimatica Roche (Merck, Regno Unito). In una pressa francese da 20.000 psi (Aminco, USA), le cellule sono state lisate da 8 a 12 volte. Dopo aver rimosso le cellule intatte e i detriti insolubili mediante centrifugazione a 18.500 RCF per 15 minuti a 4°C, la membrana è stata precipitata dal lisato pigmentato mediante centrifugazione a 113.000 RCF per 2 ore a 43.000°C. Scartare la frazione solubile e risospendere la membrana colorata in 100-200 ml di Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e omogeneizzare fino a completa scomparsa degli aggregati visibili. La membrana in sospensione è stata incubata in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) contenente il 2% (p/v) di β-DDM per 1 ora al buio a 4°C sotto delicata agitazione. Successivamente, è stata centrifugata a 70°C per sciogliere 150.000 RCF a 4°C per 1 ora per rimuovere i residui insolubili.
La membrana solubilizzante del ceppo ΔpufW è stata applicata a una colonna a scambio ionico DEAE Sepharose da 50 ml con tre volumi di colonna (CV) di tampone di legame [20 mM tris-HCl (pH 8,0) contenente 0,03% (p/v) β-DDM]. Lavare la colonna con due CV di tampone di legame, quindi lavarla nuovamente con due tamponi di legame contenenti 50 mM NaCl. Il complesso RC-LH116 è stato eluito con un gradiente lineare da 150 a 300 mM NaCl (in tampone di legame) su 1,75 CV, e il complesso di legame rimanente è stato eluito con un tampone di legame contenente 300 mM NaCl su 0,5 CV. Raccogliere lo spettro di assorbimento tra 250 e 1000 nm, conservare la frazione con rapporto di assorbanza (A880/A280) maggiore di 1 tra 880 e 280 nm, diluirla due volte nel tampone di legame e ripetere la stessa procedura sulla colonna DEAE per la purificazione. Diluire le frazioni con rapporti A880/A280 superiori a 1,7 e rapporti A880/A805 superiori a 3,0, eseguire un terzo ciclo di scambio ionico e conservare le frazioni con rapporti A880/A280 superiori a 2,2 e rapporti A880/A805 superiori a 5,0. Il complesso parzialmente purificato è stato concentrato a circa 2 ml in un filtro centrifugo Amicon con cut-off di peso molecolare (MWCO) di 100.000 (Merck, Regno Unito) e caricato su una colonna di esclusione dimensionale Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, Stati Uniti) contenente tampone NaCl 200 mM, quindi eluito nello stesso tampone a 1,5 CV. Raccogliere gli spettri di assorbimento della frazione di esclusione dimensionale e concentrare gli spettri di assorbimento con rapporti A880/A280 superiori a 2,4 e rapporti A880/A805 superiori a 5,8 a 100 A880 e utilizzarli immediatamente per la preparazione della griglia per crio-TEM o per la conservazione. Conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.
La membrana solubilizzante del ceppo PufW-His è stata applicata a una colonna HisPrep FF Ni-NTA Sepharose da 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) contenente 200 mM NaCl e 0.03% (p/p)) in tampone IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. La colonna è stata lavata con cinque CV di tampone IMAC e poi con cinque CV di tampone IMAC contenente 10 mM di istidina. Il complesso centrale è stato eluito dalla colonna con cinque tamponi IMAC contenenti 100 mM di istidina. La frazione contenente il complesso RC-LH114-W viene concentrata a circa 10 ml in un serbatoio agitato dotato di un filtro Amicon 100.000 MWCO (Merck, Regno Unito), diluita 20 volte con tampone di legame e quindi aggiunta a 25 ml Nella colonna DEAE Sepharose, quattro CV legati al tampone vengono utilizzati in anticipo. Lavare la colonna con quattro tamponi di legame CV, quindi eluire il complesso su otto CV su un gradiente lineare da 0 a 100 mM NaCl (in tampone di legame) e i restanti quattro CV contenenti 100 mM di tampone di legame. I complessi residui eluiti sul cloruro di sodio combinato con il rapporto A880/A280 superiore a 2,4 e il rapporto A880/A805 superiore a 4,6 frazioni sono stati concentrati a ~2 ml in un filtro centrifugo Amicon 100.000 MWCO e riempiti con 1,5 CV IMAC in anticipo Colonna di esclusione dimensionale Superdex 200 16/600 equilibrata con tampone e quindi eluita nello stesso tampone su 1,5 CV. Raccogli gli spettri di assorbimento delle frazioni di esclusione dimensionale e concentra gli spettri di assorbimento con rapporti A880/A280 superiori a 2,1 e rapporti A880/A805 superiori a 4,6 a 100 A880, che vengono utilizzati immediatamente per la preparazione di griglie TEM congelate o conservati a -80 °C fino al momento dell'uso.
Per la preparazione delle griglie TEM a bassa temperatura è stato utilizzato un congelatore a immersione Leica EM GP. Il complesso è stato diluito in tampone IMAC fino a raggiungere un'assorbanza di 50 A880, quindi 5 μl sono stati caricati su una griglia di rame rivestita di carbonio QUANTIFOIL 1.2/1.3 (Agar Scientific, Regno Unito) appena trattata con scarica a bagliore. La griglia è stata incubata a 20 °C e 60% di umidità relativa per 30 secondi, quindi asciugata tamponandola per 3 secondi e infine raffreddata rapidamente in etano liquido a -176 °C.
I dati del complesso RC-LH114-W sono stati registrati presso l'eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) con un microscopio Titan Krios, che opera a una tensione di accelerazione di 300 kV, con un ingrandimento nominale di 130.000× e un gap energetico di 20 eV. Per la registrazione delle immagini in modalità di conteggio è stato utilizzato un Gatan 968 GIF Quantum con rivelatore di picco K2. La dimensione del pixel calibrato è di 1,048 Å e il tasso di dose è di 3,83 e-Å-2s-1. Il filmato è stato raccolto in 11 secondi e diviso in 40 parti. Utilizzando l'area rivestita di carbonio per rifocalizzare il microscopio, sono stati raccolti tre filmati per foro. In totale sono stati raccolti 3130 filmati, con valori di defocus compresi tra -1 e -3 μm.
I dati relativi al complesso RC-LH116 sono stati raccolti utilizzando lo stesso microscopio presso l'Asterbury Biostructure Laboratory (Università di Leeds, Regno Unito). I dati sono stati raccolti in modalità di conteggio con un ingrandimento di 130k e la dimensione del pixel è stata calibrata a 1,065 Å con una dose di 4,6 e-Å-2s-1. Il filmato è stato registrato in 12 secondi e suddiviso in 48 parti. In totale, sono stati raccolti 3359 filmati, con valori di defocus compresi tra -1 e -3 μm.
Tutta l'elaborazione dei dati viene eseguita nella pipeline Relion 3.0 (42). Utilizzare Motioncorr 2 (43) per correggere il movimento del fascio mediante ponderazione della dose, e quindi utilizzare CTFFIND 4.1 (44) per determinare il parametro CTF (funzione di trasferimento del contrasto). Le tipiche microfotografie dopo queste fasi di elaborazione iniziali sono mostrate nella Figura 2. S16. Il modello di selezione automatica viene generato selezionando manualmente circa 250 pixel di 1000 particelle in un frame di 250 pixel e nessuna classificazione bidimensionale (2D) di riferimento, rifiutando così quelle classificazioni che presentano contaminazione del campione o non hanno caratteristiche discernibili. Quindi, la selezione automatica è stata eseguita su tutte le microfotografie, e RC-LH114-W era composto da 849.359 particelle e il complesso RC-LH116 da 476.547 particelle. Tutte le particelle selezionate sono state sottoposte a due cicli di classificazione 2D non di riferimento e, dopo ogni esecuzione, le particelle che corrispondono all'area del carbonio, alla contaminazione del campione, all'assenza di caratteristiche evidenti o alle particelle fortemente sovrapposte vengono scartate, risultando in 772.033 (90,9%) e 359.678 (75,5%) particelle utilizzate per la classificazione 3D di RC-LH114-W e RC-LH116 rispettivamente. Il modello di riferimento 3D iniziale è stato generato utilizzando il metodo di discesa del gradiente stocastico. Utilizzando il modello iniziale come riferimento, le particelle selezionate vengono classificate in quattro categorie in 3D. Utilizzando il modello in questa categoria come riferimento, si esegue il raffinamento 3D sulle particelle nella categoria più grande, quindi si utilizza il filtro passa-basso iniziale di 15 Å per coprire l'area del solvente, si aggiungono 6 pixel di bordi morbidi e si post-elaborano i pixel per correggere la funzione di trasferimento di modulazione del picco Gatan K2 del rivelatore superiore. Per il dataset RC-LH114-W, questo modello iniziale è stato modificato rimuovendo la forte densità ai bordi della maschera (disconnessa dalla densità del complesso centrale in UCSF Chimera). I modelli risultanti (le risoluzioni di RC-LH114-W e RC-LH116 sono rispettivamente di 3,91 e 4,16 Å) sono utilizzati come riferimento per il secondo ciclo di classificazione 3D. Le particelle utilizzate sono raggruppate nella classe 3D iniziale e non contengono una forte correlazione con il vicinato. Sovrapposizione o mancanza di caratteristiche strutturali evidenti. Dopo il secondo ciclo di classificazione 3D, è stata selezionata la categoria con la risoluzione più alta [Per RC-LH114-W, una categoria è di 377.703 particelle (44,5%), per RC-LH116, ci sono due categorie, per un totale di 260.752 particelle (54,7%), dove sono uguali solo quando allineate dopo la rotazione iniziale con una piccola differenza]. Le particelle selezionate vengono riestratte in una scatola di 400 pixel e raffinate mediante raffinamento 3D. La maschera del solvente viene generata utilizzando il filtro passa-basso iniziale di 15 Å, l'espansione della mappa di 3 pixel e la maschera morbida di 3 pixel. Utilizzando il raffinamento CTF per particella, la correzione del movimento per particella e il secondo ciclo di raffinamento CTF per particella, il raffinamento 3D, la maschera del solvente e la post-elaborazione vengono eseguiti dopo ogni passaggio per affinare ulteriormente la texture risultante. Utilizzando il valore di cut-off FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) di 0,143, le risoluzioni dei modelli finali di RC-LH114-W e RC-LH116 sono rispettivamente di 2,65 e 2,80 Å. La curva FSC del modello finale è mostrata nella Figura 2. S17.
Tutte le sequenze proteiche sono scaricate da UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) è stato utilizzato per costruire un modello di omologia di RC, che contiene le sequenze proteiche di RC-L, RC-M e RC-H e la struttura cristallina di Rba. sphaeroides RC è stata utilizzata come modello (PDB ID: 5LSE) (46). Utilizzare lo strumento “fit map” in UCSF Chimera per adattare il modello generato alla mappa (47), migliorare la struttura proteica e aggiungere il cofattore [4×BChl a (nome residuo della libreria di monomeri = BCL), 2×BPh a (BPH), uno o due tipi di UQ10 (U10), un ferro non eme (Fe) e una 3,4-diidroesacarbonilcolina (QAK)] utilizzando Coot (48). Poiché QAK non è disponibile nella libreria di monomeri, è stato parametrizzato utilizzando lo strumento eLBOW in PHENIX (49).
Successivamente, è stata costruita la subunità LH1. Inizialmente, è stato utilizzato lo strumento di costruzione automatica in PHENIX (49) per costruire automaticamente parte della sequenza LH1 utilizzando la mappa e le sequenze proteiche LH1-α e LH1-β come input. Selezionare la subunità LH1 più completa, estrarla e caricarla in Coot, aggiungere manualmente la sequenza mancante e affinare manualmente l'intera struttura prima di aggiungere due BCls a (BCL) e una spirilloxantina (CRT) [secondo la densità Rps rilevante del complesso LH1 e il contenuto di carotenoidi noto. Specie (17)]. Copiare la subunità LH1 completa e utilizzare lo strumento "Docking Map Tool" di UCSF Chimera per agganciarla nell'area non modello adiacente della densità LH1 e quindi affinarla in Coot; ripetere il processo fino a quando tutte le subunità LH1 non sono state modellate. Per la struttura RC-LH114-W, estraendo la densità non allocata in Coot, la proteina viene segmentata dai componenti non proteici rimanenti nella mappa USCF Chimera e lo strumento Autobuild viene utilizzato per stabilire il modello iniziale e le subunità rimanenti (proteina-W) Modellazione. In PHENIX (49). Aggiungere eventuali sequenze mancanti al modello risultante in Coot (48), quindi affinare manualmente l'intera subunità. La densità non allocata rimanente si adatta alla combinazione di lipidi (ID della libreria di monomeri PDB di CDL = CDL, POPC = 6PL e POPG = PGT), detergente β-DDM (LMT) e molecole UQ10 (U10). Utilizzare l'ottimizzazione PHENIX (49) e l'ottimizzazione manuale in Coot (48) per perfezionare il modello iniziale completo fino a quando le statistiche del modello e la qualità visiva dell'adattamento non possono essere ulteriormente migliorate. Infine, utilizzare LocScale (50) per affinare la mappa locale, quindi eseguire diversi altri cicli di modellazione della densità non allocata e di ottimizzazione automatica e manuale.
I rispettivi peptidi, cofattori e altri lipidi e chinoni ancorati all'interno delle rispettive densità sono mostrati nelle Figure 1 e 2. Da S18 a S23. Le informazioni statistiche del modello finale sono mostrate nella Tabella S1.
Salvo diversa indicazione, gli spettri di assorbimento UV/Vis/NIR sono stati acquisiti con uno spettrofotometro Cary60 (Agilent, USA) a intervalli di 1 nm da 250 nm a 1000 nm e con un tempo di integrazione di 0,1 s.
Diluire il campione in una cuvetta di quarzo con un percorso ottico di 2 mm fino ad A880 pari a 1 e raccogliere lo spettro di assorbimento tra 400 e 1000 nm. Gli spettri dicroici circolari sono stati raccolti su uno spettropolarimetro Jasco 810 (Jasco, Giappone) a intervalli di 1 nm tra 400 nm e 950 nm con una velocità di scansione di 20 nm min-1.
Il coefficiente di estinzione molare viene determinato diluendo il complesso centrale fino a un A880 di circa 50. Diluire il volume di 10 μl in 990 μl di tampone di legame o metanolo e raccogliere immediatamente lo spettro di assorbimento per minimizzare la degradazione della BChl. Il contenuto di BChl di ciascun campione di metanolo è stato calcolato dal coefficiente di estinzione a 771 nm di 54,8 mM-1 cm-1 e il coefficiente di estinzione è stato determinato (51). Dividere la concentrazione di BChl misurata per 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) per determinare la concentrazione del complesso centrale, che viene quindi utilizzata per determinare lo spettro di assorbimento dello stesso campione raccolto nel tampone Coefficiente di estinzione. parallelo. Sono state effettuate tre misurazioni ripetute per ciascun campione e l'assorbanza media del BChl Qy massimo è stata utilizzata per il calcolo. Il coefficiente di estinzione di RC-LH114-W misurato a 878 nm è 3280±140 mM-1 cm-1, mentre il coefficiente di estinzione di RC-LH116 misurato a 880 nm è 3800±30 mM-1 cm-1.
L'UQ10 è stato quantificato secondo il metodo in (52). In breve, è stata eseguita un'HPLC in fase inversa (RP-HPLC) utilizzando il sistema Agilent 1200 HPLC. Sciogliere circa 0,02 nmol di RC-LH116 o RC-LH114-W in 50 μl di metanolo:cloroformio 50:50 contenente cloruro ferrico allo 0,02% (p/v) e iniettare la colonna pre-equilibrata Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm. Sciogliere in 1 ml-1 min-1 a 40 °C in solvente HPLC (metanolo:2-propanolo 80:20) su una colonna ×25 cm. Eseguire un'eluizione isocratica in un solvente HPLC per monitorare l'assorbanza a 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoidi) e 780 nm (BChl) per 1 ora. Il picco nel cromatogramma a 275 nm a 25,5 minuti è stato integrato e non conteneva altri composti rilevabili. L'area integrata viene utilizzata per calcolare la quantità molare di UQ10 estratta con riferimento alla curva di calibrazione calcolata dall'iniezione di standard puri da 0 a 5,8 nmol (Figura S14). Ogni campione è stato analizzato in triplice copia e l'errore riportato corrisponde alla deviazione standard della media.
È stata preparata una soluzione contenente il complesso RC-LH1 con un assorbimento Qy massimo di 0,1 con 30 μM di citocromo c2 di cuore di cavallo ridotto (Merck, Regno Unito) e da 0 a 50 μMUQ2 (Merck, Regno Unito). Sono stati preparati tre campioni da 1 ml per ciascuna concentrazione di UQ2 e incubati per una notte al buio a 4 °C per garantire il completo adattamento al buio prima della misurazione. La soluzione è stata caricata in uno spettrofotometro modulare OLIS RSM1000 dotato di un reticolo di diffrazione a fiamma da 300 nm/500 linee, fenditure di ingresso da 1,24 mm, intermedie da 0,12 mm e di uscita da 0,6 mm. Un filtro passa-alto da 600 nm è stato posizionato all'ingresso del fototubo del campione e del tubo fotomoltiplicatore di riferimento per escludere la luce di eccitazione. L'assorbanza è stata monitorata a 550 nm con un tempo di integrazione di 0,15 s. La luce di eccitazione viene emessa dal LED M880F2 (diodo a emissione di luce) da 880 nm (Thorlabs Ltd., Regno Unito) attraverso un cavo in fibra ottica con un'intensità del 90% tramite un controller DC2200 (Thorlabs Ltd., Regno Unito) e viene emessa verso la sorgente luminosa con un angolo di 90°. Il fascio di misurazione è opposto allo specchio per riflettere la luce che non è stata inizialmente assorbita dal campione. Monitorare l'assorbanza 10 s prima dell'illuminazione di 50 s. Successivamente, l'assorbanza è stata ulteriormente monitorata per 60 s al buio per valutare in che misura il chinololo riduce spontaneamente il citocromo c23+ (vedere la Figura S8 per i dati grezzi).
I dati sono stati elaborati adattando una velocità iniziale lineare tra 0,5 e 10 s (a seconda della concentrazione di UQ2) e calcolando la media delle velocità di tutti e tre i campioni per ciascuna concentrazione di UQ2. La concentrazione di RC-LH1, calcolata tramite il rispettivo coefficiente di estinzione, è stata utilizzata per convertire la velocità in efficienza catalitica, rappresentata graficamente in Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) e adattata al modello di Michaelis-Menten per determinare i valori apparenti di Km e Kcat.
Per le misurazioni di assorbimento transitorio, il campione RC-LH1 è stato diluito a circa 2 μM in tampone IMAC contenente 50 mM di ascorbato di sodio (Merck, USA) e 0,4 mM di terbutina (Merck, USA). L'acido ascorbico viene utilizzato come donatore di elettroni sacrificale e il tert-butaclofene come inibitore di QB per garantire che il principale donatore RC rimanga ridotto (cioè non fotoossidato) durante l'intero processo di misurazione. Circa 3 ml di campione vengono aggiunti a una cella rotante personalizzata (circa 0,1 m di diametro, 350 RPM) con un percorso ottico di 2 mm per garantire che il campione nel percorso laser abbia tempo sufficiente per l'adattamento al buio tra gli impulsi di eccitazione. Utilizzare impulsi laser di circa 100 fs per amplificare il sistema laser Ti: Zaffiro (Spectra Physics, USA) ed eccitare il campione a 880 nm con una frequenza di ripetizione di 1 kHz (20 nJ per NIR o 100 nJ per Vis). Prima di acquisire i dati, esporre il campione alla luce di eccitazione per circa 30 minuti. L'esposizione causerà l'inattivazione del QA (possibilmente riducendo il QA una o due volte). Si noti tuttavia che questo processo è reversibile perché, dopo un lungo periodo di adattamento al buio, il RC tornerà lentamente all'attività del QA. Uno spettrometro Helios (Ultrafast Systems, USA) è stato utilizzato per misurare gli spettri transitori con un tempo di ritardo da -10 a 7000 ps. Utilizzare il software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) per separare i set di dati, quindi unirli e standardizzarli. Utilizzare il pacchetto software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) per utilizzare il set di dati combinato al fine di ottenere spettri differenziali relativi al decadimento, oppure utilizzare una funzione che convolve più esponenti con la risposta dello strumento per adattare l'evoluzione spettrale a singola lunghezza d'onda in Origin (OriginLab, USA).
Come menzionato sopra (53), è stato preparato un film fotosintetico contenente il complesso LH1 privo sia del centro di reazione (RC) che dell'antenna periferica LH2. La membrana è stata diluita in 20 mM tris (pH 8,0) e quindi caricata in una cuvetta di quarzo con un percorso ottico di 2 mm. Un impulso laser di 30 nJ è stato utilizzato per eccitare il campione a 540 nm con un tempo di ritardo da -10 a 7000 ps. Elaborare il set di dati come descritto per il campione Rps. pal.
La membrana è stata centrifugata a 150.000 RCF per 2 ore a 4°C, quindi la sua assorbanza a 880 nm è stata risospesa in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) e 200 mM NaCl. La membrana è stata sciolta agitando lentamente in 2% (p/v) β-DDM per 1 ora al buio a 4°C. Il campione è stato diluito in 100 mM trietilammonio carbonato (pH 8,0) (TEAB; Merck, Regno Unito) fino a una concentrazione proteica di 2,5 mg ml-1 (analisi Bio-Rad). L'ulteriore elaborazione è stata effettuata secondo il metodo precedentemente pubblicato (54), iniziando con la diluizione di 50 μg di proteina in un totale di 50 μl di TEAB contenente 1% (p/v) sodio laurato (Merck, Regno Unito). Dopo sonicazione per 60 s, è stato ridotto con 5 mM di tris(2-carbossietil)fosfina (Merck, Regno Unito) a 37°C per 30 minuti. Per l'S-alchilazione, incubare il campione con 10 mM di metil S-metiltiometansolfonato (Merck, Regno Unito) e aggiungerlo da una soluzione madre di isopropanolo 200 mM per 10 minuti a temperatura ambiente. La digestione proteolitica è stata effettuata aggiungendo 2 μg di miscela di tripsina/endoproteinasi Lys-C (Promega Regno Unito) e incubando a 37°C per 3 ore. Il tensioattivo laurato è stato estratto aggiungendo 50 μl di acetato di etile e 10 μl di acido trifluoroacetico (TFA; Thermo Fisher Scientific, Regno Unito) al 10% (v/v) di grado LC e agitando con vortex per 60 s. La separazione di fase è stata favorita dalla centrifugazione a 15.700 RCF per 5 minuti. Secondo il protocollo del produttore, è stata utilizzata una colonna di centrifugazione C18 (Thermo Fisher Scientific, Regno Unito) per aspirare e desalinizzare con cura la fase inferiore contenente il peptide. Dopo l'essiccazione mediante centrifugazione sotto vuoto, il campione è stato disciolto in TFA allo 0,5% e acetonitrile al 3%, e 500 ng sono stati analizzati mediante cromatografia RP a nanoflusso accoppiata a spettrometria di massa utilizzando i parametri di sistema precedentemente descritti.
Utilizzare MaxQuant v.1.5.3.30 (56) per l'identificazione e la quantificazione delle proteine ​​per cercare il database del proteoma di Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). I dati di proteomica della spettrometria di massa sono stati depositati nella ProteomeXchange Alliance tramite il repository partner PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) con l'identificativo del set di dati PXD020402.
Per l'analisi mediante RPLC accoppiata a spettrometria di massa con ionizzazione elettrospray, il complesso RC-LH1 è stato preparato da Rps di tipo selvatico. Utilizzando il metodo precedentemente pubblicato (16), la concentrazione proteica prodotta nelle cellule palustris era di 2 mg ml-1 in 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl e 0,03% (p/v) β- (analisi Bio-Rad) ) DDM. Secondo il protocollo del produttore, utilizzare il kit di purificazione 2D (GE Healthcare, USA) per estrarre 10 μg di proteina mediante metodo di precipitazione e sciogliere il precipitato in 20 μl di acido formico (FA) al 60% (v/v), acetonitrile al 20% (v/v) e acqua al 20% (v/v). Cinque microlitri sono stati analizzati mediante RPLC (Dionex RSLC) accoppiata a spettrometria di massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Utilizzare una colonna MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Regno Unito) per la separazione a 60 °C e 100 μl min⁻¹, con un gradiente dall'85% (v/v) di solvente A [soluzione acquosa di FA allo 0,1% (v/v) e TFA allo 0,02% (v/v)] all'85% (v/v) di solvente B [soluzione di FA allo 0,1% (v/v) e TFA allo 0,02% (v/v) in acetonitrile al 90% (v/v)]. Utilizzando una sorgente di ionizzazione elettrospray standard e parametri predefiniti per più di 60 minuti, lo spettrometro di massa ottiene un intervallo m/z (rapporto massa/carica) da 100 a 2750. Con l'aiuto dello strumento FindPept del portale di risorse bioinformatiche ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mappare lo spettro di massa alle subunità del complesso.
Le cellule sono state coltivate per 72 ore sotto 100 ml di luce NF-bassa (10μMm-2 s-1), media (30μMm-2 s-1) o alta (300μMm-2 s-1). Mezzo M22 (mezzo M22 in cui il solfato di ammonio è omesso e il succinato di sodio è sostituito dall'acetato di sodio) in una bottiglia con tappo a vite da 100 ml (23). In cinque cicli da 30 s, sono state aggiunte microsfere di vetro da 0,1 micron in un rapporto di volume di 1:1 per lisare le cellule e raffreddate su ghiaccio per 5 minuti. Il materiale insolubile, le cellule intatte e le microsfere di vetro sono state rimosse mediante centrifugazione a 16.000 RCF per 10 minuti in una microcentrifuga da banco. La membrana è stata separata in un rotore Ti 70.1 con 100.000 RCF in Tris-HCl 20 mM (pH 8.0) con un gradiente di saccarosio del 40/15% (p/p) per 10 ore.
Come descritto nel nostro lavoro precedente, immunorilevamento del tag His su PufW (16). In breve, il complesso centrale purificato (11,8 nM) o la membrana contenente la stessa concentrazione di RC (determinata dall'ossidazione sottraendo lo spettro di differenza ridotto e abbinando il carico sul gel colorato) in tampone di caricamento SDS 2x (Merck, Regno Unito) diluito due volte. Le proteine ​​sono state separate su un gel NuPage bis-tris al 12% replica (Thermo Fisher Scientific, Regno Unito). Un gel è stato colorato con Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Regno Unito) per caricare e visualizzare la subunità RC-L. La proteina sul secondo gel è stata trasferita su membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) attivata con metanolo (Thermo Fisher Scientific, Regno Unito) per l'immunodosaggio. La membrana PVDF è stata bloccata in 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 e 5% (p/v) latte scremato in polvere, e quindi incubata con l'anticorpo primario anti-His (in tampone anticorpale [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl e 0,05% (v/v) Tween-20] in 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) per 4 ore. Dopo 3 lavaggi di 5 minuti in tampone per anticorpi, la membrana è stata combinata con perossidasi di rafano (Sigma-Aldrich, Regno Unito) anticorpo secondario anti-topo (diluito 1:10.000 in tampone per anticorpi) Incubare per consentire il rilevamento (5 minuti dopo 3 lavaggi in tampone per anticorpi) utilizzando il substrato di chemiluminescenza WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) e Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Regno Unito).
Disegnando la distribuzione dell'intensità di ogni corsia del gel colorato o dell'immunodosaggio, integrando l'area sotto il picco e calcolando il rapporto di intensità di RC-L (gel colorato) e Proteina-W (immunodosaggio), in ImageJ (57) Elabora l'immagine. Questi rapporti sono stati convertiti in rapporti molari assumendo che il rapporto tra RC-L e proteina-W nel campione puro RC-LH114-W fosse 1:1 e normalizzando di conseguenza l'intero set di dati.
Per consultare il materiale supplementare relativo a questo articolo, visitare il sito http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
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La struttura ad alta risoluzione del complesso della trappola di luce 1 nel centro di reazione fornisce nuove informazioni sulla dinamica del chinone.
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