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La melammina è un contaminante alimentare riconosciuto, presente in alcune categorie di alimenti sia accidentalmente che intenzionalmente. Lo scopo di questo studio era verificare il rilevamento e la quantificazione della melammina nel latte artificiale e nel latte in polvere. Sono stati analizzati 40 campioni di alimenti disponibili in commercio, tra cui latte artificiale e latte in polvere, provenienti da diverse regioni dell'Iran. Il contenuto approssimativo di melammina nei campioni è stato determinato utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad alta prestazione con rivelazione ultravioletta (HPLC-UV). È stata costruita una curva di calibrazione (R2 = 0,9925) per il rilevamento della melammina nell'intervallo 0,1–1,2 μg mL−1. I limiti di quantificazione e di rilevamento erano rispettivamente di 1 μg mL−1 e 3 μg mL−1. La melamina è stata analizzata nel latte artificiale e nel latte in polvere e i risultati hanno mostrato che i livelli di melamina nei campioni di latte artificiale e latte in polvere erano rispettivamente compresi tra 0,001 e 0,095 mg kg⁻¹ e tra 0,001 e 0,004 mg kg⁻¹. Questi valori sono in linea con la legislazione europea e il Codex Alimentarius. È importante sottolineare che il consumo di questi prodotti lattiero-caseari a ridotto contenuto di melamina non rappresenta un rischio significativo per la salute dei consumatori. Ciò è confermato anche dai risultati della valutazione del rischio.
La melammina è un composto organico con formula molecolare C3H6N6, derivato dalla cianammide. Ha una bassissima solubilità in acqua ed è composta per circa il 66% da azoto. La melammina è un composto industriale ampiamente utilizzato con una vasta gamma di applicazioni legittime nella produzione di materie plastiche, fertilizzanti e attrezzature per la lavorazione degli alimenti (inclusi imballaggi alimentari e utensili da cucina)1,2. La melammina viene anche utilizzata come vettore di farmaci per il trattamento di diverse patologie. L'elevata percentuale di azoto nella melammina può portare a un uso improprio del composto e all'attribuzione di proprietà simili a quelle delle molecole proteiche agli ingredienti alimentari3,4. Pertanto, l'aggiunta di melammina ai prodotti alimentari, compresi i latticini, ne aumenta il contenuto di azoto. Di conseguenza, si è erroneamente concluso che il contenuto proteico del latte fosse superiore a quello reale.
Per ogni grammo di melammina aggiunto, il contenuto proteico degli alimenti aumenta dello 0,4%. Tuttavia, la melammina è altamente solubile in acqua e può causare danni più gravi. L'aggiunta di 1,3 grammi di melammina a prodotti liquidi come il latte può aumentarne il contenuto proteico del 30%5,6. Sebbene la melammina venga aggiunta agli alimenti di origine animale e persino umana per aumentarne il contenuto proteico7, la Commissione del Codex Alimentarius (CAC) e le autorità nazionali non l'hanno approvata come additivo alimentare e l'hanno classificata come pericolosa se ingerita, inalata o assorbita attraverso la pelle. Nel 2012, l'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha classificato la melammina come cancerogeno di Classe 2B perché può essere dannosa per la salute umana8. L'esposizione a lungo termine alla melammina può causare cancro o danni renali2. La melammina presente negli alimenti può complessarsi con l'acido cianurico formando cristalli gialli insolubili in acqua che possono causare danni ai tessuti renali e vescicali, nonché cancro delle vie urinarie e perdita di peso9,10. Può causare intossicazione alimentare acuta e, ad alte concentrazioni, la morte, soprattutto nei neonati e nei bambini piccoli.¹¹ L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha inoltre stabilito la dose giornaliera tollerabile (DGT) di melammina per gli esseri umani a 0,2 mg/kg di peso corporeo al giorno, sulla base delle linee guida CAC.¹² La Food and Drug Administration (FDA) statunitense ha fissato il livello massimo di residui di melammina a 1 mg/kg nel latte artificiale e a 2,5 mg/kg in altri alimenti.^2,7 Nel settembre 2008, è stato segnalato che diversi produttori nazionali di latte artificiale avevano aggiunto melammina al latte in polvere per aumentarne il contenuto proteico, provocando un'intossicazione da latte in polvere e scatenando un'epidemia nazionale di intossicazione da melammina che ha colpito più di 294.000 bambini e ne ha ricoverati in ospedale più di 50.000.¹³
L'allattamento al seno non è sempre possibile a causa di diversi fattori, come le difficoltà della vita urbana, le malattie della madre o del bambino, che portano all'utilizzo di latte artificiale per nutrire i neonati. Di conseguenza, sono sorte fabbriche che producono latte artificiale con una composizione il più possibile simile al latte materno¹⁴. Il latte artificiale venduto sul mercato è solitamente prodotto con latte vaccino e contiene una speciale miscela di grassi, proteine, carboidrati, vitamine, minerali e altri composti. Per essere simile al latte materno, il contenuto di proteine ​​e grassi del latte artificiale varia e, a seconda del tipo di latte, viene arricchito con composti come vitamine e minerali come il ferro¹⁵. Poiché i neonati sono un gruppo sensibile e sussiste il rischio di intossicazione, la sicurezza del consumo di latte in polvere è di vitale importanza per la salute. Dopo il caso di intossicazione da melamina tra i neonati cinesi, i paesi di tutto il mondo hanno prestato molta attenzione a questo problema e la sensibilità in questo ambito è aumentata. Pertanto, è particolarmente importante rafforzare il controllo sulla produzione di latte artificiale al fine di proteggere la salute dei neonati. Esistono vari metodi per rilevare la melammina negli alimenti, tra cui la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), l'elettroforesi, il metodo sensoriale, la spettrofotometria e il test immunoenzimatico antigene-anticorpo16. Nel 2007, la Food and Drug Administration (FDA) statunitense ha sviluppato e pubblicato un metodo HPLC per la determinazione della melammina e dell'acido cianurico negli alimenti, che è il metodo più efficace per determinare il contenuto di melammina17.
Le concentrazioni di melamina nel latte artificiale, misurate utilizzando una nuova tecnica di spettroscopia infrarossa, variavano da 0,33 a 0,96 milligrammi per chilogrammo (mg kg-1). 18 Uno studio condotto nello Sri Lanka ha rilevato livelli di melamina nel latte intero in polvere compresi tra 0,39 e 0,84 mg kg-1. Inoltre, i campioni di latte artificiale importato contenevano i livelli più elevati di melamina, rispettivamente pari a 0,96 e 0,94 mg/kg. Questi livelli sono al di sotto del limite normativo (1 mg/kg), ma è necessario un programma di monitoraggio per la sicurezza dei consumatori. 19
Diversi studi hanno esaminato i livelli di melamina nelle formule per lattanti iraniane. Circa il 65% dei campioni conteneva melamina, con una media di 0,73 mg/kg e un massimo di 3,63 mg/kg. Un altro studio ha riportato che il livello di melamina nelle formule per lattanti variava da 0,35 a 3,40 μg/kg, con una media di 1,38 μg/kg. Nel complesso, la presenza e il livello di melamina nelle formule per lattanti iraniane sono stati valutati in vari studi, con alcuni campioni contenenti melamina che superavano il limite massimo stabilito dalle autorità di regolamentazione (2,5 mg/kg/dose).
Considerando l'enorme consumo diretto e indiretto di latte in polvere nell'industria alimentare e la particolare importanza del latte artificiale nell'alimentazione infantile, questo studio si è proposto di validare un metodo di rilevamento della melammina nel latte in polvere e nel latte artificiale. In particolare, il primo obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un metodo quantitativo rapido, semplice e accurato per rilevare l'adulterazione con melammina nel latte artificiale e nel latte in polvere utilizzando la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e la rilevazione ultravioletta (UV); in secondo luogo, l'obiettivo di questo studio è stato quello di determinare il contenuto di melammina nel latte artificiale e nel latte in polvere venduti sul mercato iraniano.
Gli strumenti utilizzati per l'analisi della melammina variano a seconda del luogo di produzione alimentare. Per misurare i residui di melammina nel latte e nel latte artificiale è stato utilizzato un metodo di analisi HPLC-UV sensibile e affidabile. I prodotti lattiero-caseari contengono diverse proteine ​​e grassi che possono interferire con la misurazione della melammina. Pertanto, come notato da Sun et al. 22, è necessaria una strategia di purificazione appropriata ed efficace prima dell'analisi strumentale. In questo studio, abbiamo utilizzato filtri a siringa monouso. In questo studio, abbiamo utilizzato una colonna C18 per separare la melammina nel latte artificiale e nel latte in polvere. La Figura 1 mostra il cromatogramma per la rilevazione della melammina. Inoltre, il recupero dei campioni contenenti 0,1–1,2 mg/kg di melammina variava dal 95% al ​​109%, l'equazione di regressione era y = 1,2487x − 0,005 (r = 0,9925) e i valori della deviazione standard relativa (RSD) variavano dallo 0,8 al 2%. I dati disponibili indicano che il metodo è affidabile nell'intervallo di concentrazione studiato (Tabella 1). Il limite di rilevabilità (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) strumentali della melammina erano rispettivamente di 1 μg mL−1 e 3 μg mL−1. Inoltre, lo spettro UV della melammina ha mostrato una banda di assorbimento a 242 nm. Il metodo di rilevamento è sensibile, affidabile e accurato. Questo metodo può essere utilizzato per la determinazione di routine del livello di melammina.
Risultati simili sono stati pubblicati da diversi autori. È stato sviluppato un metodo di cromatografia liquida ad alte prestazioni con rivelatore a diodi (HPLC) per l'analisi della melammina nei prodotti lattiero-caseari. I limiti inferiori di quantificazione erano 340 μg kg−1 per il latte in polvere e 280 μg kg−1 per il latte artificiale a 240 nm. Filazzi et al. (2012) hanno riportato che la melammina non è stata rilevata nel latte artificiale mediante HPLC. Tuttavia, l'8% dei campioni di latte in polvere conteneva melammina a un livello di 0,505–0,86 mg/kg. Tittlemiet et al.23 hanno condotto uno studio simile e hanno determinato il contenuto di melammina nel latte artificiale (numero di campioni: 72) mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni-spettrometria di massa/MS (HPLC-MS/MS) pari a circa 0,0431–0,346 mg kg−1. In uno studio condotto da Venkatasamy et al. Nel 2010, un approccio di chimica verde (senza acetonitrile) e la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC) sono stati utilizzati per stimare la melammina nel latte artificiale e nel latte. L'intervallo di concentrazione del campione era compreso tra 1,0 e 80 g/mL e la risposta era lineare (r > 0,999). Il metodo ha mostrato recuperi compresi tra 97,2 e 101,2 nell'intervallo di concentrazione di 5-40 g/mL e la riproducibilità era inferiore all'1,0% di deviazione standard relativa. Inoltre, il LOD e il LOQ osservati erano rispettivamente di 0,1 g mL−1 e 0,2 g mL−124. Lutter et al. (2011) hanno determinato la contaminazione da melammina nel latte vaccino e nel latte artificiale a base di latte utilizzando HPLC-UV. Le concentrazioni di melammina variavano da < 0,2 a 2,52 mg kg−1. L'intervallo dinamico lineare del metodo HPLC-UV era compreso tra 0,05 e 2,5 mg kg−1 per il latte vaccino, tra 0,13 e 6,25 mg kg−1 per il latte artificiale con una frazione di massa proteica <15% e tra 0,25 e 12,5 mg kg−1 per il latte artificiale con una frazione di massa proteica del 15%. I risultati LOD (e LOQ) erano 0,03 mg kg−1 (0,09 mg kg−1) per il latte vaccino, 0,06 mg kg−1 (0,18 mg kg−1) per il latte artificiale con <15% di proteine ​​e 0,12 mg kg−1 (0,36 mg kg−1) per il latte artificiale con 15% di proteine, con un rapporto segnale/rumore di 3 e 1025 rispettivamente per LOD e LOQ. Diebes et al. (2012) hanno analizzato i livelli di melamina in campioni di latte artificiale e latte in polvere utilizzando HPLC/DMD. Nel latte artificiale, i livelli più bassi e più alti erano rispettivamente di 9,49 mg kg−1 e 258 mg kg−1. Il limite di rilevabilità (LOD) era di 0,05 mg kg−1.
Javaid et al. hanno riportato che i residui di melamina nel latte artificiale erano compresi tra 0,002 e 2 mg kg−1 mediante spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FT-MIR) (LOD = 1 mg kg−1; LOQ = 3,5 mg kg−1). Rezai et al.27 hanno proposto un metodo HPLC-DDA (λ = 220 nm) per stimare la melamina e hanno ottenuto un LOQ di 0,08 μg mL−1 per il latte in polvere, che era inferiore al livello ottenuto in questo studio. Sun et al. hanno sviluppato un RP-HPLC-DAD per il rilevamento della melamina nel latte liquido mediante estrazione in fase solida (SPE). Hanno ottenuto un LOD e un LOQ rispettivamente di 18 e 60 μg kg−128, che è più sensibile dello studio attuale. Montesano et al. ha confermato l'efficacia del metodo HPLC-DMD per la valutazione del contenuto di melammina negli integratori proteici con un limite di quantificazione di 0,05–3 mg/kg, che era meno sensibile del metodo utilizzato in questo studio29.
Indubbiamente, i laboratori di analisi svolgono un ruolo importante nella protezione dell'ambiente monitorando gli inquinanti in vari campioni. Tuttavia, l'uso di un gran numero di reagenti e solventi durante l'analisi può comportare la formazione di residui pericolosi. Pertanto, la chimica analitica verde (GAC) è stata sviluppata nel 2000 per ridurre o eliminare gli effetti negativi delle procedure analitiche sugli operatori e sull'ambiente26. I metodi tradizionali di rilevamento della melammina, tra cui cromatografia, elettroforesi, elettroforesi capillare e test immunoenzimatico (ELISA), sono stati utilizzati per identificare la melammina. Tuttavia, tra i numerosi metodi di rilevamento, i sensori elettrochimici hanno attirato molta attenzione grazie alla loro eccellente sensibilità, selettività, rapidità di analisi e facilità d'uso30,31. La nanotecnologia verde utilizza percorsi biologici per sintetizzare nanomateriali, che possono ridurre la produzione di rifiuti pericolosi e il consumo di energia, promuovendo così l'implementazione di pratiche sostenibili. I nanocompositi, ad esempio, realizzati con materiali ecocompatibili, possono essere utilizzati nei biosensori per rilevare sostanze come la melammina32,33,34.
Lo studio dimostra che la microestrazione in fase solida (SPME) viene utilizzata efficacemente grazie alla sua maggiore efficienza energetica e sostenibilità rispetto ai metodi di estrazione tradizionali. La compatibilità ambientale e l'efficienza energetica della SPME la rendono un'ottima alternativa ai metodi di estrazione tradizionali in chimica analitica e forniscono un metodo più sostenibile ed efficiente per la preparazione dei campioni35.
Nel 2013, Wu et al. hanno sviluppato un biosensore a risonanza plasmonica di superficie (mini-SPR) altamente sensibile e selettivo che utilizza l'accoppiamento tra melammina e anticorpi anti-melammina per rilevare rapidamente la melammina nel latte artificiale per neonati mediante un test immunologico. Il biosensore SPR combinato con un test immunologico (utilizzando albumina sierica bovina coniugata con melammina) è una tecnologia facile da usare e a basso costo con un limite di rilevamento di soli 0,02 μg mL-136.
Nasiri e Abbasian hanno utilizzato un sensore portatile ad alto potenziale in combinazione con compositi di ossido di grafene-chitosano (GOCS) per rilevare la melammina in campioni commerciali37. Questo metodo ha mostrato selettività, accuratezza e risposta ultra-elevate. Il sensore GOCS ha dimostrato una notevole sensibilità (239,1 μM−1), un intervallo lineare da 0,01 a 200 μM, una costante di affinità di 1,73 × 104 e un LOD fino a 10 nM. Inoltre, uno studio condotto da Chandrasekhar et al. nel 2024 ha adottato un approccio ecocompatibile ed economico. Hanno utilizzato l'estratto di buccia di papaya come agente riducente per sintetizzare nanoparticelle di ossido di zinco (ZnO-NPs) con un metodo ecocompatibile. Successivamente, è stata sviluppata una tecnica di spettroscopia micro-Raman unica per la determinazione della melammina nel latte artificiale. Le nanoparticelle di ZnO derivate da scarti agricoli hanno dimostrato il loro potenziale come valido strumento diagnostico e come tecnologia affidabile ed economica per il monitoraggio e il rilevamento della melammina38.
Alizadeh et al. (2024) hanno utilizzato una piattaforma di fluorescenza a base di struttura metallo-organica (MOF) altamente sensibile per determinare la melammina nel latte in polvere. L'intervallo lineare e il limite inferiore di rilevamento del sensore, determinati utilizzando 3σ/S, erano rispettivamente di 40-396,45 nM (equivalenti a 25 μg kg−1 e 0,25 mg kg−1) e 40 nM (equivalenti a 25 μg kg−1). Questo intervallo è ben al di sotto dei livelli massimi di residui (MRL) stabiliti per l'identificazione della melammina nel latte artificiale (1 mg kg−1) e in altri campioni di alimenti/mangimi (2,5 mg kg−1). Il sensore fluorescente (terbio (Tb)@NH2-MIL-253(Al)MOF) ha dimostrato una maggiore accuratezza e una capacità di misurazione più precisa rispetto all'HPLC39 nel rilevamento della melammina nel latte in polvere. I biosensori e i nanocompositi nell'ambito della chimica verde non solo migliorano le capacità di rilevamento, ma riducono anche al minimo i rischi ambientali, in linea con i principi dello sviluppo sostenibile.
I principi della chimica verde sono stati applicati a vari metodi per la determinazione della melammina. Un approccio consiste nello sviluppo di un metodo di microestrazione in fase solida dispersiva ecocompatibile, che utilizza il polimero polare naturale β-ciclodestrina reticolato con acido citrico per l'estrazione efficiente della melammina da campioni come latte artificiale e acqua calda. Un altro metodo utilizza la reazione di Mannich per la determinazione della melammina in campioni di latte. Questo metodo è economico, ecocompatibile e altamente accurato, con un intervallo lineare di 0,1–2,5 ppm e un basso limite di rilevamento. Inoltre, è stato sviluppato un metodo economico ed ecocompatibile per la determinazione quantitativa della melammina nel latte liquido e nel latte artificiale, utilizzando la spettroscopia di trasmissione a infrarossi a trasformata di Fourier, con elevata accuratezza e limiti di rilevamento rispettivamente di 1 ppm e 3,5 ppm. Questi metodi dimostrano l'applicazione dei principi della chimica verde allo sviluppo di metodi efficienti e sostenibili per la determinazione della melammina.
Diversi studi hanno proposto metodi innovativi per il rilevamento della melammina, come l'uso dell'estrazione in fase solida e della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)43, nonché della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) rapida, che non richiede pretrattamenti complessi o reagenti a coppie ioniche, riducendo così la quantità di rifiuti chimici44. Questi metodi non solo forniscono risultati accurati per la determinazione della melammina nei prodotti lattiero-caseari, ma sono anche conformi ai principi della chimica verde, minimizzando l'uso di sostanze chimiche pericolose e riducendo l'impatto ambientale complessivo del processo analitico.
Quaranta campioni di diverse marche sono stati analizzati in triplice copia e i risultati sono presentati nella Tabella 2. I livelli di melamina nei campioni di latte artificiale e latte in polvere variavano rispettivamente da 0,001 a 0,004 mg/kg e da 0,001 a 0,095 mg/kg. Non sono state osservate variazioni significative tra i tre gruppi di età del latte artificiale. Inoltre, la melamina è stata rilevata nell'80% del latte in polvere, mentre il 65% dei campioni di latte artificiale risultava contaminato da melamina.
Il contenuto di melammina nel latte in polvere industriale era superiore a quello del latte artificiale per neonati, e la differenza era significativa (p<0,05) (Figura 2).
I risultati ottenuti sono risultati inferiori ai limiti stabiliti dalla FDA (inferiori a 1 e 2,5 mg/kg). Inoltre, i risultati sono in linea con i limiti stabiliti dalla CAC (2010) e dall'UE45,46, ovvero il limite massimo consentito è di 1 mg kg-1 per il latte artificiale e di 2,5 mg kg-1 per i prodotti lattiero-caseari.
Secondo uno studio del 2023 di Ghanati et al.47, il contenuto di melammina in diversi tipi di latte confezionato in Iran variava da 50,7 a 790 μg kg−1. I loro risultati erano al di sotto del limite consentito dalla FDA. I nostri risultati sono inferiori a quelli di Shoder et al.48 e Rima et al.49. Shoder et al. (2010) hanno riscontrato che i livelli di melammina nel latte in polvere (n=49) determinati mediante ELISA variavano da 0,5 a 5,5 mg/kg. Rima et al. hanno analizzato i residui di melammina nel latte in polvere mediante spettrofotometria di fluorescenza e hanno riscontrato che il contenuto di melammina nel latte in polvere era compreso tra 0,72 e 5,76 mg/kg. Uno studio è stato condotto in Canada nel 2011 per monitorare i livelli di melammina nel latte artificiale per neonati (n=94) utilizzando la cromatografia liquida (LC/MS). Le concentrazioni di melammina sono risultate inferiori al limite accettabile (standard preliminare: 0,5 mg kg−1). È improbabile che i livelli fraudolenti di melammina rilevati siano stati una tattica utilizzata per aumentare il contenuto proteico. Tuttavia, ciò non può essere spiegato dall'uso di fertilizzanti, dallo spostamento del contenuto dei contenitori o da fattori simili. Inoltre, la fonte della melammina nel latte in polvere importato in Canada non è stata dichiarata50.
Hassani et al. hanno misurato il contenuto di melammina nel latte in polvere e nel latte liquido nel mercato iraniano nel 2013 e hanno trovato risultati simili. I risultati hanno mostrato che, ad eccezione di una marca di latte in polvere e latte liquido, tutti gli altri campioni erano contaminati da melammina, con livelli compresi tra 1,50 e 30,32 μg g−1 nel latte in polvere e tra 0,11 e 1,48 μg ml−1 nel latte. In particolare, l'acido cianurico non è stato rilevato in nessuno dei campioni, riducendo la possibilità di avvelenamento da melammina per i consumatori. 51 Studi precedenti hanno valutato la concentrazione di melammina nei prodotti al cioccolato contenenti latte in polvere. Circa il 94% dei campioni importati e il 77% dei campioni iraniani contenevano melammina. I livelli di melammina nei campioni importati variavano da 0,032 a 2,692 mg/kg, mentre quelli nei campioni iraniani variavano da 0,013 a 2,600 mg/kg. Complessivamente, la melamina è stata rilevata nell'85% dei campioni, ma solo una marca specifica presentava livelli superiori al limite consentito.44 Tittlemier et al. hanno riportato livelli di melamina nel latte in polvere compresi tra 0,00528 e 0,0122 mg/kg.
La Tabella 3 riassume i risultati della valutazione del rischio per i tre gruppi di età. Il rischio è risultato inferiore a 1 in tutti i gruppi di età. Pertanto, non sussiste alcun rischio per la salute non cancerogeno derivante dalla melamina presente nel latte artificiale.
Livelli più bassi di contaminazione nei prodotti lattiero-caseari possono essere dovuti a contaminazioni involontarie durante la preparazione, mentre livelli più elevati possono essere dovuti ad aggiunte intenzionali. Inoltre, il rischio complessivo per la salute umana derivante dal consumo di prodotti lattiero-caseari con bassi livelli di melammina è considerato basso. Si può concludere che il consumo di prodotti contenenti livelli così bassi di melammina non comporta alcun rischio per la salute dei consumatori52.
Considerata l'importanza della gestione della sicurezza alimentare nell'industria lattiero-casearia, soprattutto in termini di tutela della salute pubblica, è fondamentale sviluppare e validare un metodo per valutare e confrontare i livelli e i residui di melammina nel latte in polvere e nel latte artificiale. È stato sviluppato un metodo spettrofotometrico HPLC-UV semplice e accurato per la determinazione della melammina nel latte artificiale e nel latte in polvere. Il metodo è stato validato per garantirne l'affidabilità e l'accuratezza. I limiti di rilevamento e quantificazione del metodo si sono dimostrati sufficientemente sensibili per misurare i livelli di melammina nel latte artificiale e nel latte in polvere. Secondo i nostri dati, la melammina è stata rilevata nella maggior parte dei campioni iraniani. Tutti i livelli di melammina rilevati erano inferiori ai limiti massimi consentiti stabiliti dalla CAC, indicando che il consumo di questi tipi di prodotti lattiero-caseari non rappresenta un rischio per la salute umana.
Tutti i reagenti chimici utilizzati erano di grado analitico: melammina (2,4,6-triamino-1,3,5-triazina) pura al 99% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); acetonitrile di grado HPLC (Merck, Darmstadt, Germania); acqua ultrapura (Millipore, Morfheim, Francia). Filtri a siringa monouso (Chromafil Xtra PVDF-45/25, porosità 0,45 μm, diametro della membrana 25 mm) (Macherey-Nagel, Düren, Germania).
Per la preparazione dei campioni sono stati utilizzati un bagno a ultrasuoni (Elma, Germania), una centrifuga (Beckman Coulter, Krefeld, Germania) e un sistema HPLC (KNAUER, Germania).
È stato utilizzato un cromatografo liquido ad alte prestazioni (HPLC) (KNAUER, Germania) dotato di un rivelatore UV. Le condizioni di analisi HPLC erano le seguenti: è stato utilizzato un sistema UHPLC Ultimate dotato di una colonna analitica ODS-3 C18 (4,6 mm × 250 mm, dimensione delle particelle 5 μm) (MZ, Germania). L'eluente HPLC (fase mobile) era una miscela TFA/metanolo (450:50 mL) con una portata di 1 mL min-1. La lunghezza d'onda di rilevamento era di 242 nm. Il volume di iniezione era di 100 μL, la temperatura della colonna era di 20 °C. Poiché il tempo di ritenzione del farmaco è lungo (15 minuti), l'iniezione successiva doveva essere effettuata dopo 25 minuti. La melammina è stata identificata confrontando il tempo di ritenzione e il picco dello spettro UV di standard di melammina.
Una soluzione standard di melammina (10 μg/mL) è stata preparata utilizzando acqua e conservata in frigorifero (4 °C) al riparo dalla luce. La soluzione madre è stata diluita con la fase mobile e sono state preparate le soluzioni standard di lavoro. Ciascuna soluzione standard è stata iniettata nell'HPLC 7 volte. L'equazione di calibrazione 10 è stata calcolata mediante analisi di regressione dell'area del picco determinata e della concentrazione determinata.
Campioni di latte vaccino in polvere disponibili in commercio (20 campioni) e campioni di diverse marche di latte artificiale per neonati a base di latte vaccino (20 campioni) sono stati acquistati da supermercati e farmacie locali in Iran per l'alimentazione di neonati di diverse fasce d'età (0-6 mesi, 6-12 mesi e >12 mesi) e conservati a temperatura refrigerata (4 °C) fino all'analisi. Successivamente, 1 ± 0,01 g di latte vaccino in polvere omogeneizzato è stato pesato e miscelato con acetonitrile:acqua (50:50, v/v; 5 mL). La miscela è stata agitata per 1 minuto, quindi sonicata in un bagno a ultrasuoni per 30 minuti e infine agitata per 1 minuto. La miscela è stata quindi centrifugata a 9000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente e il surnatante è stato filtrato in una fiala per autocampionatore da 2 ml utilizzando un filtro a siringa da 0,45 μm. Il filtrato (250 μl) è stato quindi miscelato con acqua (750 μl) e iniettato nel sistema HPLC10,42.
Per convalidare il metodo, abbiamo determinato il recupero, l'accuratezza, il limite di rilevabilità (LOD), il limite di quantificazione (LOQ) e la precisione in condizioni ottimali. Il LOD è stato definito come il contenuto del campione con un'altezza del picco pari a tre volte il livello di rumore di fondo. D'altra parte, il contenuto del campione con un'altezza del picco pari a 10 volte il rapporto segnale/rumore è stato definito come LOQ.
La risposta del dispositivo è stata determinata utilizzando una curva di calibrazione composta da sette punti dati. Sono stati utilizzati diversi contenuti di melammina (0, 0,2, 0,3, 0,5, 0,8, 1 e 1,2). È stata determinata la linearità della procedura di calcolo della melammina. Inoltre, sono stati aggiunti diversi livelli di melammina ai campioni di controllo. La curva di calibrazione è stata costruita iniettando continuamente 0,1–1,2 μg mL−1 di una soluzione standard di melammina in campioni di latte artificiale e latte in polvere e il suo R2 = 0,9925. L'accuratezza è stata valutata mediante la ripetibilità e la riproducibilità della procedura ed è stata ottenuta iniettando i campioni il primo giorno e tre giorni successivi (in triplicato). La ripetibilità del metodo è stata valutata calcolando la RSD % per tre diverse concentrazioni di melammina aggiunta. Sono stati eseguiti studi di recupero per determinare la precisione. Il grado di recupero mediante il metodo di estrazione è stato calcolato a tre livelli di concentrazione di melammina (0,1, 1,2, 2) in campioni di latte artificiale e latte in polvere9,11,15.
L'assunzione giornaliera stimata (EDI) è stata determinata utilizzando la seguente formula: EDI = Ci × Cc/BW.
Dove Ci rappresenta il contenuto medio di melammina, Cc il consumo di latte e BW il peso medio dei bambini.
L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando SPSS 24. La normalità è stata verificata mediante il test di Kolmogorov-Smirnov; tutti i dati erano test non parametrici (p = 0). Pertanto, sono stati utilizzati il ​​test di Kruskal-Wallis e il test di Mann-Whitney per determinare le differenze significative tra i gruppi.
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